Protocol
NOTA: i protocolli sperimentali qui descritte condotto presso l'Università del Midwest è stato approvato dal Midwestern University IACUC.
1. Requisiti di camera
- Fissare una camera procedimento che ha acqua corrente calda e fredda, e un modo per rimuovere l'acqua dal serbatoio, tipicamente uno scarico nel pavimento.
- Utilizzare un tavolo di studio su cui posizionare il serbatoio di immersione. Poiché camere con scarichi a pavimento sono tipicamente sagomati per drenaggio, ridurre tappi di gomma e metterli sotto le gambe del tavolo per garantire che il piano del tavolo, e quindi la superficie dell'acqua nel serbatoio, è di livello.
2. Diving serbatoio
- Diving serbatoio Costruzione
- Costruire una vasca rettangolare (100 x 60 x 15 cm) usando 3/4 in plexiglas spessore per la parte inferiore e 1/2 in plexiglas per le pareti laterali (Figura 1). Definitivamente collegare i fuori plexiglas pezzi del carro armato insieme con cianoacrilato cemento o solvents come il triclorometano.
- Dividere il serbatoio in 5 canali ciascuno circa 100 cm di lunghezza, utilizzando plexiglas spessore di 1/2 di pollice rimovibili tagliate a 85 x 15 cm pezzi. Permanente posizionare scanalature sul fondo e bordi della vasca in cui questi divisori di canale possono essere inserite in posizione.
- Sospendere orizzontali pezzi di plexiglas dai divisori di canale per creare un "tetto" per un tuffo tunnel sottomarino ".
- In un angolo del luogo serbatoio di una piattaforma rialzata rimovibile, la "zona d'arrivo", per i ratti per trasportare fuori dall'acqua e di riposo tra le prove di nuoto e le immersioni. I ratti di solito pulirsi e rimuovere l'acqua dal loro pelliccia, mentre in zona arrivo. Inserire lati alti intorno ai bordi della zona di arrivo per assicurare i ratti rimangono sulla piattaforma tra processi di formazione.
- All'angolo opposto del carro armato dalla zona arrivo posizionare una camera che permette solo l'accesso subacqueo allo labirinto. Questa rimovibile "avviare unarea "è usato solo per le prove di immersione.
NOTA: All'inizio di un processo di immersione un ratto viene calato in acqua, mentre seduto su una piattaforma all'interno della camera di inizio; quindi questa piattaforma si chiama "ascensore".
NOTA: Utilizzare un design modulare, in cui la zona di partenza, traguardo, e tutti i canali divisori sono removibili dal serbatoio. Questo viene fatto per due ragioni: 1) per facilitare il riempimento e lo svuotamento del serbatoio con acqua dopo la rimozione di tutti i divisori di canale, e 2) se un ratto viene disorientato, specialmente sott'acqua, i pezzi possono essere rapidamente smontate per salvare il ratto dal acqua.
- Riempimento e svuotamento del serbatoio con acqua
- Riempire il serbatoio con acqua
- All'inizio di ogni sessione di allenamento, riempire il serbatoio con fresco 32 ° C l'acqua di rubinetto a una profondità di circa 12 cm. Mescolare l'acqua nel serbatoio di minimizzare tasche calde o fredde.
NOTA: In genere ci vogliono circa 2 ore per la formazione di 12 ratti. Durante questo periodotemperatura dell'acqua diminuisce di circa 4 ° C. Alla fine della sessione di formazione l'acqua si raffredda a circa 28 ° C. Dal 30 ° C l'acqua è thermoneutral ai ratti, utilizzando l'acqua calda, invece di acqua a temperatura ambiente, ridurrà al minimo la perdita di calore durante l'allenamento ripetitivo.
- All'inizio di ogni sessione di allenamento, riempire il serbatoio con fresco 32 ° C l'acqua di rubinetto a una profondità di circa 12 cm. Mescolare l'acqua nel serbatoio di minimizzare tasche calde o fredde.
- Svuotare il serbatoio con acqua
- Al termine di ogni sessione di allenamento, scaricare l'acqua dalla vasca utilizzando un tubo grande, come ad esempio un 4 m lungo pezzo di tubo diametro interno 1 pollice. Completamente immergere il tubo nel serbatoio, assicurando sacche d'aria sono nel tubo. Introdurre rapidamente un'estremità del tubo nel scarico a pavimento. L'effetto sifone risultante scaricare l'acqua dalla vasca.
- Mantenendo l'estremità del serbatoio del tubo sotto la superficie dell'acqua per mantenere il sifone, inclinare il serbatoio sul bordo per facilitare il drenaggio completo dell'acqua.
NOTA: In alternativa, e invece di sifonamento, installare un rubinetto vicino alla base del serbatoio e collegareun tubo dal serbatoio al rubinetto scarico a pavimento.
