Protocol
הערה: פרוטוקולי ניסוי המתוארים במסמך שנערך באוניברסיטת המערב התיכון אושרו על ידי המערב התיכון IACUC האוניברסיטה.
1. דרישות חדר
- Secure חדר נוהל שמפעיל מים חמים וקרים, ודרך להסיר את המים מהמכל, בדרך כלל ניקוז ברצפה.
- השתמש בשולחן עבודה שעליו להניח את מיכל הצלילה. מאז חדרים עם רצפה מרוקנת הם קווי מתאר בדרך כלל לניקוז, לצמצם את פקקי גומי ומניח אותם מתחת לרגלי השולחן על מנת להבטיח כי בראש הטבלה, ומכאן פני המים במכל, הוא ברמה.
טנק 2. צליל
- בניית טנק צלילה
- לבנות טנק מלבני (100 x 60 x 15 סנטימטר) באמצעות 3/4 בפרספקס העבה לתחתית ו1/2 בפרספקס לקירות הצדדיים (איור 1). באופן קבוע לצרף חתיכות פלסטיק מחוץ לטנק יחד באמצעות מלט cyanoacrylate או solvents כגון trichloromethane.
- מחלקים את הטנק לתוך 5 ערוצים כל כ 100 סנטימטר אורך, על ידי שימוש בפלסטיק נשלף 1/2 אינץ 'עבה לחתוך לחתיכות 85 x 15 סנטימטר. באופן קבוע מקום חריצים בתחתית ושולים של המכל שלתוכו אפשר מחורר חוצצים ערוץ אלה למצב.
- להשעות חתיכות פלסטיק אופקיים מחוצצי הערוץ כדי ליצור "גג" למנהרה מתחת למים צלילה ".
- בפינה אחת של מקום טנק פלטפורמה נשלפת העלתה, "אזור הסיום", לחולדות לגרור מתוך המים ולנוח בין ניסויים שחיה וצלילה. חולדות בדרך כלל חתן עצמם ולהסיר מים מהפרווה שלהם בזמן באזור הסיום. הנח צדדים גבוהים מסביב לקצוות של אזור הסיום כדי להבטיח את החולדות להישאר בפלטפורמה בין ניסויי אימונים.
- בפינה הנגדית של הטנק מאזור הסיום במקום קאמרי המאפשר גישה רק מתחת למים למבוך. זה נשלף "להתחילRea "משמש רק לניסויי צלילה.
הערה: בתחילת משפט צלילת חולדה היא הורידה למים בעת שישבה על פלטפורמה בתוך תא ההתחלה; מכאן פלטפורמה זו נקראת "המעלית".
הערה: השתמש בעיצוב מודולרי, שבו אזור ההתחלה, אזור הסיום, וכל מחיצות הערוצים הם נשלפים מהטנק. זה נעשה משתי סיבות: 1) כדי להקל על מילוי וריקון המכל עם מים לאחר הסרת כל מחיצות הערוץ, ו 2) אם חולדה מקבלת מבולבלת, במיוחד בזמן מתחת למים, ניתן לפרק את החלקים במהירות כדי להציל את העכברוש מ מים.
- מלא ורוקנו את המכל עם מים
- מילוי המכל במים
- בתחילת כל אימון, למלא את המכל במים ברז C 32 ° טריים עד לעומק של כ -12 סנטימטר. מערבבים את המים במכל כדי למזער כיסים חמים או קרים.
הערה: בדרך כלל זה לוקח בערך שעה 2 להכשיר 12 חולדות. במהלך תקופה זוטמפרטורת מים יורדת בכ -4 מעלות צלזיוס. בסוף אימון המים מתקרר לכ -28 מעלות צלזיוס. מאז 30 המים ° C הוא thermoneutral לחולדות, שימוש במים חמים זה, ולא מים בטמפרטורת חדר, יהיה להקטין את איבוד חום במהלך אימון חוזר ונשנה.
- בתחילת כל אימון, למלא את המכל במים ברז C 32 ° טריים עד לעומק של כ -12 סנטימטר. מערבבים את המים במכל כדי למזער כיסים חמים או קרים.
- לרוקן את המכל עם מים
- בסופו של כל אימון, לנקז את המים מהמכל באמצעות צינור גדול, כמו חתיכה באורך 4 מ 'של צינורות בקוטר פנימי 1 אינץ'. לחלוטין להטביע את צינורות במכל, הבטחה אין כיסי אוויר בצינור. עד מהרה את מקום קצה אחד של הצינור לניקוז הרצפה. אפקט היניקה וכתוצאה מכך יהיה לנקז את המים מהמכל.
- תוך שמירה על סוף הטנק של צינורות מתחת לפני שטח המים כדי לשמור על היניקה, להטות את הטנק בקצה כדי להקל על ניקוז של המים מלאים.
הערה: לחלופין, ולא הפריש, להתקין ברז ליד הבסיס של הטנק, ולהתחברצינור מהמכל ברז לניקוז הרצפה.
- מילוי המכל במים
3. שיקולי העכברוש אלרגן
- ללבוש כפפות חד פעמיות בכל פעם שהטיפול ואימון החולדות. הכפפות יגבילו מגע עם המים במכל, שתמיד יכיל שתן חולדה.
הערה: החולדות יהפכו רטובות במהלך האימון, והחדר יהיה מלא בריח "רטוב-עכברוש". כתוצאה מכך משטר מניעתי של אנטי-היסטמינים עלול למנוע או להגביל את השפעתם של אלרגיות חולדה. מאמנים יכולים גם צריכים ללבוש מסכות חד פעמיות אבק, או מסכות N95, הם צריכים להיות רגישים לאלרגנים חולדה.
