Protocol
NOTA: Os protocolos experimentais aqui descritos realizado na Universidade Midwestern foram aprovados pela Midwestern University IACUC.
1. Requisitos do quarto
- Garantir um quarto procedimento que tem água corrente quente e fria, e uma maneira de remover a água do tanque, normalmente um dreno no chão.
- Use uma mesa de estudo em que para colocar o tanque de mergulho. Desde quartos com ralos são tipicamente contornada para a drenagem, reduzir rolhas de borracha e colocá-los sob as pernas de mesa para assegurar que o tampo da mesa, e, consequentemente, a superfície da água no tanque, está nivelada.
Tanque 2. Mergulho
- Mergulho Construção Tanque
- Construir um tanque rectangular (100 x 60 x 15 cm) usando 3/4 em Plexiglas grossas para a parte inferior e 1/2 em Plexiglas para as paredes laterais (Figura 1). Prende permanentemente as peças de acrílico fora do tanque em conjunto, utilizando cimento de cianoacrilato ou solvents, tais como tricloro-metano.
- Dividir o tanque em cada cinco canais de aproximadamente 100 cm de comprimento, usando removíveis Plexiglas 1/2 polegada de espessura cortada em 85 x 15 cm pedaços. Permanentemente colocar ranhuras no fundo e bordas do tanque em que estes divisores de canal podem ser encaixados em posição.
- Suspender peças horizontais de acrílico dos divisores de canais para criar um "teto" para um mergulho túnel subaquático ".
- Em um canto do lugar tanque de uma plataforma removível levantada, a "área de acabamento", para os ratos para transportar para fora da água e descansar entre testes de natação e mergulho. Os ratos geralmente limpar-se e retirar a água de sua pele enquanto na área de acabamento. Coloque os lados de altura em torno das bordas da área de acabamento para garantir os ratos permanecem na plataforma entre os ensaios de formação.
- No canto oposto do tanque da área de acabamento colocar uma câmara que só permite o acesso subaquático para o labirinto. Este removível "iniciar umrea "só é usado para ensaios de mergulho.
NOTA: No início de um julgamento de mergulho um rato é rebaixada para a água enquanto está sentado em uma plataforma dentro da câmara de início; portanto, esta plataforma é chamada de "elevador".
NOTA: Use um design modular, onde a área de início, a área de chegada, e todos os canais de divisórias são removíveis do tanque. Isto é feito por duas razões: 1) a fim de facilitar o enchimento e esvaziamento do tanque com água após a remoção de todos os divisores de canal, e 2) se um rato fica desorientado, especialmente quando debaixo de água, as peças podem ser rapidamente desmontadas para resgatar o rato a partir do água.
- Encher e esvaziar o tanque com água
- Encher o tanque com água
- No início de cada sessão de treino, encher o tanque com água fresca 32 ° C torneira a uma profundidade de cerca de 12 cm. Agita-se a água no tanque para minimizar bolsas de ar quente ou frio.
NOTA: Normalmente, leva cerca de 2 horas para treinar 12 ratos. Durante este tempoa temperatura da água diminui em cerca de 4 ° C. No final da sessão de treino a água arrefece até cerca de 28 ° C. Desde 30 ° C a água é thermoneutral a ratos, utilizando esta água morna, em vez de água à temperatura ambiente, irá minimizar a perda de calor durante o treinamento repetitivo.
- No início de cada sessão de treino, encher o tanque com água fresca 32 ° C torneira a uma profundidade de cerca de 12 cm. Agita-se a água no tanque para minimizar bolsas de ar quente ou frio.
- Esvaziar o tanque com água
- No fim de cada sessão de treino, drenar a água a partir do tanque através de um grande mangueira, tal como um 4 m de comprimento pedaço de tubo de diâmetro interno de 1 polegada. Totalmente submergir o tubo no tanque, garantindo não são bolsas de ar na tubulação. Rapidamente coloque uma extremidade da tubulação para a drenagem chão. O efeito sifão resultante irá drenar a água do tanque.
- Embora mantendo o tanque final do tubo sob a superfície da água para manter o efeito de sifão, o tanque de ponta na extremidade para facilitar a drenagem da água completa.
NOTA: Como alternativa, e ao invés de sifão, instalar uma torneira perto da base do tanque, e conecteuma mangueira do tanque de toque para o ralo.
- Encher o tanque com água
3. Rat alérgeno Considerações
- Usar luvas descartáveis ao manusear e treinar os ratos. As luvas vai limitar o contacto com a água no tanque, o que invariavelmente irá conter urina de rato.