- Riempire il serbatoio con acqua
3. Considerazioni Rat allergeni
- Indossare guanti monouso ogni volta che la gestione e la formazione dei ratti. I guanti limitare il contatto con l'acqua nel serbatoio, che invariabilmente conterrà urine di ratto.
NOTA: I ratti saranno bagnate durante l'allenamento, e la sala sarà piena di un odore "wet-rat". Di conseguenza, un regime profilattico di antistaminici possono prevenire o limitare gli effetti delle allergie di ratto. I formatori possono anche avere bisogno di indossare maschere antipolvere usa e getta, o maschere N95, nel caso dovesse diventare sensibili agli allergeni ratto.
4. Swim Training
- Formazione nuotata quotidiana
NOTA: L'esperienza personale indica che i ratti più giovani imparano il labirinto meglio e più velocemente, e iniziando così la formazione con 35 g di ratti appena svezzati è preferibile utilizzare ratti adulti.- Riempire il serbatoio con acqua. Vedere 2.2.1.
- Finitura Inserirezona e canale divisori per creare 5 canali di nuoto.
- Durante la prima sessione di allenamento abbassare leggermente i ratti a mano in acqua circa 3-5 cm dalla zona arrivo.
NOTA: al momento della loro introduzione nel ratto d'acqua appare instabile in quanto prima incontrano la sensazione di galleggiare. I ratti si pagaia su in modo scoordinato durante il tentativo di trovare un modo per uscire l'acqua, fino a raggiungere la vicina zona d'arrivo. Grazie alla loro innata capacità di nuotare, nelle prove successive i ratti saranno nuotare in modo molto più coordinato verso la zona d'arrivo.
NOTA: Sostenere i topi da sotto così i loro piedi sono agli inquirenti mani. Abbassare delicatamente i ratti in acqua e lasciarli nuotare lontano dalla mano, invece di cadere in acqua. - Tra le prove lasciate che i topi rimangono in zona arrivo per almeno 1 min. Questo per permettere ai ratti di sposo e di esplorare, in modo che essi considerano la zona d'arrivo come un luogo "sicuro"di andare tra la prova. Questo è in contrasto afferrando un topo che ha appena completato un processo e posizionamento di nuovo in acqua per iniziare la prova successiva immediatamente.
NOTA: Non utilizzare ricompensa esterna (cioè cibo) durante la formazione, in modo da impedire l'attivazione dei circuiti di ricompensa nel cervello. - Dopo il periodo di attesa zona arrivo Premere delicatamente i ratti per 1 minuto prima di iniziare la prova successiva. Asciugare delicatamente i ratti con un asciugamano durante questa attesa delle indagini preliminari dopo l'ingresso ripetitivo in acqua farà sì che i ratti a diventare molto bagnato, e asciugandoli impedirà l'ipotermia.
- Ripetere l'operazione 4.1.3. attraverso 4.1.5. per completare 3 a 5 prove per ogni ratto da formare nel corso di una sessione di allenamento di nuoto tutti i giorni.
- Rimuovere tutti i divisori di canale e area di finire dal serbatoio.
- Svuotare l'acqua dal serbatoio. Vedere 2.2.2.
- Programma di allenamento di nuoto settimanale
- Condurre sessioni di allenamento al giorno (vedi 4.1.) 5 giorni alla settimana, idealmente allo stesso tempoogni giorno.
- Inizia la prima prova dalla distanza negoziato con successo il giorno precedente. Iniziare la seconda e terza prove da una maggiore distanza.
- Ad ogni successiva seduta di allenamento giornaliera aumentare la distanza tra dove i topi sono posti in acqua e la zona d'arrivo. Per i primi allenamenti aumentare questa distanza di 5-10 cm. Dopo i ratti sembrano più a suo agio con il nuoto, aumentare le distanze da 30-50 cm.
- Utilizzare più grandi incrementi nelle distanze di nuoto, mentre i ratti stanno imparando a nuotare un tratto rettilineo di un canale nuotata. Al contrario, imparare a nuotare tornanti tra i canali potrebbe richiedere 2-3 sessioni di allenamento.
NOTA: Spesso, durante l'attesa in zona arrivo, i ratti si ri-entrare in acqua per nuotare, e / o immergere la testa sott'acqua, mentre ancora seduto sulla piattaforma zona d'arrivo. - Ripetere questo protocollo di allenamento quotidiano oltre 3 settimane per garantire il successo di nuoto di tutto il 5 canali.Questo protocollo di allenamento ripetitivo assicura il completamento con successo del labirinto, tanto più che il labirinto comprende alternando tornanti a sinistra ea destra.
Formazione 5. Dive
NOTA: Dopo che i topi hanno imparato a negoziare con successo il nuoto attraverso il labirinto sono pronti per iniziare addestramento subacqueo.