4. אימוני השחייה
- אימון השחייה יומי
הערה: ניסיון אישי עולה כי חולדות צעירות ללמוד את המבוך טוב יותר ומהר יותר, וכך מתחילות את האימון עם חולדות נגמלו חדש 35 g הוא עדיף על שימוש בחולדות מבוגרות.- מלא את המכל במים. ראה 2.2.1.
- גימור הכנסחוצצים אזור וערוץ ליצירת 5 ערוצים שחייה.
- במהלך האימון הראשון בעדינות להוריד את החולדות על ידי יד למים כ 3-5 סנטימטר מאזור הסיום.
הערה: עם כניסתה שלהם לחולדות מים תופיע לא יציבה כפי שהם נתקלים בתחושה של ריחוף ראשון. החולדות לחתור באורח בלתי-מתואם בעת שניסתה לאתר את דרך ליציאה מהמים, סופו של דבר להגיע לאזור הסיום בקרבת המקום. מפאת היכולת המולדת שלהם לשחות, בניסויים שלאחר מכן החולדות לשחות באופן מתואם הרבה יותר לכיוון אזור הסיום.
הערה: תמיכה החולדות מלמטה כדי שהרגליים שלהם על ידי חוקרים. בעדינות להוריד את החולדות לתוך המים, ולתת להם לשחות הרחק מהיד, ולא להפיל אותם למים. - בין ניסויים לתת לחולדות להישאר באזור הסיום לדקות לפחות 1. זאת על מנת לאפשר לחולדות החתן ולחקור, כך שהם רואים באזור הסיום כמקום "בטוח"ללכת בין ניסויים. זאת בניגוד לתופס עכברוש שזה עתה סיים את משפט ומייד מניח אותו בגב במים כדי להתחיל את הניסוי הבא.
הערה: אל תשתמש בגמול חיצוני (כלומר, אוכל) במהלך האימון, כדי למנוע הפעלה של מעגלי תגמול במוח. - לאחר תקופת ההמתנה אזור הסיום, בעדינות להחזיק את חולדות דקות 1 לפני ביצוע הניסוי הבא. בעדינות לייבש את החולדות במגבת במהלך ההמתנה לפני משפט מאז כניסה החוזרת ונשנית למים יגרום לחולדות לקבל רטוב מאוד, ומייבש אותם יהיה למנוע היפותרמיה.
- חזור על 4.1.3. באמצעות 4.1.5. כדי להשלים 3 עד 5 ניסויים עבור כל חולדה להיות מאומנות במהלך אימון השחייה יומי.
- הסר את כל מחיצות הערוץ ולסיים שטח מהטנק.
- רוקן את המים מהמכל. ראה 2.2.2.
- לוח הזמנים של אימוני השחייה שבועית
- אימונים יומיים התנהגות (ראה 4.1.) 5 ימים בשבוע, באופן אידיאלי באותו הזמןבכל יום.
- להתחיל הניסוי הראשון ממרחק הצלחת משא ומתן ביום הקודם. להתחיל ניסויים השניה והשלישי בעל טווח מוגדל.
- עם כל אימון יומי לאחר מכן להגדיל את המרחק בין המקום בי החולדות ממוקמות באזור סיום המים ו. לכמה אימונים הראשונים להגדיל את המרחק הזה על ידי 5-10 סנטימטר. לאחר החולדות מופיעות יותר בנוח עם שחייה, להגדיל את המרחקים על ידי 30-50 סנטימטר.
- השתמש עליות גדולות יותר במרחקי שחייה ואילו החולדות שלמדו לשחות חלק ישר של ערוץ לשחות. בניגוד לכך, למד לשחות סיכת הראש הופך בין הערוצים עלולים לקחת 2-3 אימונים.
הערה: לעתים קרובות, בעת שהמתינה באזור הסיום, חולדות מחדש להיכנס למים לשחות, ו / או לצלול מתחת למים בראשם בזמן שעדיין יושבות על פלטפורמת אזור הסיום. - חזור על פרוטוקול אימון יומי זה במשך 3 שבועות כדי להבטיח שחיה מוצלחת של 5 הערוצים כולו.פרוטוקול אימונים חוזר על עצמו זה מבטיח את סיומו המוצלח של המבוך, במיוחד לאור עובדה במבוך כולל לסירוגין סיבובים חדים שמאלה וימינה.
הדרכת 5. צלילה
הערה: לאחר החולדות למדו לנהל משא ומתן שחייה במבוך בהצלחה הם מוכנים להתחיל אימוני צלילה.
- הכשרה ראשונית צלילה (יום הראשון)
- הכנס קאמרי התחלה. מלא את המכל במים (ראה 2.2.1.). מפלס מים להבטיח הוא 1 סנטימטר מתחת לפתח לאזור ההתחלה.
- הכנס אזור סיום וחוצצי ערוץ כדי ליצור 5 ערוצים שחייה.
- במהלך פגישת הצלילה הראשונה לאלף את החולדות להיות מושפלות על המעלית למים בתוך תא ההתחלה. גישה למבוך היא מהחלק התחתון של חדר ההתחלה. במפגש ראשון זה מפלס המים הוא נמוך מספיק כך החולדה בקלות יכולה לשחות מחדר ההתחלה למבוך. לאפשר העכברוש להמשיך חייה דרך המבוך לאזור הסיום.
- בין ניסויים לתת לחולדות להישאר באזור הסיום לדקות לפחות 1.
הערה: אל תשתמש בגמול חיצוני (כלומר, אוכל) במהלך האימון, כדי למנוע הפעלה של מעגלי תגמול במוח. - לאחר תקופת ההמתנה אזור הסיום, בעדינות להחזיק את חולדות דקות 1 לפני ביצוע הניסוי הבא. בעדינות לייבש את החולדות במגבת במהלך המתנה לפני משפט זה.
