Introduction
Jäst proteinopathy modeller har utvecklats för protein misfolding sjukdomar inklusive amyotrofisk lateralskleros (ALS) och Parkinsons sjukdom (PD) 1-3. Uttrycket av proteinerna TDP-43 och FUS, som misfold i ALS-patienter, är giftiga och mislocalize att bilda cytoplasmiska aggregat i jäst 1,2. På liknande sätt uttrycket av α-synuklein (α-syn), som är inblandad i PD, är giftig och mislocalizes att bilda cytoplasmiska aggregat i jäst 3. Dessa funktioner rekapitulera fenotyper hos patienter med dessa sjukdomar 4,5. Således, jäst modeller ger en användbar plattform för screening för proteiner eller små molekyler som hindrar eller vända dessa fenotyper 2,6-13. Vi är intresserade av utvecklingen av proteiner som kan vända aggregering och toxicitet på grund av TDP-43, FUS, och α-syn. Vi fokuserar på Hsp104, ett AAA + protein från jäst som är unikt kapabel att disaggregerar proteiner både frOM amorfa aggregat och amyloid i jäst, men det har ingen mänsklig homolog 14,15. Hsp104 är finstämt för att dela upp endogena jäst prioner och har endast begränsad möjlighet att dela upp substrat inblandade i mänskliga neurodegenerativa sjukdomar, som det aldrig normalt stöter 16,17. Därför strävar vi efter att konstruera förbättrade versioner av Hsp104 som kan efficaciously dela upp dessa mänskliga substrat. För att göra det, vi bygger stora bibliotek av Hsp104 varianter använder felbenägen PCR; dessa bibliotek kan screenas med hjälp av jäst proteinopathy modellerna 17. Vi har antagit ett domän målinriktad strategi för att konstruera och screena bibliotek, eftersom Hsp104 är mycket stor 17. Vi fokuserade inledningsvis på mitten domän (MD) av Hsp104 17, även om liknande metoder kan användas för att screena andra domäner. Dessa modeller möjliggör screening för disaggregase aktivitet direkt, till skillnad från alternativa tekniker såsom yta display, som är restenricted att använda för att övervaka bindning 18.
Vår Protokollet är baserat på två screeningsteg (figur 1). Först är Hsp104 varianter som hämmar toxicitet av sjukdomen substratet i jäst vald. För att göra detta, varianter av Hsp104 och sjukdomsassocierade substrat samtrans i Δ hsp104 jäst. Vi använder Δ hsp104 jäst att utforska Hsp104 sekvens utrymme i frånvaro av vildtyp (WT) Hsp104 17. Viktigt är radering av Hsp104 inte påverka α-syn, FUS eller TDP-43 toxicitet i jäst, och uttryck av Hsp104 WT ger minimal räddning 1,13,17. Jästen plattströks sedan på inducerande media för att inducera expression av båda proteinerna. Jäst härbärge Hsp104 varianter som hämmar toxicitet sjukdomsassocierade substrat confer tillväxten av kolonin. Dessa varianter väljs för vidare analys, medan kolonier bibehålla varianter som inte hämmar toxicitet dö. Emellertidfalska positiva är ett betydande problem i den här skärmen. Uttryck av TDP-43, FUS, och α-syn är mycket giftiga, vilket skapar en stark selektivt tryck för uppkomsten av spontana genetiska suppressorer toxicitets orelaterade till Hsp104 varianten uttrycks. Därför har vi använt en sekundär skärm som också är relativt hög genomströmning för att eliminera dessa ospecifika toxicitetstryckare 17. I denna sekundära skärm, väljs jäst behandlades med 5-Fluorootic Acid (5-FOA) för att motverka välja för Hsp104 plasmiden 19. Stammarna bedöms sedan för substrat (TDP-43, FUS, eller α-syn) toxicitet via spotting-analys för att säkerställa att toxiciteten av substratet återställs efter förlust av Hsp104 plasmiden. Sålunda jäst i vilken toxicitet är återställd i denna sekundära skärm förmodligen ursprungligen toxicitet undertryckande på grund av närvaron av den Hsp104 varianten. Dessa jäst betecknas som "hits" och Hsp104 plasmiden bör då varautvanns och sekvenseras för att identifiera mutationer i Hsp104 genen 17 (Figur 1). Eventuella träffar bör därefter bekräftades genom att konstruera mutationen självständigt med användning av ställesriktad mutagenes och sedan testa om för toxicitet suppression. De potentiella tillämpningar för detta protokoll är breda. Med användning av dessa metoder, kan bibliotek av någon typ av protein screenas för varianter som hämmar toxicitet av någon substrat-protein som är toxiskt i jäst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bibliotek Generation
- För att konstruera bibliotek av Hsp104 använder domänspecifika felbenägen PCR, först förstärka området av intresse med ett fel benägna DNA-polymeras 20.