- Allenamento iniziale (primo giorno)
- Inserire la camera di inizio. Riempire il serbatoio con acqua (vedi 2.2.1.). Assicurarsi che il livello dell'acqua è di 1 cm sotto l'apertura per la zona di partenza.
- Inserire la zona d'arrivo e divisori di canale per creare 5 canali di nuoto.
- Durante la prima sessione immersioni formano i ratti per abbassare l'ascensore in acqua all'interno della camera di inizio. L'accesso al labirinto è dal fondo della camera di inizio. Durante questa prima sessione il livello dell'acqua è sufficientemente bassa in modo che il ratto può facilmente nuotare dalla camera dall'inizio nel labirinto. Lasciare che il ratto di continuare nuoto attraverso il labirinto dila zona d'arrivo.
- Tra le prove lasciate che i topi rimangono in zona arrivo per almeno 1 min.
NOTA: Non utilizzare ricompensa esterna (cioè cibo) durante la formazione, in modo da impedire l'attivazione dei circuiti di ricompensa nel cervello. - Dopo il periodo di attesa zona arrivo Premere delicatamente i ratti per 1 minuto prima di iniziare la prova successiva. Asciugare delicatamente i ratti con un asciugamano durante questa attesa pre-processuale.
- Ripetere l'operazione 5.1.3. attraverso 5.1.5. portare a termine 3 prove per ogni ratto per essere addestrati durante questa sessione di addestramento subacqueo iniziale.
- Rimuovere tutti i divisori di canale, iniziare da camera e zona d'arrivo dal serbatoio.
- Svuotare l'acqua dal serbatoio. Vedere 2.2.2.
- Allenamento iniziale (secondo giorno)
- Inserire la camera di inizio. Riempire il serbatoio con acqua (vedi 2.2.1.). Assicurarsi che il livello dell'acqua è leggermente sopra l'apertura alla zona di partenza.
- Inserire la zona d'arrivo e divisori di canale per creare 5 canali di nuoto.
- Durante la seconda immersioneALLENAMENTO il livello dell'acqua è stata sollevata in modo da uscire dalla camera di inizio ratto deve immergere la testa sotto il bordo della camera di inizio per entrare nel labirinto. Consideriamo questo come prima immersione del ratto. Lasciare che il topo per poi continuare a nuoto attraverso il labirinto per la zona d'arrivo.
- Lasciate che i topi rimangono in zona arrivo per almeno 1 minuto tra le prove.
NOTA: Non utilizzare ricompensa esterna (cioè cibo) durante la formazione, in modo da impedire l'attivazione dei circuiti di ricompensa nel cervello. - Dopo il periodo di attesa zona arrivo Premere delicatamente i ratti per 1 minuto prima di iniziare la prova successiva. Asciugare delicatamente i ratti con un asciugamano durante questa attesa pre-processuale.
- Ripetere l'operazione 5.2.3. attraverso 5.2.5. portare a termine 3 prove per ogni ratto per essere addestrati durante questa sessione di addestramento subacqueo.
- Rimuovere tutti i divisori di canale, iniziare da camera e zona d'arrivo dal serbatoio.
- Svuotare l'acqua dal serbatoio. Vedere 2.2.2.
- Allenamento iniziale (terza giorno)
- Inserire la camera di inizio. Riempire il serbatoio con acqua (vedi 2.2.1.), Assicurando che il livello dell'acqua è sopra l'apertura alla zona di partenza.
- Inserire la zona d'arrivo e divisori di canale per creare 5 canali di nuoto. Posizionare un pezzo orizzontale plexiglas immediatamente al di fuori dell'area di partenza per creare un tunnel lungo immersioni 5 cm.
- Durante la terza sessione di addestramento subacqueo il ratto deve immergere la testa sotto il bordo della camera di inizio e di nuotare sott'acqua cinque centimetri per raggiungere il mare aperto del canale di nuoto. Lasciare che il topo per poi continuare a nuoto attraverso il labirinto per la zona d'arrivo.
NOTA: Una volta posizionato nella zona di partenza, ratti avviare la propria immersione subacquea, e, quindi, questi sono considerati immersioni "volontari". - Lasciate che i topi rimangono in zona arrivo per almeno 1 minuto tra le prove.
NOTA: Non utilizzare ricompensa esterna (cioè cibo) durante la formazione, in modo da impedire l'attivazione dei circuiti di ricompensa nel cervello. - Dopo il periodo di attesa zona arrivo Premere delicatamente i ratti per 1 minuto prima di iniziare la prova successiva. Asciugare delicatamente i ratti con un asciugamano durante questa attesa pre-processuale.
- Ripetere l'operazione 5.3.3. attraverso 5.3.5. per completare 3 a 5 prove per ogni ratto per essere addestrato in questa sessione di allenamento immersione.