- חזור על 5.1.3. באמצעות 5.1.5. כדי להשלים 3 ניסויים עבור כל חולדה להיות מאומנות במהלך אימון צלילה ראשוני זה.
- הסר את כל מחיצות הערוץ, להתחיל קאמרי ולסיים שטח מהטנק.
- רוקן את המים מהמכל. ראה 2.2.2.
- הכשרה ראשונית צלילה (יום שני)
- הכנס קאמרי התחלה. מלא את המכל במים (ראה 2.2.1.). להבטיח רמת מים היא מעט מעל פתח לאזור ההתחלה.
- הכנס אזור סיום וחוצצי ערוץ כדי ליצור 5 ערוצים שחייה.
- במהלך הצלילה השנייהמושב מפלס המים ההכשרה הועלה, כך שכדי לצאת מחדר התחלת החולדה יש לטבול את ראשו מתחת לקצה של תא ההתחלה כדי להיכנס למבוך. חשוב על זה כצלילה הראשונה של החולדה. לאפשר העכברוש אז להמשיך חייה דרך המבוך לאזור הסיום.
- בואו החולדות להישאר באזור הסיום לדקות לפחות 1 בין ניסויים.
הערה: אל תשתמש בגמול חיצוני (כלומר, אוכל) במהלך האימון, כדי למנוע הפעלה של מעגלי תגמול במוח. - לאחר תקופת ההמתנה אזור הסיום, בעדינות להחזיק את חולדות דקות 1 לפני ביצוע הניסוי הבא. בעדינות לייבש את החולדות במגבת במהלך המתנה לפני משפט זה.
- חזור על 5.2.3. באמצעות 5.2.5. כדי להשלים 3 ניסויים עבור כל חולדה להיות מאומנות במהלך אימון הצלילה.
- הסר את כל מחיצות הערוץ, להתחיל קאמרי ולסיים שטח מהטנק.
- רוקן את המים מהמכל. ראה 2.2.2.
- אימון צלילה ראשוני (third יום)
- הכנס קאמרי התחלה. מלא את המכל במים (ראה 2.2.1.), על מנת להבטיח כי מפלס המים מעל לפתח לאזור ההתחלה.
- הכנס אזור סיום וחוצצי ערוץ כדי ליצור 5 ערוצים שחייה. מניחים פיסת הפלסטיק אופקית באופן מיידי מחוץ לאזור ההתחלה כדי ליצור מנהרת צלילה באורך 5 סנטימטר.
- במהלך אימון צלילה השלישי העכברוש יש לטבול את ראשו מתחת לקצה של תא ההתחלה ולשחות 5 סנטימטר מתחת למים כדי להגיע למים הפתוחים של הערוץ לשחות. לאפשר העכברוש אז להמשיך חייה דרך המבוך לאזור הסיום.
הערה: ברגע שהוצבה באזור ההתחלה, חולדות ליזום השקיעה מתחת למים שלהם, ובכך אלה נחשבים לצלילות "מרצון". - בואו החולדות להישאר באזור הסיום לדקות לפחות 1 בין ניסויים.
הערה: אל תשתמש בגמול חיצוני (כלומר, אוכל) במהלך האימון, כדי למנוע הפעלה של מעגלי תגמול במוח. - לאחר תקופת ההמתנה אזור הסיום, בעדינות להחזיק את חולדות דקות 1 לפני ביצוע הניסוי הבא. בעדינות לייבש את החולדות במגבת במהלך המתנה לפני משפט זה.
- חזור על 5.3.3. באמצעות 5.3.5. כדי להשלים 3 עד 5 ניסויים עבור כל חולדה להיות מאומנות במהלך אימון הצלילה.
- הסר את כל מחיצות הערוץ, להתחיל קאמרי ולסיים שטח מהטנק.
- רוקן את המים מהמכל. ראה 2.2.2.
- לוח הזמנים של אימוני צלילה שבועית
- לנהל אימונים יומיים (ראו 5.3.) 5 ימים בשבוע, באופן אידיאלי באותו הזמן בכל יום.
- להתחיל הניסוי הראשון ממרחק הצלחת משא ומתן ביום הקודם. להתחיל ניסויים השני והשלישי במרחק צלילה מוגבר.
- עם כל אימון יומי לאחר מכן להגדיל את אורך מנהרת הצלילה על ידי הוספת חוצצים אופקיים נוספים להאריך את מרחק החולדות צריכים לשחות מתחת למים. לתי העלייה כמה אימונים הראשוניםמרחק של 5-10 סנטימטרים. לאחר החולדות מופיעות יותר בנוח עם צלילה, להגדיל את המרחקים על ידי 30-50 סנטימטר.
הערה: אל overextend מרחק הצלילה ניסה במהלך ניסויים רצופים. במידת צורך, להרים את הקצה של עטיפת הערוץ האופקי כדי לספק מרחקי צלילה קצרים יותר. אם במהלך משפט צלילת חולדה אינה מגיעה לקצה מנהרת הצלילה ומתחילה להסתובב מתחת למים, במהירות להרים את תום כיסוי הערוץ ולאפשר העכברוש לעלות על פני השטח ולהמשיך לשחות. זה יאפשר לחולדה כדי להשלים מרחק צלילה ארוך יותר בהצלחה. חיזוק חיובי זה יהיה לשמור על החולדה לנוע קדימה במנהרה מתחת למים עם כל ניסוי צלילה. - השתמש עליות גדולות יותר במרחקי הצלילה בעוד החולדות לומדות לצלול חלק ישר של ערוץ לשחות. בניגוד לכך, לומד לצלול סביב סיכת הראש הופך בין הערוצים עלולים לקחת 2-3 אימונים.