NOTA: Os ratos vão ficar molhado durante o treinamento, eo quarto será preenchido com um odor "wet-rato". Consequentemente, um regime profilático de anti-histamínicos podem impedir ou limitar os efeitos de alergias de ratos. Os instrutores também pode precisar usar máscaras contra poeira descartáveis, ou máscaras N95, se eles se tornam sensíveis aos alérgenos de rato.
4. Formação Swim
- Treinamento diário de natação
NOTA: A experiência pessoal indica que os ratos mais jovens aprendem o labirinto melhor e mais rápido, e iniciando, assim, a formação com 35 g ratos recém-desmamados é preferível ao uso de ratos adultos.- Encha o tanque com água. Veja 2.2.1.
- Acabamento Insertdivisores da área e do canal para criar cinco canais de natação.
- Durante a primeira sessão de treino delicadamente abaixar os ratos por mão na água cerca de 3-5 cm da área de acabamento.
NOTA: Após a sua introdução para ratos d'água aparecerá instável à medida que primeiro encontrar a sensação de flutuar. Os ratos vão remar cerca de uma forma descoordenada ao tentar localizar uma maneira de sair da água, acabou atingindo a área de acabamento nas proximidades. Devido à sua capacidade inata para nadar, em ensaios subseqüentes, os ratos vão nadar de uma forma muito mais coordenada para a área de acabamento.
Nota: O suporte dos ratos a partir de baixo para que seus pés estão nas mãos investigadores. Abaixe cuidadosamente os ratos na água, e deixá-los nadar para longe da mão, em vez de deixá-los cair na água. - Entre ensaios, os ratos deixar permanecer na área de acabamento de pelo menos 1 min. Isto é para permitir que os ratos para preparar e explorar, de modo que eles consideram a área de acabamento como um local "seguro"para ir entre os ensaios. Isto está em contraste com a pegar um rato que acaba de completar um julgamento e de imediato posicionando-o de volta na água para iniciar o próximo julgamento.
NOTA: Não use recompensa externa (ou seja, alimentos) durante a formação, de modo a evitar a ativação de circuitos de recompensa no cérebro. - Após o período de espera área de chegada, segure suavemente os ratos para 1 min antes de iniciar o próximo julgamento. Seque suavemente os ratos com uma toalha durante esta espera pré-julgamento desde a entrada repetitiva dentro da água fará com que os ratos a ficar muito molhado, e secando-se evitar a hipotermia.
- Repita 4.1.3. através de 4.1.5. para completar 3-5 ensaios para cada rato para ser treinado durante uma sessão de treinamento de natação diária.
- Remova todos os divisores de canal e terminar área do tanque.
- Esvaziar a água do tanque. Veja 2.2.2.
- Programação de treinamento de natação Weekly
- Realizar sessões de treinamento por dia (ver 4.1.) 5 dias por semana, de preferência ao mesmo tempocada dia.
- Comece o primeiro ensaio da distância negociado com sucesso no dia anterior. Comece o segundo e terceiro ensaios de um aumento da distância.
- Com cada sessão de treino diária subsequente aumentar a distância entre o local onde os ratos são colocados em água e a área de acabamento. Para as primeiras sessões de treinamento aumentar esta distância de 5-10 cm. Após os ratos parecem mais confortáveis com a natação, aumentar as distâncias de 30-50 cm.
- Use maiores aumentos nas distâncias de natação, enquanto os ratos estão aprendendo a nadar uma parte reta de um canal de mergulho. Em contraste, a aprender a nadar a curvas fechadas entre os canais pode demorar 2-3 sessões de treinamento.
NOTA: Muitas vezes, enquanto espera na área de acabamento, os ratos vão voltar a entrar na água para nadar, e / ou submergir sua cabeça debaixo d'água enquanto ainda sentado na plataforma área de acabamento. - Repita este protocolo de treinamento diariamente mais de 3 semanas para garantir a natação bem-sucedido de toda a 5 canais.Este protocolo de treinamento repetitivo garante a conclusão do labirinto, especialmente desde que o labirinto inclui alternando curvas fechadas esquerda e direita.
5. Formação Dive
NOTA: Depois que os ratos aprenderam a negociar a natação através do labirinto com sucesso que eles estão prontos para começar a treinar mergulho.
- Treinamento de mergulho inicial (primeiro dia)
- Insira câmara começo. Encha o tanque com água (ver 2.2.1.). Certifique-se o nível de água é de 1 cm abaixo da abertura para a área de início.