- Rimuovere tutti i divisori di canale, iniziare da camera e zona d'arrivo dal serbatoio.
- Svuotare l'acqua dal serbatoio. Vedere 2.2.2.
- Programma di addestramento subacqueo settimanale
- Condurre sessioni di formazione al giorno (vedere paragrafo 5.3.) 5 giorni alla settimana, preferibilmente alla stessa ora ogni giorno.
- Inizia la prima prova dalla distanza negoziato con successo il giorno precedente. Iniziare la seconda e terza prove con una maggiore distanza immersioni.
- Ad ogni successiva seduta di allenamento giornaliera aumentare la lunghezza del tunnel immersione aggiungendo ulteriori divisori orizzontali per estendere la distanza ratti devono nuotare sott'acqua. Per i primi allenamenti aumento this distanza di 5-10 cm. Dopo i ratti sembrano più a suo agio con le immersioni, aumentare le distanze da 30-50 cm.
NOTA: Non sovraccaricare la distanza immersione tentato durante le prove successive. Se necessario, sollevare l'estremità del coperchio canale orizzontale di fornire distanze di immersione più brevi. Se durante una prova di immersione un topo non raggiunge la fine del tunnel immersione e comincia a girare intorno subacquea, rapidamente sollevare l'estremità della copertura del canale e permettere il ratto alla superficie e continuare la sua nuotata. Ciò consentirà il topo per completare con successo una distanza più lunga immersione. Questo rinforzo positivo non mancherà di tenere il topo si muove in avanti attraverso il tunnel subacqueo con ogni prova di immersione. - Utilizzare più grandi incrementi nelle distanze subacquee, mentre i ratti stanno imparando a tuffarsi un tratto rettilineo di un canale nuotata. Al contrario, imparare a immergersi in tutto il tornanti tra i canali potrebbe richiedere 2-3 sessioni di allenamento.
NOTA: Spesso, durante l'attesa in zona arrivo, i ratti si ri-entrare esimoe l'acqua per nuotare, e / o immergere la testa sott'acqua, mentre ancora seduto sulla piattaforma zona d'arrivo. - Ripetere questo protocollo di allenamento quotidiano oltre 3 settimane per garantire il successo di immersione di tutto il 5 canali. Questo protocollo di allenamento ripetitivo assicura il completamento con successo del labirinto, tanto più che il labirinto comprende alternando tornanti a sinistra ea destra.
NOTA: Il 6 settimane programma completo nuotare e tuffarsi formazione coincide con la crescita di 35 g ratti appena svezzati per raggiungere un peso corporeo di 300 g. - Dopo le sessioni di allenamento giornaliere sono completi, ei topi sono stati restituiti alla loro gabbia a casa, assicurarsi ratti asciugano rapidamente la loro pelliccia per governare, o, se necessario, mettere una piastra elettrica sotto la loro gabbia per tenere i topi caldo fino a quando la loro pelliccia è asciutto.
6. Variazioni sperimentali
NOTA: Il set-up e animale sperimentale di formazione di base sono stati descritti in precedenza. Tuttavia, la formazione comportamentale solo provides un modello per essere utilizzato con altre tecniche sperimentali per raccogliere dati di interesse. Protocolli di base sono modificate per studiare aspetti specifici della risposta immersioni. Esempi di tali modifiche, e alcune considerazioni per la raccolta dei dati utilizzando queste tecniche fisiologiche e neuroanatomici, sono riportati di seguito.
- Impiantabili telemetriche Trasmettitori
- Dopo il completamento della formazione, utilizzare i trasmettitori telemetrici disponibili in commercio per la trasmissione pulsatile pressione arteriosa da nuoto e immersioni ratti. Ottenere l'approvazione locale IACUC per le procedure in materia di chirurgia e il recupero post-chirurgico. Seguire le procedure di impianto suggerite dalla società per la loro trasmissione e assicurare un completo recupero dalla chirurgia prima di restituire il ratto nell'acqua.
- Assicurarsi che l'antenna riceve il segnale radio è vicina quando il ratto è in acqua.
NOTA: L'acqua attenua segnali radio, e quindi la distanza del segnale radio needs di viaggiare attraverso l'acqua diventa un fattore limitante delle dimensioni del serbatoio. - Utilizzare un'antenna bacchetta tenuta in mano, piuttosto che un'antenna di dimensioni rat-gabbia, a seguire il ratto come procede attraverso il labirinto. Tenere l'antenna bacchetta entro 30 cm di ratto per garantire che il segnale radio non viene perso mentre il ratto è sott'acqua.
- Trailing cannule
- Riprogettare i divisori di canale e pezzi orizzontali creando il tetto del tunnel immersioni in modo che la cannula percorsi lungo dietro il ratto durante la progressione attraverso il labirinto.