- Rena PCR-produkten genom gel-extraktion.
- Utför en megaprimer förlängningssteg med en vanlig riktad mutagenes protokoll: kombinera 50 ng mall plasmid, 250 ng megaprimer, 200 ^ M dNTP, och high-fidelity DNA-polymeras i PCR-buffert, och späd till 50 ul total volym med PCR-kvalitet vatten 20 . Köra en standard PCR-program.
OBS: Specifika primrar som användes kommer att variera baserat på den särskilda regionen av genen som skall amplifieras.- Efter PCR, smälta föräldra mall-DNA med 1 | j, l Dpnl restriktionsenzym under 2 timmar vid 37 ° C.
- Omvandla biblioteket genom elektroporering eller andra medel i ultracompetent E. coli och rena det genom miniprep.
OBS: Bibliotek generationvarierar kraftigt baserat på målen för ett givet experiment. Hsp104 är ett mycket stort protein, så det är opraktiskt att randomisera hela genen, vilket är anledningen till att vi utnyttjar domänspecifika felbenägen PCR. Dessutom förblir struktur Hsp104 dåligt kända, vilket gör utformningen av riktade bibliotek utmanande 21. Bibliotek kan konstrueras med användning av riktade eller slumpmässiga tillvägagångssätt för mutagenes, med det enda förbehållet att den mall plasmidskelettet bör innehålla URA3-genen för att möjliggöra 5-FOA räknare selektion på dextros medier.
2. Transformation av Hsp104 Bibliotek
- Integrera sjukdomsassocierade substrat till W303aΔ hsp104 jäst med en vanlig litiumacetat / PEG transformations protokoll 22. Välj enstaka kolonier och skärma dem med avseende på toxicitet för att isolera en stam med hög toxicitet av sjukdom associerad substratet 23.
OBS: Använd en integrerad stam och isolate en enda koloni för att säkerställa lika uttryck i alla celler. Klona sjukdomen substratet i en plasmid som tillåter integration av genen enligt något annat än uracil markör (vi använder histidin) och Hsp104 biblioteket i pAG416GAL plasmiden (uracil markör) 24. För att möjliggöra för 5-FOA counterselection, se till att biblioteket uttrycks från en plasmid med uracil markör. Andra jäststammar kan också användas. Vi har noterat en liknande toxicitets dämpning fenotyp med hjälp W303a och BY4741 jäststammar i både WT och Δ hsp104 bakgrunder (mej och JS, opublicerade observationer). - Förvandla Hsp104 biblioteket till denna stam med användning av samma litiumacetat / PEG transformations protokoll 22. Skala upp omvandlingen lämpligt att bibehålla den sekvens utrymme av biblioteket och för att bevara den förutsagda bibliotekets storlek.
- Plate transformations blandningen på noninducing, selektiva plattor (t.ex. SD-His-Ura) med tillräckligt många plattor tillsäkerställa tillväxt av ett stort antal kolonier. Använd stora petriskålar (150 mm) för att minimera det antal plattor som krävs. Återställa transformanter med hjälp av plattor gör omvandlingseffektiviteten skall bedömas.
- Trans Hsp104 WT och vektor negativa kontroller parallellt.
3. Screening för bekämpande av Proteotoxicity
- Tvätta kolonierna utanför plattorna med hjälp raffinos kompletterad bortfall medier (t.ex. sraff-His-Ura). Använd en serologisk pipett och sterila trä applikatorer för att lossa kolonierna från plattorna. Överför vätskan tvättar till ett 50 ml koniskt rör och skaka ordentligt för att separera eventuella klumpar av celler. Späd till en något grumlig kultur, OD 600 ~ 0,025.
OBS: Här raffinos tjänar till att lindra cellerna i glukos-medierad repression av induktion, vilket priming cellerna för galaktos-medierad induktion. - Odla den utspädda kulturen över natten i raffinos dropout media med skakning vid 30 ºC. Odla Hsp104 WT och vektorkontroll parallellt.