- Insira área de chegada e divisores de canais para criar cinco canais de natação.
- Durante a primeira sessão de mergulho treinar os ratos para ser reduzido no elevador para dentro da água no interior da câmara inicial. O acesso ao labirinto é a partir da parte inferior da câmara de início. Durante esta primeira sessão, o nível da água é baixo o suficiente para que o rato pode facilmente nadar da câmara de início para o labirinto. Permitir que o rato de continuar nadando através do labirinto deárea de chegada.
- Entre ensaios, os ratos deixar permanecer na área de acabamento de pelo menos 1 min.
NOTA: Não use recompensa externa (ou seja, alimentos) durante a formação, de modo a evitar a ativação de circuitos de recompensa no cérebro. - Após o período de espera área de chegada, segure suavemente os ratos para 1 min antes de iniciar o próximo julgamento. Seque suavemente os ratos com uma toalha durante esta espera de pré-julgamento.
- Repita 5.1.3. através de 5.1.5. para completar 3 ensaios para cada rato para ser treinado durante esta sessão de treinamento de mergulho inicial.
- Remova todos os divisores de canal, câmara de começar e terminar a área do tanque.
- Esvaziar a água do tanque. Veja 2.2.2.
- Treinamento de mergulho inicial (segundo dia)
- Insira câmara começo. Encha o tanque com água (ver 2.2.1.). Certifique-se o nível de água está ligeiramente acima da abertura para a área de início.
- Insira área de chegada e divisores de canais para criar cinco canais de natação.
- Durante o segundo mergulhosessão de o nível da água de formação foi levantada de modo que a sair da câmara de início o rato tem que mergulhar a cabeça debaixo da extremidade da câmara de início para entrar no labirinto. Considere isso como primeiro mergulho do rato. Permitir que o rato para, em seguida, continuar nadando através do labirinto para a área de acabamento.
- Deixe os ratos permanecem na área de acabamento, pelo menos, 1 min entre os testes.
NOTA: Não use recompensa externa (ou seja, alimentos) durante a formação, de modo a evitar a ativação de circuitos de recompensa no cérebro. - Após o período de espera área de chegada, segure suavemente os ratos para 1 min antes de iniciar o próximo julgamento. Seque suavemente os ratos com uma toalha durante esta espera de pré-julgamento.
- Repita 5.2.3. através de 5.2.5. para completar 3 ensaios para cada rato para ser treinado durante esta sessão de treinamento de mergulho.
- Remova todos os divisores de canal, câmara de começar e terminar a área do tanque.
- Esvaziar a água do tanque. Veja 2.2.2.
- Treinamento de mergulho inicial (third dia)
- Insira câmara começo. Encher o tanque com água (ver 2.2.1.), Assegurando que o nível da água está acima da abertura para a área de início.
- Insira área de chegada e divisores de canais para criar cinco canais de natação. Coloque um pedaço horizontal de Plexiglas imediatamente fora da área de início para criar um cinco centímetros de comprimento mergulho túnel.
- Durante a terceira sessão de treinamento de mergulho o rato tem que mergulhar a cabeça sob a borda da câmara de início e nadar cinco centímetros debaixo d'água para chegar ao mar aberto do canal de mergulho. Permitir que o rato para, em seguida, continuar nadando através do labirinto para a área de acabamento.
NOTA: Uma vez colocada na área de partida, os ratos iniciar seu próprio submersão debaixo d'água, e, portanto, estes são considerados mergulhos "voluntárias". - Deixe os ratos permanecem na área de acabamento, pelo menos, 1 min entre os testes.
NOTA: Não use recompensa externa (ou seja, alimentos) durante a formação, de modo a evitar a ativação de circuitos de recompensa no cérebro. - Após o período de espera área de chegada, segure suavemente os ratos para 1 min antes de iniciar o próximo julgamento. Seque suavemente os ratos com uma toalha durante esta espera de pré-julgamento.
- Repita 5.3.3. através de 5.3.5. para completar 3-5 ensaios para cada rato para ser treinado durante esta sessão de treinamento de mergulho.
- Remova todos os divisores de canal, câmara de começar e terminar a área do tanque.
- Esvaziar a água do tanque. Veja 2.2.2.
- Programação de treinamento de mergulho semanal
- Realizar sessões diárias de treinamento (ver 5.3.) 5 dias por semana, de preferência ao mesmo tempo cada dia.
