Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Trening Rats å frivillig Dive Underwater: Undersøkelser av pattedyr Diving Response

Published: November 12, 2014 doi: 10.3791/52093
Automatic Translation
1
1Department of Physiology, Midwestern University

Protocol

MERK: Eksperimentelle protokoller beskrevet her utført ved Midwestern Universitetet ble godkjent av Midwestern Universitetet IACUC.

1. Plass Krav

  1. Sikre en prosedyre rom som har innlagt varmt og kaldt vann, og en måte å fjerne vannet fra tanken, typisk en renne i gulvet.
  2. Bruk en studie bord som du kan plassere dykketanken. Siden rom med gulvavløp er vanligvis støpt drenering, kutte ned gummipropp og plassere dem under bordbeina for å sikre at bordplaten, og dermed vannoverflaten i tanken, er i vater.

2. Dykking Tank

  1. Dykking Tank Construction
    1. Konstruer en rektangulær tank (100 x 60 x 15 cm) under anvendelse av 3/4 i tykke pleksiglass for bunnen og 1/2 i pleksiglass for sideveggene (figur 1). Permanent feste utenfor Pleksiglass stykker av tanken sammen ved hjelp cyanoacrylate sement eller solvents som triklormetan.
    2. Del opp tanken inn fem kanaler hver ca 100 cm i lengde, ved å bruke flyttbare 1/2 tommers tykke plexiglass skåret i 85 x 15 cm store biter. Permanent plassere rillene i bunnen og kantene av tanken inn i hvilken kanal disse skillevegger kan være slisset i stilling.
    3. Suspen horisontale Pleksiglass stykker fra kanaldelere for å skape et "tak" for en undersjøisk dykk "tunnel.
    4. I det ene hjørnet av tanken sted en flyttbar hevet plattform, den "målområdet", for rotter å hale ut av vannet og hvile mellom svømming og dykking prøvelser. Rotter vanligvis stelle seg selv og fjerne vann fra pelsen mens i målområdet. Plasser høye kanter rundt kantene av målområdet for å sikre rottene forblir på plattformen mellom treningsforsøk.
    5. På den motsatte hjørne av tanken fra målområdet plassere et kammer som bare tillater undervanns tilgang til labyrinten. Denne flyttbare "starte enrea "brukes kun for dykker prøvelser.
      NB: I begynnelsen av en dykkerprøve en rotte blir senket ned i vannet mens man sitter på en plattform inne i startkammeret; derfor denne plattformen kalles "heis".
      MERK: Bruk en modulær design, hvor startområdet, målområdet, og alle kanaler skillevegger er avtagbart fra tanken. Dette gjøres av to grunner: 1) å legge til rette for fylling og tømming av tank med vann etter fjerning av alle kanaldelere, og 2) hvis en rotte blir desorientert, spesielt mens under vann, bitene kan raskt demonteres for å redde rotte fra vann.
  2. Fylling og tømming av tank med vann
    1. Fylle tanken med vann
      1. I begynnelsen av hver treningsøkt, fyll tanken med friskt 32 ° C varmt springvann til en dybde på ca 12 cm. Rør vannet i tanken for å minimere varme eller kule lommer.
        MERK: Vanligvis tar det ca 2 timer å trene 12 rotter. I løpet av denne tidenvanntemperaturen synker ved omtrent 4 ° C. Ved slutten av treningsøkten kjøler vannet til ca 28 ° C. Siden 30 ° C vann er termonøytralt til rotter, ved hjelp av denne varmt vann, heller enn romtemperatur vann, vil minimere varmetapet under repeterende trening.
    2. Tømming av tank med vann
      1. Ved slutten av hver trening, drenere vann fra tanken ved hjelp av en stor slange, slik som en 4 m lang stykke 1 cm indre diameter. Helt senk slangen i tanken, noe som sikrer ingen luftlommer er i slangen. Raskt å plassere den ene ende av slangen inn i gulvsluket. Den resulterende heverteffekt vil drenere vannet fra tanken.
      2. Mens holde tanken ende av røret under vannflaten for å opprettholde avsuging, vippes tank på kant for å lette fullstendig drenering av vannet.
        MERK: Alternativt, og i stedet for å snylte, installere en kran nær bunnen av tanken, og kobleen slange fra tanken på til sluk.

3. Rat Allergen Betraktninger

  1. Bruk engangshansker når du håndterer og trening av rotter. Hanskene vil begrense kontakten med vannet i tanken, noe som uunngåelig vil inneholde rotte urin.
    MERK: Rottene blir våte under trening, og rommet vil bli fylt med en "wet-rotte" lukt. Følgelig en profylaktisk regime av anti-histaminer kan forhindre eller begrense virkningene av rotte allergier. Trenere kan også bli nødt til å bruke engangsstøvmasker, eller N95 masker, bør de blir følsomme for rotte allergener.