NOTA: Il design modulare dei canali è di massima importanza e deve consentire un rapido recupero del ratto dal labirinto sottomarino. Se un strappi cannula ed è diventato sloggiati dal ratto, il topo potrebbe presto sanguinare fuori mentre sott'acqua se la cannula non è rapidamente riattaccato. - Utilizzare finale cannule arteriose di registrare la pressione arteriosa e la frequenza cardiaca in ratti spontaneamente immersione. Usare un pezzo di 90 centimetri PE50 comeuna cannula finale.
NOTA: Questa lunghezza della cannula è abbastanza lungo per collegare il ratto al trasduttore di pressione, pur consentendo il ratto di progredire attraverso il labirinto, ma è abbastanza breve per ridurre al minimo la cannula spazio morto ed è abbastanza vicino al trasduttore di pressione per consentire sufficiente fedeltà del segnale di pressione arteriosa. - Utilizzare finali venosa (o arteriosa) cannule per iniettare agenti farmaceutici come agonisti ed antagonisti simpatico e parasimpatico, o iniettare traccianti o coloranti che determinano la distribuzione della gittata cardiaca.
- Prelevare campioni di sangue dai topi utilizzando le cannule venose (o arteriosa), mentre i ratti sono sott'acqua per determinare i livelli di catecolamine subacquei o chimica del sangue.
NOTA: Minimizzare la lunghezza della cannula trascinamento e rappresentano lo spazio morto cannula durante i prelievi di sangue.
- Riprogettare i divisori di canale e pezzi orizzontali creando il tetto del tunnel immersioni in modo che la cannula percorsi lungo dietro il ratto durante la progressione attraverso il labirinto.
- Rilevamento di neuroni attivati tronco cerebrale
- Utilizzare rilevazione immunologica della proteina Fos di identiaree specifiche fy del tronco cerebrale che fanno parte della risposta immersioni.
NOTA: Durante l'apertura ripetitiva di un riflesso cardiorespiratoria, i neuroni del tronco cerebrale che fanno parte di tale circuito riflesso può diventare attivo e produrre una proteina chiamata Fos. - Ripetutamente immergersi ratti attraverso il labirinto ogni 5 minuti per 2 ore per un totale di 24 immersioni.
NOTA: Altri protocolli che inducono anche la produzione di neuroni Fos può anche essere usato. Per evitare l'attivazione dei neuroni del tronco cerebrale coinvolti nella risposta allo stress, il comportamento che si ripete dovrebbe essere incluso come parte della formazione comportamentale.
- Utilizzare rilevazione immunologica della proteina Fos di identiaree specifiche fy del tronco cerebrale che fanno parte della risposta immersioni.
- Livelli di corticosterone sangue durante l'immersione
- Utilizzare corticosterone come indicatore del livello di ratti di stress esperienza durante il nuoto e le immersioni.
- Per ottenere sangue per l'analisi corticosterone, disegnare 0,1 ml di campioni di sangue dalla vena della coda di topi 15 min dopo 3 nuotate volontari o immersioni.
NOTA: Esperimenti preliminari hanno indicato che 15 min è suTempo sere sufficienti per consentire la produzione e il rilascio di corticosterone in circolo e causare un picco dei livelli plasmatici di corticosterone. Dal momento che i livelli di corticosterone hanno un ritmo circadiano, pianificare tutto il sangue disegna alla stessa ora del giorno e corrispondenza con i tempi delle sessioni di formazione.
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Representative Results
Il completamento delle procedure di formazione di nuoto e le immersioni descritte può diminuire lo stress sperimentato da ratti durante le immersioni sott'acqua. I livelli di corticosterone nel sangue indicano che l'allenamento quotidiano ripetitivo diminuisce la stressanti associati alle immersioni volontaria, e ratti addestrati a trovare le immersioni più stressante che essere gestito giornalmente da un essere umano (figura 2; 17). Al contrario, i ratti non addestrati nel protocollo di immersione subacquea trovano volontaria stressante (figura 2; 17). Inoltre, entrambi i ratti allenati e non allenati trovare costretti immersioni la più stressante (figura 2; 17).
Le risposte cardiovascolari di nuoto, immersioni volontaria e ratti immersioni forzate sono stati registrati con dispositivi impiantati di telemetria (Figura 3; 8,17-20) e cannule di uscita (Figura 4, 21-23). Subito dopo volontariasommersione, e all'interno di un unico battito, diminuisce la frequenza cardiaca del 78% e la riduzione media della pressione arteriosa del 25% 17. Questi risultati indicano che i ratti spontaneamente immersione presentano le stesse modifiche cardiorespiratori tipicamente osservati in altri animali immersione. Trailing cannule arteriose sono stati utilizzati per iniettare l'atropina antagonista muscarinico, che elimina la bradicardia associati alle immersioni volontaria (figura 4; 21), e per determinare la distribuzione della gittata cardiaca 22, comprese flusso sanguigno cerebrale 23, durante l'immersione volontaria. Cannule finali sono stati utilizzati anche per dimostrare che i ratti ignorano l'aumento ipossiemia arteriosa e ipercapnia mentre sono sommersi 18, e che il pre-esistente unità chemoreceptor non ha alcun effetto sulle risposte cardiovascolari alle immersioni volontaria 21.