הערה: לעתים קרובות, בעת שהמתין באזור הסיום, חולדות להזין מחדש את המים דואר לשחות, ו / או לצלול מתחת למים בראשם בזמן שעדיין יושבים על פלטפורמת אזור הסיום. - חזור על פרוטוקול אימון יומי זה במשך 3 שבועות כדי להבטיח צלילה מוצלחת של 5 הערוצים כולו. פרוטוקול אימונים חוזר על עצמו זה מבטיח את סיומו המוצלח של המבוך, במיוחד לאור עובדה במבוך כולל לסירוגין סיבובים חדים שמאלה וימינה.
הערה: לוח הזמנים של אימוני השחייה וצלילה 6 שבוע המלא עולה בקנה אחד עם הצמיחה של חולדות נגמלו חדש 35 גרם להגיע למשקל גוף של 300 גרם. - לאחר אימונים יומיים מלאים, והחולדות הוחזרו לכלוב בבית שלהם, להבטיח חולדות לייבש הפרווה שלהם במהירות באמצעות טיפוח, או אם יש צורך, הנח כרית חימום מתחת לכלוב שלהם כדי למנוע מהחולדות חמות עד שהפרווה שלהם היא יבשה.
6. וריאציות ניסויי
הערה: הכשרת הקמה ובעלי החיים הניסיונית הבסיסית שתוארה לעיל. עם זאת, אימון התנהגותי יחסי ציבור בלבדovides מודל לשימוש עם ניסיוני בטכניקות אחרות כדי לאסוף נתונים של עניין. פרוטוקולים בסיסיים שונה כדי לחקור היבטים מסוימים של תגובת הצלילה. דוגמאות לשינויים אלה, וכמה שיקולים לאיסוף נתונים תוך שימוש בטכניקות פיסיולוגיות וneuroanatomical אלה, הם כדלקמן.
- משדרי telemetric מושתלים
- לאחר השלמת ההכשרה, להשתמש משדרי telemetric זמינים מסחרי לשדר לחץ דם עורקים פועמים מחולדות שחיה וצלילה. לקבל את אישור IACUC המקומי לנהלים לגבי ניתוח ותהליך החלמה שאחרי ניתוח. פעל על פי הליכי ההשתלה שהוצעו על ידי החברה למשדרים שלהם, ולהבטיח התאוששות מלאה מהניתוח לפני החזרת החולדה למים.
- להבטיח את אנטנת קליטת אותות הרדיו נמצאת בקרבת מקום כאשר החולדה היא במים.
הערה: מים פוחתים באותות רדיו, ולכן מרחק ne אות הרדיועורכים לנסוע דרך המים הופך להיות גורם מגביל של ממדי הטנק. - השתמש בשרביט אנטנה שנערכה ביד, ולא אנטנה בגודל מלכודת עכברים, לעקוב העכברוש תוך כדי התקדמות במבוך. שמור את אנטנת השרביט בתוך 30 סנטימטר של החולדה כדי להבטיח שאות הרדיו לא הולכים לאיבוד בזמן שהעכברוש נמצא מתחת למים.
- נגרר Cannulae
- לעצב מחדש את מחיצות הערוץ וחתיכות אופקי יצירת תקרת מנהרת הצלילה כך ששבילי הצינורית לאורך מאחורי העכברוש במהלך התקדמותו במבוך.
הערה: העיצוב המודולרי של הערוצים הוא בעל חשיבות עליונה וגם לאפשר למהיר להתאושש מהעכברוש מהמבוך מתחת למים. אם קשיים וצינורית הפכו וחילצה מן החולדה, החולדה יכולה בקרוב לדמם החוצה בזמן מתחת למים אם הצינורית לא לחבר מחדש במהירות. - השתמש cannulae עורקים נגררים להקליט את לחץ דם בעורקים ובקצב לב בחולדות בהתנדבות צלילה. השתמש בפיסת 90 סנטימטר של PE50 כצינורית נגררת.
הערה: אורך צינורית זה מספיק זמן כדי לחבר את העכבר למתמר הלחץ תוך שהוא מאפשר את העכברוש כדי להתקדם במבוך, עדיין קצר מספיק כדי למזער את השטח מת צינורית וקרובה מספיק למתמר הלחץ כדי לאפשר לנאמנות מספקת של אות לחץ דם. - השתמש cannulae נגרר ורידים (או עורקים) להזריק סוכני תרופות כגון אגוניסטים ואנטגוניסטים הפאראסימפתטית ואוהדים, או להזריק קליעים נותבים או צבעים הקובעים את חלוקת תפוקת לב.
- לסגת דגימות דם מהחולדות באמצעות cannulae ורידים (או עורקים), בעוד שהחולדות מתחת למים כדי לקבוע את רמות קטכולאמינים מתחת למים או כימיה של דם.
הערה: מזער את האורך של הצינורית נגררת ולהסביר את השטח המת הצינורית בדם מושך.
- לעצב מחדש את מחיצות הערוץ וחתיכות אופקי יצירת תקרת מנהרת הצלילה כך ששבילי הצינורית לאורך מאחורי העכברוש במהלך התקדמותו במבוך.
- זיהוי של נוירונים בגזע המוח הופעל
- השתמש בזיהוי חיסוני של חלבון Fos לזיההאזורי fy הספציפיים של גזע המוח שהם חלק מתגובת הצלילה.
הערה: במהלך חניכה חוזרת ונשנית של רפלקס לב-ריאה, תאי עצב בגזע המוח שהם חלק מזה מעגל רפלקס יכול להיות מופעל ולייצר חלבון בשם Fos. - שוב ושוב לצלול חולדות במבוך כל 5 דקות לשעה 2 בסכום כולל של 24 צלילות.