- Följande morgon, plätera ett intervall av koncentrationer på individuella galaktos (t.ex. SGal-His-Ura) plattor (1 | il till 2 ml koncentrerad kultur i 400 | il total volym). Plätering av ett brett intervall av koncentrationer kommer att säkerställa att en platta kommer att ha enskilda kolonier. Den faktiska koncentrationen som krävs beror på toxiciteten av sjukdomen substratet av intresse.
- Normalisera vektorn och Hsp104 WT kulturer till OD 600 av biblioteket och plattan lika stora volymer för att jämföra tillväxten av biblioteket i förhållande till kontrollerna.
- För att bedöma valet stringens, plåt biblioteket på glukos (trycka) media. Inkubera plattorna under 2-3 dagar vid 30 ºC, tills kolonier visas (Figur 2). Bedöma de resulterande kolonierna och jämför med kontrollerna.
OBS: Ofta både stora och små kolonier erhålles, men ingen korrelation mellan kolonistorlek och ageraivity observeras. Screen dessa potentiella hits med hjälp av en 5-FOA disk selektionsteknik (steg 4) för att minimera falska positiva som överförts till sekvensering.
4. 5-FOA Counterselection och Spotting för att eliminera falska positiva
- Streak ut enstaka kolonier i två exemplar på dubbel och singel dropout media (t.ex. SD-His-Ura och SD-Hans plattor) och växa över natten vid 30 ºC. Upprepa med vektor och Hsp104 WT kontroller. Utstrykning på SD-His före 5-FOA ökar effektiviteten av 5-FOA steg genom att öka sannolikheten för att cellerna kommer att ha förlorat det Hsp104 plasmid när de ströks ut på 5-FOA.
- För att förhindra att plattorna torkar ut, linda SD-His-Ura plattor i parafilm och förvara vid 4 ºC medan du utför den 5-FOA skärmen. Dessa plattor kommer så småningom att användas för sekvensering.
- Streak kolonierna från SD-Hans plattor till enstaka kolonier på 5-FOA-plattor (YPD medium + 1g / L 5-FOA) och inkubera under 1-2 dagar vid 30 &# 186; C tills enstaka kolonier visas. Här är 5-FOA omvandlas till en toxisk produkt (5-fluordeoxiuridin) i celler som innehåller URA3-genen. Således kommer alla celler som fortfarande härbärgerar Hsp104 plasmiden dör.
- Streak de enskilda kolonier från 5-FOA-plattor i duplikat på SD-Ura och SD-Hans plattor. Test 3 kolonier för varje träff för att öka sannolikheten för att åtminstone en koloni för varje träff kommer att ha förlorat den Hsp104 plasmiden. Inkubera under 1-2 dagar vid 30 ° C. Kolonier som har förlorat Hsp104 plasmiden kommer att växa på SD-Hans plattor men inte SD-Ura plattor.
- Odla stammar som har förlorat de Hsp104 plasmider för spotting-analyser. Odla påfrestningarna till mättnad i raffinos dropout media (t.ex. sraff-His) i 96 Deepwell 2 ml plattor över natten vid 30 ° C under skakning. Var noga med att inkludera de 5-FOA behandlade kontrollstammar.
- Förbered plattor för spotting analys. Med hjälp av en multikanalpipett, portion 200 l raffmos dropout medier (t.ex. sraff-His) perbrunn i en 96-brunnsplatta, reservera kolumnerna 1 och 7 för de rena kulturer. Alikvot 250 | il av var och en av de 16 mättade kulturer i kolumner 1 och 7 av plattan.
- Seriellt utspädda kulturerna 5-faldigt i varje kolumn av plattan, blanda omsorgsfullt med en flerkanalspipett. Avlägsna 50 pl av den utspädda kulturen från kolumnerna 6 och 12 för att säkerställa att slutvolymen i varje brunn är 200 | il. Detta är viktigt för att även spotting.
- Med hjälp av en 96-bult replikatorn verktyg (Frogger), upptäcka kulturer i två exemplar på SD-Hans och SGal-Hans plattor. Inkubera plattorna vid 30 ºC i 2-3 dagar.