I neuroni all'interno lamine I e II del corno dorsale midollare ventrale (MDH) esprimere Fos During immersioni volontaria, e questi neuroni possono costituire il primo relè tronco afferente della risposta immersione (figura 5; 24). Tronco encefalico importanti aree di controllo cardiorespiratorio, come ad esempio l'area compressore caudale (CPA), solitari nucleo del tratto (NTS), rostrale midollo ventrolaterale (RVLM), e le regioni peribrachial, tutti mostrano un aumento etichettatura Fos durante l'immersione volontaria rispetto al nuoto 25. I neuroni in regioni chemiosensibili del tronco encefalico esprimono Fos dopo lunga durata costretto immersioni 18.
Figura 1:. Schema di Diving Serbatoio Un serbatoio di plexiglas (100 x 60 x 15 cm) è stato utilizzato per creare un labirinto semplice che consiste di cinque canali lunghi 1 m. Il serbatoio è stato riempito con 30 ° C l'acqua di rubinetto, e ratti sono stati inizialmente addestrato a negotiate il labirinto nuotando sulla superficie dell'acqua, Dall'area di avvio (in alto a sinistra) alla zona arrivo (in basso a destra). I ratti sono stati poi addestrati a tuffarsi attraverso il labirinto, tenuto sott'acqua da pezzi di plexiglas orizzontali posti 2-3 cm sotto la superficie dell'acqua. [Questa cifra è stata modificata dal 26]
Figura 2: misurazioni corticosterone. I prelievi di sangue dalle vene della coda di ratto sono stati utilizzati per misurare le concentrazioni di corticosterone (media ± SE) da ratti lasciati nelle gabbie (mai trattati in precedenza), i ratti trattati per 10 min / giorno (gestito), ratti addestrati a nuotare e tuffarsi (qualificati), e ratti che ha ricevuto non nuotare o immergersi formazione (inesperti). Corticosterone è stata misurata dopo ratti addestrati avevano completato la loro formazione di nuoto (a sinistra insieme di barre), ratti addestrati dopo aver completato il loro div volontariae formazione (Centro set di barre), e dopo i ratti addestrati avevano completato la loro formazione immersione forzata (giusto insieme di barre). 1 indica il valore è significativamente maggiore di Naïve; 2 indica il valore è significativamente maggiore di trattati; 3 indica il valore è significativamente maggiore rispetto addestrato; * Indica che in Formatosi valore ratti durante l'immersione forzata è significativamente superiore durante l'immersione volontaria. [Questa cifra è stata modificata dal 17]
Figura 3: tracce pressione arteriosa da trasmettitori telemetrici tracce di dati grezzi mostrano pulsatile della pressione arteriosa durante il nuoto (colonna di sinistra), immersioni volontaria (colonna centrale), e le immersioni forzata (colonna di destra) da ratti addestrati a nuotare e immergersi nel labirinto. (fila in basso) e da ratti che non avevano avuto il traiprocedura ning (riga in alto). Immersione subacquea (sia volontaria e sommersione forzata) produsse un bradicardia immediata e più lento aumento insorgenza della pressione arteriosa, che nuoto sulla superficie dell'acqua non ha causato tali cambiamenti cardiovascolari. Aperitivo sotto le tracce indicano periodi di sommersione. Le interruzioni di traccia periodi indicano quando il segnale telemetrico è stato perso. [Questa cifra è stata modificata dal 17]
Figura 4: Atropina elimina bradicardia immersioni. Le registrazioni originali di pulsatile pressione arteriosa dei ratti volontariamente di immersione (a) prima e (B) dopo atropina pre-trattamento. Tracce sono stati ottenuti utilizzando una cannula arteriosa trascinamento. Prima di atropina pre-trattamento, la pressione arteriosa è diminuito leggermente su di sommersione, ma tgallina aumentata a maggiore di pre-immersione per il resto dell'immersione. La frequenza cardiaca è stata determinata da intervalli di pressione impulsi adiacenti. Dopo l'immersione c'era una bradicardia immediata e sostanziale che è stata mantenuta per tutta la durata dell'immersione. Dopo il blocco parasimpatico da atropina pretrattamento la bradicardia è stato eliminato. C'è stato anche un aumento della pressione arteriosa durante l'immersione. Il bar sotto la traccia indica il periodo di sommersione. [McCulloch, inedito]
Figura 5: etichettatura Fos all'interno della MDH. Microfotografie del corno trigemino midollare dorsale (MDH) e il tratto spinale del trigemino (SP5) nei ratti addestrati a tuffarsi sott'acqua. (A) In un ratto di controllo che non ha ripetutamente immergersi non vi è alcuna etichettatura Fos. (B) In un ratto piscina vi è molto accesotle Fos etichetta nella MDH (grande punta di freccia) o nucleo paratrigeminal (piccola freccia) all'interno SP5. (C) In un ratto immersioni c'è più etichettatura Fos ventrale sia nella MDH (grande punta di freccia) e il nucleo paratrigeminal (piccole frecce) rispetto al il ratto di nuoto e di controllo. Inserire nel pannello (A) indica la posizione rostrale-caudale di pannelli AC. Barra di scala nel pannello C è di 100 micron. [Questa cifra è stata modificata dal 24]