- Comece o primeiro ensaio da distância negociado com sucesso no dia anterior. Comece o segundo e terceiro ensaios com um aumento da distância de mergulho.
- Com cada sessão diária de treinamento subseqüente aumentar o comprimento do túnel mergulho adicionando divisores horizontais adicionais para estender a distância que os ratos têm de nadar debaixo d'água. Pela primeira alguns treinos aumento this distância de 5-10 cm. Após os ratos parecem mais confortáveis com mergulho, aumentar as distâncias de 30-50 cm.
NOTA: Não extrapolar a distância de mergulho tentou durante os ensaios sucessivos. Se necessário, levantar a extremidade da cobertura de canal horizontal para proporcionar um mergulho mais curtas distâncias. Se, durante um ensaio de mergulho um rato não chegar ao fim do túnel mergulho e começa a virar debaixo d'água, rapidamente levante a extremidade da tampa do canal e permitir que o rato à superfície e continuar seu mergulho. Isso permitirá que o rato para concluir com êxito uma distância de mergulho mais longo. Este reforço positivo vai manter o rato se movendo para a frente através do túnel submarino com cada tentativa de mergulho. - Use maiores aumentos nas distâncias de mergulho enquanto os ratos estão aprendendo a mergulhar uma parte reta de um canal de mergulho. Por outro lado, aprender a mergulhar em torno da curvas fechadas entre os canais pode demorar 2-3 sessões de treinamento.
NOTA: Muitas vezes, enquanto espera na área de acabamento, os ratos vão reentrar the água para nadar, e / ou submergir sua cabeça debaixo d'água enquanto ainda sentado na plataforma área de acabamento. - Repita este protocolo de treinamento diariamente mais de 3 semanas para garantir um mergulho bem sucedido de toda a 5 canais. Este protocolo de treinamento repetitivo garante a conclusão do labirinto, especialmente desde que o labirinto inclui alternando curvas fechadas esquerda e direita.
NOTA: A programação de natação e mergulho formação completa seis semanas coincide com o crescimento de 35 g ratos recém-desmamados para chegar a um peso corporal de 300 g. - Após as sessões de treinamento diárias são completas, e os ratos foram devolvidos à sua gaiola, garantir ratos rapidamente secar sua pele através do aliciamento, ou, se necessário, coloque uma almofada de aquecimento sob sua gaiola para manter os ratos quente até sua pele é seca.
6. Variações Experimentais
NOTA: O set-up e animal formação básica experimental foram descritos acima. Entretanto, o treinamento comportamental só provides um modelo a ser utilizado com outras técnicas experimentais para coletar dados de interesse. Protocolos básicos são modificados para investigar aspectos específicos da resposta mergulho. Exemplos destas modificações, e algumas considerações para a recolha de dados usando essas técnicas fisiológicas e neuroanatómicos, são dadas abaixo.
- Implantáveis telemetria Transmissores
- Após a conclusão do treinamento, usam transmissores de telemetria disponíveis no mercado para transmitir a pressão arterial pulsátil arterial de natação e mergulho ratos. Obter a aprovação locais IACUC para procedimentos relativos a cirurgia e recuperação pós-cirúrgica. Siga os procedimentos de implantação sugeridas pela empresa para o seu transmissor, e garantir a recuperação completa da cirurgia antes de retornar o rato na água.
- Assegurar a antena que recebe o sinal de rádio está próximo quando o rato está na água.
NOTA: Água atenua os sinais de rádio, e assim a distância que o sinal de rádio needs viajar através da água torna-se um fator limitante das dimensões do tanque. - Use uma antena de varinha de mão, em vez de uma antena do tamanho de ratos-gaiola, para seguir o rato à medida que progride através do labirinto. Manter a antena varinha dentro de 30 cm do rato para assegurar que o sinal de rádio não está perdido enquanto o rato é subaquática.
- Trailing cânulas
- Redesenhar os divisores de canal e peças horizontais criando o teto do túnel mergulho trilhas para que a cânula ao longo atrás do rato durante a sua progressão através do labirinto.
NOTA: O design modular dos canais é de extrema importância e deve também permitir a rápida recuperação do rato do labirinto debaixo d'água. Se um senões cânula e ficou desalojado do rato, o rato poderá em breve sangrar enquanto debaixo d'água se a cânula não é rapidamente recolocado. - Use arrastando cânulas arterial para registrar a pressão arterial e freqüência cardíaca em ratos voluntariamente mergulho. Use um pedaço de 90 centímetros PE50 comouma cânula à direita.