- Välj för sekvensering stammar som uppvisar toxicitet på SGal-Hans plattor som liknar kontrollerna. Kasta så falska positiva stammar som inte är lika giftiga som kontrollerna. 5-FOA är också ofta giftiga på egen hand, så kasta stammar som uppvisar en tillväxt defekt på SD-Hans plattor eller som uppvisar väsentligt större toxicitet än sjukdomen substrat ensamt (
5. Sekvensering av Hsp104 Varianter av Koloni-PCR
- Skrapa ~ 10 pl jäst från SD-His-Ura-plattor i 3 pl 20 mM NaOH i PCR-remsor rör och lysera cellerna genom frysning-tining. Placera remsan rör i en -80 ° C frys under 10 min eller i flytande kväve och sedan inkubera vid 99 ° C i en termocykler under 10 min. Späd stammarna till 100 | il med PCR-kvalitet vatten.
- Förbered PCR-reaktioner: 5 ul PCR-mall, 0,5 pl 100 iM varje primer, 0,5 pl 10 mM dNTP, 0,25 l DNA-polymeras i PCR-buffert, och göra upp till 25 l total volym med PCR-kvalitet vatten. Design primrar för att amplifiera den randomiserade regionen plus ca 100 bp på varje ände. Minimera storleken av den amplifierade regionen för att öka sannolikheten för framgångsrik amplifiering. Köra en standard PCR-program.
- Analysera prov genom elektrofores på agarosgel för att bekräfta amplifiering av en PCR-produkt av den lämpliga size. Upprepa PCR om ingen produkt är närvarande.
OBS: PCR fel beror oftast på något för mycket jäst som används i steg 5.1. - Bereda prover för DNA-sekvensering. Avlägsna PCR-primrar antingen genom PCR rening eller användning av en PCR-produkt cleanup reagens såsom exonukleas I och alkaliskt fosfatas från räka enzym (ExoSAP-IT) för att bryta ned enkelsträngat DNA. Detta reagens degraderar enzymatiskt oinkorporerade primers och dNTP, vilket möjliggör ökad genomströmning.
- Sekvensera PCR-produkterna. Var noga med att grundligt analysera sekvense kromatogram för mutationer. Mutationer kan observeras som en blandning av två nukleotider vid en given plats (Figur 4), jäst ofta hyser flera plasmider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har konstruerat ett bibliotek av Hsp104 varianter randomiserade mitt domän och screenas det för undertryckande av TDP-43 toxicitet. Biblioteket transformerades och utströks på glukos och galaktos-plattor (figur 2) för att bedöma den stringens av skärmen. Enstaka kolonier valdes ut och stammarna räknaren valts med 5-FOA att eliminera Hsp104 plasmiden. Dessa stammar bedömdes sedan för att bekräfta att toxiciteten berodde på TDP-43 ensamt, utan Hsp104 varianterna. Spotting analyser av en delmängd av de varianter som valts i startskärmen visade att av de 4 kolonier utvalda, 2 visade Hsp104-medierad TDP-43 toxicitet dämpning, 1 var ett falskt positivt, och 1 visade ökad toxicitet efter 5-FOA behandling (Figur 3). De 2 riktiga hits sekvenserades sedan med koloni-PCR för att identifiera de mellandomän mutationer (Figur 4). När dessa mutationer identifierades var Hsp104 mutationen true på nytt i föräldra Hsp104 plasmiden genom ställesriktad mutagenes för att bekräfta toxicitet suppression. Varianter som väljs med hjälp av dessa metoder har senare bekräftat att undertrycka aggregation i jäst, tydliga förformade aggregat i biokemiska analyser, och undertrycka dopaminerga neurodegeneration i ett C. elegans modell av PD 17.
Figur 1:. Flödesschema för att isolera potentieras Hsp104 varianter Hsp104 bibliotek (URA3 markör, GAL1 promotor) omvandlas i jäst innehåller substraten sjuka (HIS3 markör, GAL1 promotor) och screenades för toxicitets suppressors genom utbredning på inducerande media. Potentiella träffar screenas sedan igen med en 5-FOA counterselection steg för att eliminera ospecifika toxicitetsdämpare. Varianter som valts i detta andra steg sedan sekvenseras genom koloni-PCR. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52089/52089fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Screening för toxicitetsdämpare Jäst samtrans med pAG303GAL-TDP-43 och pAG416GAL-Hsp104 biblioteket ströks ut på glukos (undertryckande) eller galaktos (inducerar) media. TDP-43 är mycket giftigt, så mycket få Hsp104 varianter är i stånd att undertrycka denna toxicitet, och den här skärmen är mycket stränga. Enstaka kolonier selekteras som träffar från galaktos plåten för 5-FOA sekundära skärm. Både stora och små kolonier erhålles typiskt, men vi har inte observerat några trender som dikterar hur kolonistorlek korrelerar med aktivitet.