Figura 6: Attivato catecolaminergici neuroni di ratti di immersione. Microfotografie mostrano il midollo di un topo non immersione di controllo (A, C ed E) e un ratto volontariamente immersione (B, D e F). Il tessuto cerebrale è stata immunoistologico elaborato sia per un Fosd tirosina idrossilasi (TH), che produce marrone somas TH e nuclei Fos nero. Punte di freccia aperte identificano con etichetta singola neuroni TH-positivi, mentre le frecce solidi identificare Fos + neuroni TH doppio marcato. Neuroni A1 sono identificati nei neuroni A e B. C1 sono identificati in C e D. neuroni A5 sono identificati in E e F. Più Fos e TH doppio etichettati sono visti in A1, C1, e le regioni A5 del ratto immersione di nel ratto controllo non immersioni. Barra di calibrazione in E è per i pannelli AF, ed è di 250 micron. Barra di calibrazione in inserto in F è per tutti inserti, ed è di 50 micron. [Questa cifra è stata modificata dal 26]
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Discussion
Ratti nella loro forma selvatici possono e sfruttare gli ambienti semi-acquatici, e spesso tuffarsi sott'acqua, mentre alla ricerca di cibo 6. Così non è troppo sorprendente che i ratti possono essere facilmente addestrati a tuffarsi volontariamente sott'acqua. Le procedure di formazione descritte possono durare fino a 6 settimane, che porteranno i ratti appena svezzati ad una dimensione del corpo utilizzato nella maggior parte atlanti del cervello di ratto adulto (~ 300 g). Così i cervelli di questi animali addestrati saranno più facilmente comparabili alle strutture anatomiche identificati in questi atlanti.
Dopo essere stato collocato nella zona di partenza la maggior parte dei ratti inizieranno la loro nuotata sott'acqua entro 20 sec. Tuttavia, di tanto in tanto un topo si richiedere fino a 5 minuti o più prima di iniziare la sua immersione volontaria. Mentre può essere tentati in questa fase di forzare i ratti nel tunnel subacqueo, questo genere deve essere evitata per evitare che i ratti di associare l'acqua con una esperienza negativa. I roditori possono essere testardi e possono initirifiutano alleato per immergersi durante le sessioni di allenamento, ma una volta che si rendono conto l'unico modo per uscire l'acqua è completando l'immersione attraverso il labirinto, di solito iniziano le loro immersioni subito dopo essere stati posti in zona partenza.
Un aspetto critico delle procedure di formazione ripetitive e metodiche è che sono condotte in modo tale da ridurre lo stress vissuta dai topi. Lasciando ratti esplorano il loro ambiente, in particolare mentre nella zona finitura tra la prova, sembra ridurre ulteriormente lo stress. I ratti spesso ri-entrare in acqua per nuotare, e / o immergere la testa sott'acqua, mentre ancora seduto sulla piattaforma zona d'arrivo. Questo suggerisce che i ratti non sono intrinsecamente acqua avversione. Inoltre, mentre non è raro per i ratti per la produzione di pellet fecali durante il nuoto o le immersioni, o quando in attesa nella zona d'arrivo, risultati della formazione quotidiane in un minor numero di pellet fecali 17. In generale, il meno stressati i ratti sono durante l'allenamento, il meno pefiletti produrranno. Eventuali pellet fecali che sono prodotte vengono rimossi dalla zona acqua o finitura più presto possibile mantenere l'acqua relativamente pulita.
I ratti possono occasionalmente avere nasi sanguinanti durante il nuoto e le immersioni, che possono essere il risultato di insufflazione d'acqua nei passaggi nasali. La comparsa di sangue può essere dovuto a sollecitazioni osmotiche all'interno della mucosa nasale. Mentre in zona arrivo tra studi i ratti saranno pulirsi. Di conseguenza, il sangue dal naso può ottenere ridistribuito sulla testa ratti e muso, dando ai ratti una leggera sfumatura rossastra, soprattutto intorno agli occhi, nel corso di una seduta di allenamento. Inoltre, un ratto occasionale può trovare stressante immersioni e / o avere esperienze subacquee negative (ad esempio, girando intorno e perdersi sott'acqua immersione (vedi nota dopo 5.4.3. Su come evitare che ciò accada)). In questi ratti porfirina può apparire agli angoli dei loro occhi, segnalando uno stress response.