הערה: גם בפרוטוקולים אחרים שגם גורמים לייצור Fos עצבי יכולה לשמש. כדי להימנע מהפעלה של תאי עצב בגזע המוח המעורבים בתגובה ללחץ, ההתנהגות שחוזרת על עצמו צריכה להיות כלול כחלק מהאימון התנהגותי.
- השתמש בזיהוי חיסוני של חלבון Fos לזיההאזורי fy הספציפיים של גזע המוח שהם חלק מתגובת הצלילה.
- רמות corticosterone הדם במהלך צלילה
- השתמש corticosterone כמדד לרמת ניסיון של חולדות לחץ במהלך שחייה וצלילה.
- כדי להשיג דם לצורך ניתוח corticosterone, לצייר 0.1 מיליליטר דגימות דם מוריד הזנב של חולדות 15 דקות לאחר 3 שוחה או צלילות מרצון.
הערה: ניסויים ראשוניים הראו כי 15 דקות היא suזמן fficient כדי לאפשר ייצור ושחרור של corticosterone למחזור הדם ולגרום לשיא ברמות corticosterone פלזמה. מאז יש לי רמות corticosterone מקצב צירקדי, לתזמן את כל הדם מושך באותו הזמן של יום והתכתב עם התזמון של אימונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השלמה מוצלחת של נהלי הדרכה שחייה וצלילה המתוארים יכולה להקטין את הלחץ שחווה חולדות כאשר לצלול מתחת למים. רמות corticosterone הדם מצביעות על כך שאימון יומי חוזר מקטין את stressfulness הקשורים לצלילה מרצון, וחולדות מאומנות למצוא צלילה לא יותר מלחיץ מאשר בטיפול יומי על ידי אדם (איור 2; 17). לעומת זאת, חולדות לא עבר הכשרה בפרוטוקול הצלילה למצוא צלילה מרצון מלחיץ (איור 2; 17). בנוסף, שתי חולדות מאומנות ולא מאומנים למצוא נאלצו צלילה להיות המלחיץ ביותר (איור 2; 17).
תגובות הלב וכלי הדם מחייה, צלילה מרצון וחולדות צלילה נאלצו נרשמו באמצעות התקנים מושתלים טלמטריה (איור 3; 8,17-20) וcannulae הנגרר (איור 4; 21-23). מייד עם רצוןשקיעה, ובמסגרת פעימה אחת, ירידות בקצב הלב ב- 78% ואומרים מקטין את לחץ דם בעורקים על ידי 25% 17. תוצאות אלו מראות כי חולדות בהתנדבות צלילה להציג את אותם שינויי קרדיו לראות בדרך כלל בבעלי חיים צלילה אחרים. cannulae עורקים הנגרר היה בשימוש להזריק אטרופין אנטגוניסט מוסקריניים, אשר מבטל את קצב הלב האיטי הקשורים לצלילה מרצון (איור 4: 21), ולקבוע את חלוקת תפוקת לב 22, כוללים זרימת דם במוח 23, במהלך צלילה מרצון. cannulae הנגרר יש גם שימש כדי להראות שחולדות להתעלם הגדלת היפוקסמיה עורקים וhypercapnia בזמן שהם שקועים 18, וכי קיימים מראש כונן chemoreceptor לא יהיה כל השפעה על תגובות לב וכלי דם לצלילה מרצון 21.
נוירונים בתוכי רבדים ושני של הקרן הגבית הלשדית הגחון (MDH) להביע את Fos דוריןg צלילה מרצון, ונוירונים אלה עשויים להוות ממסר מביא גזע המוח הראשוני של תגובת הצלילה (איור 5; 24). חשוב אזורי גזע המוח לב-ריאה שליטה, כגון אזור Pressor הזנב (רו"ח), בדד tractus הגרעין (NTS), מקורי לשד ventrolateral (RVLM), ואזורי peribrachial, כל תכנית מוגברת תיוג Fos במהלך צלילה מרצון בהשוואה לחייה 25. הנוירונים באזורי chemosensitive של גזע המוח להביע Fos לאחר זמן ארוך נאלץ צלילות 18.
איור 1:. סכמטי של טנק צליל טנק פרספקס (100 x 60 x 15 סנטימטר) שימש כדי ליצור מבוך פשוט בהיקף של חמישה ערוצים ארוכים 1 מ '. הטנק היה מלא במים ברז C ° 30, וחולדות בתחילה הוכשרו לnegotiatדואר המבוך על ידי שחייה על פני השטח של המים, מהאזור התחל (משמאל למעלה) לאזור הסיום (מימין למטה). החולדות אז הוכשרו לצלול במבוך, המשיך מתחת למים על ידי חתיכות פלסטיק אופקיים ממוקם 2-3 סנטימטר מתחת לפני המים. [נתון זה שונה מ26]
איור 2: מדידות corticosterone. דם שואב מורידי זנב חולדה שימש למדידת ריכוזי corticosterone (ממוצע ± SE) מחולדות שנותרו בכלובים שלהם (הנאיבית), חולדות טופלו במשך 10 דקות / יום (ידיות), חולדות מאומנת לשחות ולצלול (מיומן), וחולדות שלא קיבל כל הכשרה לשחות או לצלול (בקי). Corticosterone נמדד לאחר חולדות מאומנות השלימו אימוני השחייה שלהם (משמאל קבוצה של ברים), חולדות לאחר שהוכשרו השלימו div מרצונםהכשרת דואר (סט מרכז של ברים), ואחרי חולדות מאומנות שסיימה את הכשרתם בכפייה צלילה (מימין קבוצה של ברים). 1 מציין הערך גדול באופן משמעותי מנאיבי; 2 מצביעים על הערך גבוה יותר באופן משמעותי מידיות; 3 מצביעים על הערך גבוה יותר באופן משמעותי מהכשרה; * מצביע על כך שערך חולדות מאומנים בצלילה בכפייה הוא גדול יותר באופן משמעותי מאשר בצלילה מרצון. [נתון זה שונה מ17]