NOTA: Este comprimento cânula é longo o suficiente para ligar o rato para o transdutor de pressão e ainda permite que o rato para progredir através do labirinto, mas é curto o suficiente para minimizar a cânula espaço morto e está perto o suficiente para o transdutor de pressão para permitir a fidelidade suficiente da sinal de pressão arterial. - Use de fuga venosa (ou arterial) cânulas para injectar agentes farmacêuticos, tais como agonistas e antagonistas do simpático e parassimpático, ou para injectar ou corantes marcadores que determinam a distribuição do débito cardíaco.
- Retirar amostras de sangue dos ratos por meio de cânulas venosa (ou arterial), enquanto os ratos estão debaixo d'água para determinar os níveis de catecolaminas subaquáticas ou química do sangue.
NOTA: deve minimizar o comprimento da cânula de fuga e representam a cânula espaço morto durante sangue chama.
- Redesenhar os divisores de canal e peças horizontais criando o teto do túnel mergulho trilhas para que a cânula ao longo atrás do rato durante a sua progressão através do labirinto.
- Detecção de neurônios do tronco cerebral ativadas
- Usar a detecção imunológica da proteína Fos para identiáreas específicas fy do tronco cerebral, que são parte da resposta mergulho.
NOTA: Durante a iniciação repetitivo de um reflexo cardiorrespiratória, neurônios do tronco cerebral que fazem parte desse circuito reflexo pode se tornar ativados e produzem uma proteína chamada Fos. - Repetidamente mergulhar ratos através do labirinto cada 5 min durante 2 horas para um total de 24 mergulhos.
NOTA: Outros protocolos que também induzem a produção de Fos neuronal pode também ser usado. Para evitar a activação dos neurónios do tronco cerebral envolvidas na resposta ao stress, comportamento que se repete deverá ser incluída como parte da formação comportamental.
- Usar a detecção imunológica da proteína Fos para identiáreas específicas fy do tronco cerebral, que são parte da resposta mergulho.
- Níveis de corticosterona no sangue durante o mergulho
- Use corticosterona como um indicador do nível de estresse dos ratos experiência durante a natação e mergulho.
- Para obter sangue para análise de corticosterona, desenhar 0,1 ml de amostras de sangue a partir da veia da cauda dos ratos após 15 min 3 nados voluntárias ou mergulhos.
NOTA: experimentos preliminares indicaram que 15 minutos é sutempo ficiente para permitir a produção e libertação de corticosterona para a circulação e provocar um pico nos níveis de corticosterona no plasma. Como os níveis de corticosterona tem um ritmo circadiano, programar todo o sangue atrai ao mesmo tempo do dia e se correspondia com o calendário de sessões de treinamento.
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Representative Results
A conclusão bem sucedida dos procedimentos de treinamento de natação e mergulho descritas podem reduzir o estresse experimentado por ratos ao mergulhar sob a água. Níveis de corticosterona no sangue indicam que o treinamento diário repetitivo diminui o stressfulness associados ao mergulho voluntário, e ratos treinados encontrar mergulho não mais estressante do que ser tratada diariamente por um ser humano (Figura 2; 17). Por outro lado, os ratos não treinados no protocolo de mergulho encontrar mergulho voluntário estressante (Figura 2; 17). Além disso, ambos os ratos treinados e não treinados encontrar mergulho forçado a ser o mais estressante (Figura 2; 17).
As respostas cardiovasculares de natação, mergulho voluntário e ratos mergulho forçado foram registrados utilizando dispositivos implantados telemetria (Figura 3; 8,17-20) e cânulas de fuga (Figura 4; 21-23). Imediatamente após a voluntáriasubmersão, e dentro de uma única batida, a frequência cardíaca diminui de 78% e média diminui a pressão arterial em 25% 17. Estes resultados mostram que os ratos voluntariamente mergulho exibem as mesmas alterações cardio-respiratórias tipicamente observados em outros animais de mergulho. De arrasto cânulas arteriais foram usadas para injectar a atropina antagonista muscarínico, o que elimina a bradicardia associados ao mergulho voluntário (Figura 4; 21), e para determinar a distribuição do débito cardíaco 22, incluindo o fluxo de sangue cerebral 23, durante o mergulho voluntário. Cânulas de arrasto também têm sido usados para mostrar que os ratos de ignorados aumentando hipoxemia arterial e hipercapnia, enquanto eles estão submersos 18, e que o pré-existente unidade quimiorreceptora não tem qualquer efeito sobre as respostas cardiovasculares à mergulho 21 voluntária.