s.jpg "/>
Figur 3:. 5-FOA sekundär skärm Jäst behandlades med 5-FOA att motverka välja för Hsp104 plasmiden bedömdes genom observation analys. Stammar odlades i sraff-Hans media, seriespäddes 5 gånger, och fläckig i två exemplar på SD-Hans och SGal-Hans plattor. Hsp104 A503V är en riktig hit som vi tidigare har verifierats och visa här som en kontroll tillsammans med enbart 17-vektor. Raderna 3 och 4 är biblioteks träffar som bibehåller TDP-43 toxicitet till följd av förlust av Hsp104 suppressor. Rad 5 visar ett falskt positivt, där TDP-43 är inte längre giftigt, så en ospecifik toxicitet suppressor är närvarande. Rad 6 visar en stam som är mer toxisk än TDP-43 typiskt är, möjligen beroende på 5-FOA toxicitet. Denna stam kan fortfarande sekvens men får inte vara en giltig träff.
Figur 4. Analyzing sekvenseringsresultaten. Selected jäst innehåller ofta flera plasmider. Därför efter sekvensering av koloni PCR-produkterna, man måste vara uppmärksam för att se eventuella mutationer inte förbises i kromatogrammen. I detta kromatogram, kan två potentiella mutationer (betecknas med *) förbises. I det första fallet, det är en blandning av A och T och i den andra, en blandning av T och C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi vårt sätt att isolera potentieras Hsp104 varianter som hämmar toxiciteten av sjukdomsassocierade substrat med hjälp av jäst proteinopathy modeller. Med hjälp av denna metod kan stora bibliotek av varianter screenas med hög genomströmning, med den enda begränsningen är antalet varianter som passerar 5-FOA sekundär skärm. Genom att utföra dessa steg i 96 bra format, vi rutinmässigt screena upp till 200 träffar i taget i 5-FOA steg under loppet av 1-2 veckor. Antalet träffar som erhållits under den inledande granskningen steget kommer att variera i hög grad beroende på substrat toxicitet och makeup av varje enskilt bibliotek. När sekvense hits, är det viktigt att noggrant analysera alla sekvense kromatogram sedan blandningar av plasmider är typiskt närvarande i varje cell.
Vi har ibland noterat en stor andel av Hsp104 WT isoleras som "hits". Detta beror sannolikt på grund av närvaron av spontana genetiskadämpare eller mycket svag aktivitet. För att kringgå detta problem, har vi funnit att screening vid förhöjda temperaturer (t.ex. 34 ° C) kan minska andelen "hits" som är Hsp104 WT. Det är också viktigt att på nytt klon några sekvense hits att självständigt bedöma aktiviteten hos eventuella nya varianter och säkerställa plasmid renhet. När nya hits har identifierats, kan de bedömas för undertryckande av aggregering i jäst och karakteriseras biokemiskt.
Vi har använt dessa metoder för att isolera förstärkas Hsp104 varianter mot TDP-43, FUS, och α-synuklein och kontrollerade deras aktivitet med ren proteinbiokemi analyser 17. I förlängningen kan dessa metoder användas för att screena proteinbibliotek mot vilket substrat som helst av intresse som är toxisk i jäst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
| 150 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| 5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
| 96-DeepWell 2 ml Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
| 96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |
References
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).
- Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., et al. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Disease models & mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast reveal a 'druggable' Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons. Science. 342 (6161), 979-983 (2013).
- Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms. The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).
- Kim, H. J., et al. Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models. Nature. 46 (2), 152-160 (2014).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Shorter, J. Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders. Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).
- Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders. Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).
- DeSantis, M. E., et al. Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients. Cell. 151 (4), 778-793 (2012).
- Jackrel, M. E., et al. Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events. Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).
- Wittrup, K. D., Verdine, G. L. Methods in Enzymology. Wittrup, K. D., Verdine, G. L. 503, Academic Press. 13-14 (2012).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. Methods in Enzymology. 154, Academic Press. Lawrence Grossman Ray Wu. 164-175 (1987).
- Miyazaki, K. Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology. eds FrancesH Arnold & George Georgiou. 231, Humana Press. 23-28 (2003).
- Saibil, H. Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D. TDP-43 toxicity in yeast. Methods. 53 (3), 238-245 (2011).
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway® cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).