La dimensione del serbatoio di immersione sarà in qualche misura determinare i requisiti delle camere. Il serbatoio descritto è progettato per avere ratti nuotare 2-3 cm sotto la superficie dell'acqua tramite un 5 m di lunghezza plexiglas labirinto invia una durata nuoto subacqueo di 10-15 sec 17,19,24,26,27. Qualora un esperimento essere progettato per misurare risposte da una durata dell'immersione più lunga, o da un'immersione profonda subacquea, il serbatoio può essere necessario ri-progettato. I requisiti di camera potrebbero quindi anche cambiare per adattarsi alle dimensioni di una vasca immersione ri-progettato. Se non c'è scarico disponibili pavimento della stanza procedimento, l'acqua dal serbatoio può essere raccolto in un contenitore di grandi dimensioni, come ad esempio un bidone 60 gal può, che possono poi essere svuotato altrove in modo conveniente.
La tecnica Fos può essere utilizzato con altri metodi di rilevazione neuronale per identificare e caratterizzare ulteriormente neuroni che fanno parte della circuiteria tronco della risposta immersioni. Per esempio,Fos rilevamento in combinazione con tirosina idrossilasi colorazione ha identificato neuroni catecolaminergici in A1, C1, A2, A5 e aree sub-coeruleus (Figura 6; 26), e neuroni globosa all'interno della zona laterale A7 26,27, che vengono attivati durante volontaria immersioni. Inoltre, Fos rilevamento in combinazione con il tracciante retrogrado tossina colerica ha identificato i corpi cellulari dei motoneuroni vagali cardiaci all'interno della formazione esterna del nucleo ambiguo che vengono attivati durante l'immersione volontaria 20.
Indagare l'integrazione nervoso centrale delle risposte cardiorespiratorie a immersione è importante per una serie di ragioni 6,8,28. La risposta immersioni consente animali, compreso l'uomo, di rimanere sott'acqua sommerso senza respirare per periodi di tempo prolungati. La risposta di immersione rappresenta una riorganizzazione funzionale del tronco encefalico controllo omeostatico, e dimostra uno dei più potenti patterns di riflessi autonomi osservati negli animali. La risposta di immersione può anche essere importante clinicamente negli esseri umani come parte del riflesso trigemino-cardiaco, reflex nasofaringeo, e / o di sindrome della morte improvvisa infantile. Infine, la comprensione dei circuiti neuronali che esiste all'interno del tronco cerebrale di ratti vi aiuterà a determinare come corticale segnali afferenti possono modificare tronco cerebrale di base riflessi autonomi. Tutte queste considerazioni rendono studio degli aspetti centrali della risposta immersioni mammiferi intrinsecamente utile e interessante. Usando le procedure descritte per la formazione ratti tuffarsi volontariamente sott'acqua permetterà una migliore indagine degli aspetti centrali della risposta immersione dei mammiferi che sarà l'uso degli animali tuffato forzati. Questo perché le procedure di formazione come descritto 1) ridurre l'attivazione dei circuiti di stress del sistema nervoso centrale, e 2) non attivano CNS circuiti di ricompensa perché ricompense esterne non vengono utilizzati.
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Disclosures
L'autore è un consulente per Stoelting Società, e ha fornito la progettazione e le specifiche del McCulloch Dive serbatoio Maze complessiva a loro per fini commerciali.
Acknowledgments
La ricerca sostenuta da un finanziamento della Midwestern University Ufficio di programmi di ricerca e sponsorizzati. Grazie anche al Fondo Midwestern University animali e Erik Warren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCulloch Diving Tank Maze | Stoelting Company | 60139 | |
| 1 inch internal diameter tubing | Fisher | 14-169-63 | Used to fill or drain tank |
| Plexiglas rodent restraint device (Economy flat bottomed restrainer) | Braintree | FB-M/L | For forced dives |
| Telemetric transmitters | DSI | Model PA-C40 (270-0040-008) | Used to transmit pulsatile arterial blood pressure |
| Hand-held antenna wand | DSI | Model RLA 3000 (272-5007) | Used to ensure radio antenna is near to transmitter while rat is negotiating underwater maze |
| Intramedic PE50, 0.023" ID | Fisher | 14-170-12B | Used as trailing arterial cannula |
| N95 mask - Moldex #2300N Series | Fisher | 19-003-246D | Used to limit inhalation of rat allergens |
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