Neurônios dentro lâminas I e II do corno dorsal da medula ventral (MDH) expressam Fos during mergulho voluntário, e esses neurônios podem constituir o primeiro relé de tronco cerebral aferente da resposta mergulho (Figura 5; 24). Importantes áreas de controle do tronco cerebral cardiorrespiratórias, como a área compressor caudal (CPA), solitários núcleo do trato (NTS), rostral medula ventrolateral (RVL), e regiões peribrachial, todos mostram aumento rotulagem Fos durante o mergulho voluntário em comparação com a natação 25. Os neurônios em regiões chemosensitive do tronco encefálico expressar Fos após longa duração forçado mergulhos 18.
Figura 1:. Esquemática do tanque de mergulho Um tanque de plexiglas (100 x 60 x 15 cm) foi usada para criar um labirinto simples que consiste em cinco canais de 1 m de comprimento. O tanque foi preenchido com 30 ° C de água da torneira, e os ratos foram inicialmente treinados para negociae do labirinto nadando na superfície da água, da Área de Iniciar (canto superior esquerdo) para a área de chegada (canto inferior direito). Os ratos foram treinados, em seguida, a mergulhar através do labirinto, mantido debaixo de água por partes de Plexiglas horizontais colocadas 2-3 cm abaixo da superfície da água. [Este valor foi modificado de 26]
Figura 2: As medições de corticosterona. Sangue chama de veias da cauda de ratos foram usados para medir as concentrações de corticosterona (média ± SE) de ratos deixados em suas gaiolas (Naïve), os ratos manipulados para 10 min / dia (tratado), os ratos treinados para nadar e mergulhar (Treinado) e ratos que não recebeu nadar ou mergulhar formação (Destreinado). Corticosterona foi medida após ratos treinados tinham completado o treinamento de natação (Esquerda conjunto de barras), os ratos treinados após terem completado a sua div voluntárioformação e (Centro conjunto de barras), e depois de ratos treinados tinha concluído a sua formação de mergulho forçado (Direito conjunto de barras). 1 indica o valor é significativamente maior do Naïve; 2 indica o valor é significativamente maior do Segurado; 3 indica valor é significativamente maior do que treinado; * Indica que em Treinado valor ratos durante mergulho forçado é significativamente maior do que durante o mergulho voluntário. [Este valor foi modificado de 17]
Figura 3: traços de pressao arterial de transmissores de telemetria vestígios de dados brutos que mostram a pressão arterial pulsátil arterial durante a natação (coluna da esquerda), mergulho voluntário (coluna do meio) e mergulho forçado (coluna da direita) de ratos treinados para nadar e mergulhar através do labirinto. (linha de fundo) e de ratos que não haviam tido a traiprocedimento ning (top de linha). Mergulho (ambos voluntário e submersão forçada) produziu uma bradicardia imediato e mais lento aumento da pressão arterial no início, enquanto nadando na superfície da água não causou essas alterações cardiovasculares. Bares sob traços indicam períodos de submersão. Quebras em traços indicam os períodos em que o sinal de telemetria foi perdido. [Este valor foi modificado de 17]
Figura 4: Atropina elimina bradicardia mergulho. Gravações originais de pulsátil arterial pressão arterial de ratos voluntariamente mergulho (A) antes e (B) após o pré-tratamento de atropina. Vestígios foram obtidos utilizando uma cânula arterial de fuga. Antes de atropina pré-tratamento, a pressão arterial diminuiu ligeiramente após submersão, mas tgalinha aumentado para um valor superior pré-mergulho para o restante do mergulho. A freqüência cardíaca foi determinada a partir de intervalos de pressão de pulso adjacentes. Após a submersão houve uma bradicardia imediato substancial e que foi mantida durante a duração do mergulho. Após o bloqueio parassimpático pela atropina pré-tratamento da bradicardia foi eliminado. Houve também um aumento na pressão arterial durante o mergulho. A barra sob o traço indica o período de submersão. [McCulloch, inédito]
Figura 5: Marcação de Fos no interior da MDH. Fotomicrografias do corno dorsal da medula trigêmeo (MDH) e do trato espinal do nervo trigêmeo (SP5) em ratos treinados para mergulhar debaixo d'água. (A) Em um rato de controle que não repetitiva mergulhar não há rotulagem Fos. (B) Em um rato nadando lá é muito iluminadoetiqueta na MDH (grande seta) ou núcleo paratrigeminal (pequena seta) tle Fos dentro sp5. (C) Em um rato mergulho há mais rotulagem Fos ventrally tanto na MDH (grande ponta de seta) e núcleo paratrigeminal (pequenas setas) em comparação com a natação e controle de roedores. Inserção no painel (A) indica a localização de painéis AC rostral-caudal. Barra de escala no painel C é de 100 mm. [Este valor foi modificado de 24]