איור 3: עקבות לחץ דם עורקים ממשדרי telemetric עקבות נתונים גולמיים מראים לחץ דם עורקים פועמים במהלך חייה (בעמודה שמאלית), צלילה מרצון (עמודה אמצעית), וצלילה בכפייה (עמודה ימנית) מחולדות מאומנים לשחות ולצלול במבוך. (בשורה תחתונה) ומחולדות שלא הייתה לי traiהליך נינג (שורה העליונה). מתחת למים צלילה (הן מרצון ושקיעת כפייה) המיוצרים ברדיקרדיה מיידית ועליית התחלה איטית יותר בלחץ דם, ואילו חי על פני השטח של המים לא גרם לשינויי לב וכלי דם כגון. ברים תחת עקבות מצביעים על תקופות של שקיעה. הפסקות בעקבה מצביעות על תקופות שבן אות telemetric אבדה. [נתון זה שונה מ17]
איור 4: אטרופין מבטל ברדיקרדיה צלילה. הקלטות מקוריות של לחץ דם הפועם דם של חולדות בהתנדבות צלילה () לפני ו( ב ') לאחר אטרופין מראש טיפול. עקבות התקבלו באמצעות צינורית עורקים נגררת. לפני אטרופין מראש טיפול, לחץ דם ירד מעט על שקיעה, אבל לאתרנגולת עלתה ל גדול מלפני צלילה לשארית הצלילה. קצב לב נקבע ממרווחי לחץ דופק סמוכים. עם השקיעה הייתה ברדיקרדיה מיידית והמשמעותית שנשמרה למשך הצלילה. לאחר מצור הפאראסימפתטית על ידי אטרופין טיפול מקדים ברדיקרדיה חוסלה. הייתה גם עלייה בלחץ דם במהלך הצלילה. בר תחת העקבות מציין את התקופה של שקיעה. [McCulloch, לא פורסם]
איור 5: תיוג Fos בתוך MDH. Photomicrographs של קרן trigeminal הלשדית הגבי (MDH) ומערכת השדרה trigeminal (SP5) בחולדות מאומנות לצלול מתחת למים. (א) בחולדת שליטה ששוב ושוב לא לצלול אין תיוג Fos. (ב) בחולדת חיה יש מואר מאודייתכנו Fos תווית בMDH (חץ גדול) או גרעין paratrigeminal (חץ קטן) בתוך SP5. (ג) בחולדת צלילה יש יותר תיוג Fos ventrally בשני MDH (החץ הגדול) וגרעין paratrigeminal (חיצים קטנים) בהשוואה ל עכברוש שחייה ושליטה. הכנס בפנל () מציין את המיקום מקורי, זנב של לוחות AC. סרגל קנה מידה בC פנל הוא 100 מיקרומטר. [נתון זה שונה מ24]
איור 6: הופעל תאי עצב catecholaminergic מחולדות צלילה. Photomicrographs להראות medullas של עכברוש שאינו צלילת שליטה (A, C, ו- E) וחולדה בהתנדבות צלילה (B, D, ו- F). רקמת המוח הייתה מעובד immunohistologically עבור שני Foshydroxylase טירוזין ד (TH), הפקת somas TH חום וגרעיני Fos שחורים. ראשי חץ פתוחים לזהות נוירונים חיוביים TH-כותרת אחת, ואילו חצים מוצקים לזהות Fos + TH הנוירונים שכותרתו כפולים. נוירונים A1 מזוהים בנוירונים A ו- B C1 מזוהים ב- C ונוירונים ד A5 מזוהים בE ו- F. יותר Fos וTH כפול שכותרתו נראית בA1, C1, ואזורי A5 של עכברוש הצלילה מ בחולדה השליטה הלא הצלילה. בר כיול בE הוא לAF לוחות, והוא 250 מיקרומטר. בר כיול בהבלעה בF הוא עבור כל הריבועים, והוא 50 מיקרומטר. [נתון זה שונה מ26]
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חולדות ביכולים ליצור לטרפם ולעשות לנצל סביבות חצי מימיים, ולעתים קרובות היא לצלול מתחת למים כשהם מחפשים מזון למזון 6. כך שזה לא מפתיע גם שחולדות יכולות להיות בקלות רבה שהוכשרו לצלול מתחת למים בהתנדבות. נהלי ההכשרה המתוארות יכולים להימשך עד 6 שבועות, שיביאו חולדות נגמלו זה עתה לגודל גוף בשימוש ברוב אטלסי מוח חולדה בוגרת (~ 300 ז). כך המוח מהחיות מאולפות אלה יהיה יותר בקלות דומה למבנים אנטומיים שזוהו באטלסים אלה.
לאחר שיוצב באזור ההתחלה רוב החולדות יתחילו לשחות מתחת למים שלהם בתוך 20 שניות. עם זאת, מדי פעם חולדה תיקח עד 5 דקות או יותר לפני ביצוע הצלילה מרצונה. למרות שזה עשוי להיות מפתה בשלב זה כדי לאלץ את החולדות לתוך המנהרה מתחת למים, זה בדרך כלל יש להימנע כדי למנוע את החולדות משיוך המים עם חוויה שלילית. מכרסמים יכולים להיות עקשנים והוא רשאי initiברית מסרב לצלול במהלך האימונים, אבל ברגע שהם מבינים שהדרך היחידה לצאת מהמים היא על ידי השלמת הצלילה במבוך, הם בדרך כלל ליזום את הצלילות שלהם זמן קצר לאחר שיוצב באזור ההתחלה.
היבט קריטי של נהלי ההכשרה חוזר על עצמו ושיטתיים הוא שהם מתנהלים בצורה כזאת, כדי להפחית את הלחץ שחווה חולדות. נראה לתת חולדות לחקור את סביבתם, במיוחד בזמן באזור הגמר בין ניסויים, כדי להפחית את הלחץ עוד יותר. חולדות לעתים קרובות להזין מחדש את המים לשחות, ו / או לצלול מתחת למים בראשם בזמן שעדיין יושבות על פלטפורמת אזור הסיום. הדבר מצביע על כך חולדות אינן בהכרח מים מרתיעים. בנוסף, בזמן שהוא לא נדיר עבור חולדות לייצר כדוריות צואה שבחייה או צלילה, או בעת המתנה באזור הסיום, תוצאות אימונים יומיות בכדורי צואה פחות 17. באופן כללי פחות לחוץ החולדות במהלך האימון, פחות PEllets הם יפיקו. כל כדורי צואה, המיוצרים יוסרו מאזור המים או לסיים בהקדם האפשרי כדי לשמור על המים נקיים יחסית.
חולדות ייתכן שמדי פעם לקבל אפים מדממים בזמן שחי וצלילה, אשר עשוי להיות תוצאה של ניפוח של מים לתוך מעברי האף. המראה של דם יכול להיות בגלל לחצים האוסמוטי בתוך רירית האף. בעוד שבאזור הסיום בין ניסויי החולדות מטפחות את עצמן. כתוצאה מכך דם מהאף יכול לקבל מחדש על ראש החולדות וחוטם, נותן חולדות גוון אדמדם קל, בעיקר סביב העיניים, במהלך אימון. כמו כן, מדי פעם חולדה עלולה למצוא מלחיצות צלילה ו / או שיש לי חוויות צלילה שליליות (כלומר, על ידי להסתובב וללכת לאיבוד בזמן מתחת למים צלילה (ראה הערה אחרי 5.4.3. על איך למנוע את זה מלהתרחש)). בחולדות אלה פורפירין עשוי להופיע בזוויות עיניהם, איתות respons מתחדואר.
גודלו של מיכל הצלילה יהיה במידה מסוימת לקבוע את דרישות החדר. הטנק שתואר נועד חולדות לשחות 2-3 סנטימטר מתחת לפני השטח של המים דרך 5 מ 'פרספקס ארוך המבוך לתת משך חייה מתחת למים של 10-15 שניות 17,19,24,26,27. צריך להיות ניסוי שנועד למדוד את התגובות מצלילה למשך יותר זמן, או מצלילה עמוקה יותר מתחת למים, המכל ייתכן שיהיה הצורך עוצב מחדש. דרישות החדר ואז יכולות גם לשנות כדי שיתאימו לממדים של טנק תוכנן מחדש צלילה. אם אין ניקוז רצפה זמין בחדר ההליך, המים מהמכל יכולים להיות שנאספו במכל גדול, כגון אשפה 60 גל יכול, אז מה שיכול לרוקן במקומות אחרים בצורה נוחה.
טכניקת Fos יכולה להיות מנוצלת עם שיטות זיהוי עצבי אחרות כדי לזהות ולאפיין תאי עצב נוספים שהם חלק מהמעגל החשמלי של גזע המוח של תגובת הצלילה. לדוגמא,זיהוי Fos בשיתוף עם צביעת hydroxylase טירוזין זיהה נוירונים catecholaminergic בA1, C1, A2, A5 ואזורים תת-coeruleus (איור 6; 26), ותאי עצב globosa בתוך אזור A7 רוחב 26,27, אשר מופעלים בהתנדבות צלילה. כמו כן, זיהוי Fos בשיתוף עם רעלן כולרה נותב מדרדר זיהה גופי התא של motorneurons מחנק לב בתוך המבנה החיצוני של הגרעין לא קונקרטי שמופעלים בעת צלילה מרצון 20.
חוקר את שילוב העצבים המרכזי של תגובות לב-ריאה לצלילה הוא חשוב עבור מספר סיבות 6,8,28. תגובת הצלילה מאפשרת בעלי חיים, בני אדם ובכלל, להישאר מתחת למים מתחת למים מבלי לנשום לפרקי זמן ממושכים. תגובת הצלילה מייצגת ארגון מחדש פונקציונלי של שליטה בגזע המוח ההומיאוסטטית, ומדגימה אחד מהרשות הפלסטינית החזקה ביותרtterns של רפלקסים אוטונומיים שנצפו בבעלי חיים. תגובת הצלילה יכולה להיות גם מבחינה קלינית חשובה בבני אדם כחלק מרפלקס trigemino-לב, רפלקס אף ולוע, ו / או תסמונת מוות בעריסה. לבסוף, הבנה של המעגלים חשמליים שקיים בתוך המוח של חולדות תסייע לקבוע את קליפת המוח אותות מביא יכולים לשנות רפלקסים אוטונומיים בגזע המוח הבסיסי. כל השיקולים האלה להפוך את הלימוד של ההיבטים של תגובת צלילת היונקים המרכזיים כדאי ומעניין מיסודו. שימוש בהליכים המתוארים לאמן חולדות לצלול מתחת למים מרצון יאפשר חקירה טובה יותר של ההיבטים של תגובת צלילת היונקים יהיו יותר השימוש בנאלצו בעלי החיים צללו המרכזיים. סיבה לכך הוא הליכי הכשרה כמתואר 1) להפחית את ההפעלה של מערכת חשמלית במתח במערכת העצבים המרכזית, ו- 2) לא יפעילו מערכת העצבים המרכזית מעגלי גמול כי תגמולים חיצוניים אינם בשימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
הכותב הוא יועץ לStoelting חברה, וסיפק את העיצוב ומפרטים של McCulloch הצלילה טנק המבוך הכולל להם למטרות מסחריות.