Figura 6: Activado neurônios catecolaminérgicos de ratos de mergulho. As fotomicrografias mostram as medulas de um rato não-mergulho controlo (A, C, e E) e uma ratazana voluntariamente mergulho (B, D e F). O tecido cerebral foi processado immunohistologically tanto para um Foshidroxilase d tirosina (TH), a produção de castanha TH somas e núcleos negros Fos. Pontas de seta abertas identificar único marcado neurônios TH-positivas, enquanto as setas sólidas identificar Fos + TH neurônios duplamente marcada. A1 neurónios são identificados em neurónios A e B. C1 são identificados em C e D. neurónios A5 são identificados em E e F. Mais Fos e TH duplamente marcada são vistos na A1, C1, A5 e regiões de mergulho do que o rato no rato controle não-mergulho. Barra de calibração em E é para painéis de AF, e é de 250 mm. Barra de calibração em baixo-relevo em F é para todas as inserções, e é de 50 mm. [Este valor foi modificado de 26]
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Discussion
Os ratos em sua forma feral podem fazer e explorar ambientes semi-aquáticos, e muitas vezes vai mergulhar debaixo d'água, enquanto em busca de alimento 6. Assim, não é muito surpreendente que os ratos podem ser facilmente treinados para mergulhar voluntariamente debaixo d'água. Os procedimentos de treinamento descritos podem durar até seis semanas, o que trará ratos recém-desmamados com um tamanho de corpo usado na maioria dos atlas do cérebro de ratos adultos (~ 300 g). Assim, os cérebros destes animais treinados serão mais facilmente comparáveis às estruturas anatómicas identificadas nestes atlas.
Depois de ser colocado na área de início a maioria dos ratos começará a nadar debaixo d'água dentro de 20 seg. No entanto, de vez em quando um rato vai demorar até 5 minutos ou mais antes de iniciar seu mergulho voluntário. Embora possa ser tentador, nesta fase, para forçar os ratos para dentro do túnel subaquático, geralmente esta deve ser evitada para evitar que os ratos de associar a água com uma experiência negativa. Os roedores podem ser teimosos e pode initialiado recusar-se a mergulhar durante as sessões de treinamento, mas uma vez que eles percebem que a única maneira de sair da água é através do preenchimento do mergulho através do labirinto, eles costumam iniciar seus mergulhos logo depois de ser colocado na área de início.
Um aspecto crítico dos procedimentos de treinamento repetitivo e metódico é que eles são conduzidas de tal forma a reduzir o stress experimentado pelos ratos. Deixando ratos explorar seu ambiente, especialmente enquanto na área de acabamento entre ensaios, parece reduzir ainda mais stress. Os ratos, muitas vezes, re-entrar na água para nadar, e / ou submergir sua cabeça debaixo d'água enquanto ainda sentado na plataforma área de acabamento. Isto sugere que os ratos não são intrinsecamente água aversivo. Além disso, enquanto não é incomum para os ratos para produzir pelotas fecais durante a natação ou mergulho, ou quando esperando na área de chegada, os resultados do treinamento diárias em menos pelotas fecais 17. Em geral, a menos estressado os ratos são durante o treinamento, a menos pellets eles vão produzir. Quaisquer partículas fecais que são produzidos são removidos da área de acabamento ou a água tão rapidamente quanto possível para manter a água relativamente limpa.
Ratos podem ocasionalmente se narizes sangrentos durante a natação e mergulho, o que pode ser um resultado de insuflação de água para as passagens nasais. O aparecimento de sangue pode ser devida a tensões osmóticas dentro da mucosa nasal. Enquanto na área de chegada entre os ensaios, os ratos vão limpar-se. Como uma consequência do sangue a partir do nariz pode ficar redistribuído sobre a cabeça ratos e focinho, dando aos ratos uma ligeira coloração avermelhada, especialmente em torno dos olhos, durante o curso de uma sessão de treino. Além disso, um rato ocasional pode encontrar mergulho estressante e / ou têm experiências de mergulho negativos (ou seja, girando ao redor e se perder enquanto subaquática de mergulho (ver nota após 5.4.3. Sobre a forma de evitar que isso ocorra)). Nestes ratos porfirina podem aparecer nos cantos dos olhos, sinalizando um esforço response.