Acknowledgments
מחקר נתמך על ידי מימון ממשרד אוניברסיטת המערב התיכון של תוכניות מחקר וממומנות. תודה גם למתקן במערב התיכון בבעלי חיים באוניברסיטה ואריק וורן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCulloch Diving Tank Maze | Stoelting Company | 60139 | |
| 1 inch internal diameter tubing | Fisher | 14-169-63 | Used to fill or drain tank |
| Plexiglas rodent restraint device (Economy flat bottomed restrainer) | Braintree | FB-M/L | For forced dives |
| Telemetric transmitters | DSI | Model PA-C40 (270-0040-008) | Used to transmit pulsatile arterial blood pressure |
| Hand-held antenna wand | DSI | Model RLA 3000 (272-5007) | Used to ensure radio antenna is near to transmitter while rat is negotiating underwater maze |
| Intramedic PE50, 0.023" ID | Fisher | 14-170-12B | Used as trailing arterial cannula |
| N95 mask - Moldex #2300N Series | Fisher | 19-003-246D | Used to limit inhalation of rat allergens |
References
- Butler, P. J., Jones, D. R. Advances in Comparative Physiology and Biochemistry. Lowenstein, O. 8, Academic Press. 179-364 (1982).
- Butler, P. J., Jones, D. R. Physiology of diving birds and mammals). Physiol. Rev. 77, 837-899 (1997).
- Butler, P. J. Metabolic regulation in diving birds and mammals. Resp. Physiol. Neurobiol. 141, 297-315 (2004).
- Foster, G. E., Sheel, A. W. The human diving response, its function, and its control. Scand. J. Med. Sci. Sports. 15, 3-12 (2005).
- Lindholm, P., Lundgren, C. E. G. The physiology and pathophysiology of human breath-hold diving. J. Appl. Physiol. 106, 284-292 (2009).
- McCulloch, P. F. Animal models for investigating the central control of the mammalian diving response. Front. Physiol. 3, 1-16 (2012).
- Krogh, A. The progress of physiology. Am. J. Physiol. 90, 243-251 (1929).
- Panneton, W. M., Gan, Q., Juric, R. The rat: a laboratory model for studies of the diving response. J. Appl. Physiol. 108, 811-820 (2010).
- Lin, Y. C. Autonomic nervous control of cardiovascular responses during diving in the rat. Am. J. Physiol. 227, 601-605 (1974).
- Lin, Y. C., Baker, D. G. Cardiac output and its distribution during diving in the rat. Am. J. Physiol. 228, 733-737 (1975).
- Huang, T. F., Peng, Y. I. Role of the chemoreceptors in diving bradycardia in the rat. Jap. J. Physiol. 26, 395-401 (1976).
- Fahlman, A., Bostrom, B. L., Dillon, K. H., Jones, D. R. The genetic component of the forced diving bradycardia response in mammals. Front. Physiol. 2, 1-7 (2011).
- Blix, A. S., Folkow, B. Handbook of Physiology. Shepher, J. T., Abboud, F. M. , American Physiological Society. 917-944 (1984).
- Kooyman, G. L. Diverse Divers. 200, Springer-Verlag. (1989).
- MacArthur, R. A., Karpan, C. M. Heart rates of muskrats diving under simulated field conditions: persistence of the bradycardia response and factors modifying its expression. Can. J. Zool. 67, 1783-1792 (1989).
- McCulloch, P. F., Jones, D. R. Cortical influences on diving bradycardia in muskrats (Ondatra zibethicus). Physiol. Zool. 63, 1098-1117 (1990).
- McCulloch, P. F., Dinovo, K. M., Connolly, T. M. The cardiovascular and endocrine responses to voluntary and forced diving in trained and untrained rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 298, 224-234 (2010).
- Panneton, W. M., Gan, Q., Dahms, T. E. Cardiorespiratory and neural consequences of rats brought past their aerobic dive limit. J. Appl. Physiol. 109, 1256-1269 (2010).
- Chotiyanonta, J. S., DiNovo, K. M., McCulloch, P. F. Bilateral sectioning of the anterior ethmoidal nerves does not eliminate the diving response in voluntarily diving rats. Physiol. Reports. 1, (2013).
- Panneton, W. M., Anch, A. M., Panneton, W. M., Gan, Q. Parasympathetic preganglionic cardiac motoneurons labeled after voluntary diving. Front. Physiol. 5, 1-10 (2014).
- McCulloch, P. F., Ollenberger, G. P., Bekar, L. K., West, N. H. Trigeminal and chemoreceptor contributions to bradycardia during voluntary dives in rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 273, 814-822 (1997).
- Ollenberger, G. P., Matte, G., Wilkinson, A. A., West, N. H. Relative distribution of blood flow in rats during surface and submerged swimming. Comp. Biochem. Physiol. A. 119, 271-277 (1998).
- Ollenberger, G. P., West, N. H. Distribution of regional cerebral blood flow in voluntarily diving rats. J. Exp. Biol. 201, 549-558 (1998).
- McCulloch, P. F. Activation of the trigeminal medullary dorsal horn during voluntary diving in rats. Brain Res. 1051, 194-198 (2005).
- Panneton, W. M., et al. Activation of brainstem neurons by underwater diving in the rat. Front. Physiol. 3, 1-13 (2012).
- McCulloch, P. F., Panneton, W. M. Activation of brainstem catecholaminergic neurons during voluntary diving in rats. Brain Res. 984, 42-53 (2003).
- McCulloch, P. F. Globosa neurons: a distinct subgroup of noradrenergic neurons in the caudal pons of rats. Brain Res. 964, 164-167 (2003).
- Panneton, W. M. The mammalian diving response: an enigmatic reflex to preserve life. Physiology. 28, 284-297 (2013).