O tamanho do tanque de mergulho em algum grau determinar os requisitos de apartamentos. O tanque descrito foi concebido para ter ratos nadar 2-3 cm abaixo da superfície da água por meio de um 5 m de comprimento Plexiglas labirinto para dar uma duração de natação subaquática de 10-15 seg 17,19,24,26,27. Deve ser uma experiência concebida para medir as respostas de um mergulho duração mais longa, ou a partir de um mergulho mais profundo debaixo d'água, o tanque pode precisar ser re-projetado. Os requisitos dos quartos poderia, então, também mudam para ajustar as dimensões de um tanque de mergulho re-projetado. Se não houver um ralo de pavimento disponível na sala de procedimento, a água do tanque pode ser recolhido num recipiente grande, tal como uma lata de lixo 60 gal pode, que pode então ser esvaziado em outros lugares de um modo conveniente.
Fos A técnica pode ser utilizada com outros métodos de detecção neuronal para identificar e caracterizar os neurónios que fazem parte dos circuitos da resposta do tronco cerebral mergulho. Por exemplo,Detecção de Fos em conjunção com a coloração da tirosina hidroxilase foi identificada neurónios catecolaminérgicos do A1, C1, A2, A5 e áreas sub-coeruleus (Figura 6; 26), e os neurónios globosa dentro da área A7 laterais 26,27, que são activadas durante voluntária mergulho. Além disso, a detecção de Fos em conjunto com o traçador retrógrado toxina da cólera identificou os corpos celulares dos neurónios motores vagais cardíacas dentro da formação externa do núcleo ambíguo que são activadas durante o mergulho voluntário 20.
Investigar a integração nervoso central dos essas respostas para o mergulho é importante para uma série de razões 6,8,28. A resposta de mergulho permite animais, incluindo seres humanos, para permanecer submerso sem respiração subaquática por períodos de tempo prolongados. A resposta de mergulho representa uma reorganização funcional do tronco cerebral controle homeostático, e demonstra um dos mais poderosos patterns de reflexos autonômicos observados em animais. A resposta de mergulho também podem ser clinicamente importante em seres humanos como parte do reflexo trigemino cardíaca, reflexo da nasofaringe, e / ou síndrome da morte súbita infantil. Finalmente, uma compreensão do circuito neuronal que existe dentro do tronco encefálico de ratos vai ajudar a determinar como cortical sinais aferentes do tronco cerebral pode modificar básica reflexos autonômicos. Todas estas considerações tornam estudo dos aspectos centrais da resposta de mergulho mamífero inerentemente valioso e interessante. Utilizando os procedimentos descritos para treinar ratos para mergulhar voluntariamente subaquática permitirá uma melhor investigação dos aspectos centrais da resposta de mergulho mamífero que será o uso de animais mergulharam forçados. Isso ocorre porque os procedimentos de treinamento como descrito 1) reduzir a ativação do sistema nervoso central circuito stress, e 2) não ativar CNS circuito de recompensa porque recompensas externas não são utilizados.
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Disclosures
O autor é consultor da Stoelting Companhia, e desde o design e as especificações do McCulloch Dive Tanque Maze geral a eles para fins comerciais.
Acknowledgments
Pesquisa apoiado pelo financiamento da Universidade Escritório de Programas de Pesquisa e patrocinado Midwestern. Graças também à facilidade Midwestern University Animal e Erik Warren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCulloch Diving Tank Maze | Stoelting Company | 60139 | |
| 1 inch internal diameter tubing | Fisher | 14-169-63 | Used to fill or drain tank |
| Plexiglas rodent restraint device (Economy flat bottomed restrainer) | Braintree | FB-M/L | For forced dives |
| Telemetric transmitters | DSI | Model PA-C40 (270-0040-008) | Used to transmit pulsatile arterial blood pressure |
| Hand-held antenna wand | DSI | Model RLA 3000 (272-5007) | Used to ensure radio antenna is near to transmitter while rat is negotiating underwater maze |
| Intramedic PE50, 0.023" ID | Fisher | 14-170-12B | Used as trailing arterial cannula |
| N95 mask - Moldex #2300N Series | Fisher | 19-003-246D | Used to limit inhalation of rat allergens |
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