4. Swim Training

  1. Daglig svømme trening
    MERK: Personlig erfaring tilsier at yngre rotter ut av labyrinten bedre og raskere, og dermed starter treningen med 35 g nylig avvent rotter er å foretrekke fremfor å bruke voksne rotter.
    1. Fyll tanken med vann. Se 2.2.1.
    2. Sett ferdigområdet og kanaldelere for å lage 5 svømmekanaler.
    3. Under den første treningsøkten senk rottene for hånd ned i vannet ca. 3-5 cm fra målområdet.
      MERK: Etter sin introduksjon til vann rotter vises ustø som de først møter følelsen av å flyte. Rottene vil padle rundt i en ukoordinert måte og samtidig prøver å finne en måte å avslutte vann, eventuelt nå den nærliggende målområdet. På grunn av sin medfødte evne til å svømme, i senere studier rottene vil svømme i en mye mer koordinert måte mot målområdet.
      MERK: Støtt rottene fra undersiden slik at føttene er på etterforskerne hender. Senk rottene i vannet, og la dem svømme bort fra hånden, i stedet for å slippe dem ut i vannet.
    4. Mellom forsøkene la rottene forbli i målområdet i minst 1 min. Dette er å la rottene å stelle og utforske, slik at de ser målområdet som en "sikker" plasså gå mellom forsøkene. Dette er i motsetning til å gripe en rotte som nettopp har gjennomført en prøveordning og umiddelbart plassere den tilbake i vannet for å starte neste rettssaken.
      MERK: Ikke bruk ekstern belønning (dvs. mat) under trening, slik som å hindre aktivering av belønningskretser i hjernen.
    5. Etter målområdet venteperioden, hold rottene for 1 min før du starter neste rettssaken. Forsiktig tørke rotter med et håndkle i løpet av denne pre-rettssaken hold siden repeterende inntreden i vannet vil føre til rotter å bli veldig våt, og tørker dem vil hindre hypotermi.
    6. Gjenta 4.1.3. gjennom 4.1.5. å fullføre 3 til 5 forsøk for hver rotte å bli trent under en daglig svømmetur treningsøkt.
    7. Fjern alle kanal skillevegger og avslutt området fra tanken.
    8. Tøm vannet fra tanken. Se 2.2.2.
  2. Ukentlig svømmetur treningsopplegg
    1. Gjennomføre daglige treningsøkter (se 4.1.) 5 dager per uke, gjerne på samme tidhver dag.
    2. Begynn den første rettssaken fra avstanden hell forhandlet på gårsdagen. Begynner det andre og tredje forsøk fra en øket avstand.
    3. Med hver påfølgende daglige treningsøkten øke avstanden mellom der blir rottene plassert i vannet og målområdet. For de første treningsøktene øke denne avstanden med 5-10 cm. Etter rottene virker mer komfortabel med svømming, øke avstanden med 30-50 cm.
    4. Bruke større Økninger i svømme avstander mens rottene lærer å svømme en rett del av en svømmetur kanal. I kontrast, lære å svømme hårnålssvinger mellom kanaler kan ta 2-3 treningsøkter.
      MERK: Ofte, mens du venter i målområdet, rotter vil gå inn igjen i vannet for å svømme, og / eller senke hodet under vann mens de fortsatt sitter på målområdet plattformen.
    5. Gjenta dette daglig trening protokoll over 3 uker for å sikre en vellykket svømming av hele fem kanaler.Denne repeterende trening protokollen sikrer vellykket gjennomføring av labyrinten, spesielt siden labyrinten inkluderer vekselvis venstre og høyre hårnålssvinger.

5. Dive Training

MERK: Etter at rottene har lært å lykkes forhandle svømming gjennom labyrinten de er klare til å starte dykketrening.

  1. Initial dykke trening (første dagen)
    1. Sett start kammeret. Fyll tanken med vann (se 2.2.1.). Sikre vannstanden er en cm under åpningen til startområdet.
    2. Sett målområdet og kanaldelere for å lage 5 svømmekanaler.
    3. Under den første dykking økt trene for å bli senket ned rottene på heisen i vannet inne i startkammeret. Tilgang til labyrinten er fra bunnen av startkammeret. I løpet av denne første sesjon er vannstanden er lav nok slik at rotten lett kan svømme fra starten kammeret inn i labyrinten. La rotte å fortsette svømming gjennom labyrinten tilmålområdet.
    4. Mellom forsøkene la rottene forbli i målområdet i minst 1 min.
      MERK: Ikke bruk ekstern belønning (dvs. mat) under trening, slik som å hindre aktivering av belønningskretser i hjernen.
    5. Etter målområdet venteperioden, hold rottene for 1 min før du starter neste rettssaken. Forsiktig tørke rotter med et håndkle i løpet av denne pre-rettssaken hold.
    6. Gjenta 5.1.3. gjennom 5.1.5. å fullføre 3-studier for hver rotte til å bli opplært i denne innledende dykk treningsøkt.
    7. Fjern alle kanaldelere, start kammer og avslutt området fra tanken.
    8. Tøm vannet fra tanken. Se 2.2.2.
  2. Initial dykke trening (andre dag)
    1. Sett start kammeret. Fyll tanken med vann (se 2.2.1.). Sikre vannstanden er litt over åpningen til startområdet.
    2. Sett målområdet og kanaldelere for å lage 5 svømmekanaler.
    3. Under den andre dykkettreningsøkt vannstanden har blitt hevet slik at for å gå ut av startkammeret rotta har å dyppe hodet under kanten på startkammeret for å gå inn i labyrinten. Tenk på dette som rotte første dykket. La rotte å fortsett deretter svømming gjennom labyrinten til målområdet.
    4. La rottene forbli i målområdet i minst ett min mellom forsøkene.
      MERK: Ikke bruk ekstern belønning (dvs. mat) under trening, slik som å hindre aktivering av belønningskretser i hjernen.
    5. Etter målområdet venteperioden, hold rottene for 1 min før du starter neste rettssaken. Forsiktig tørke rotter med et håndkle i løpet av denne pre-rettssaken hold.
    6. Gjenta 5.2.3. gjennom 5.2.5. å fullføre 3-studier for hver rotte å bli trent under dette dykket treningsøkt.
    7. Fjern alle kanaldelere, start kammer og avslutt området fra tanken.
    8. Tøm vannet fra tanken. Se 2.2.2.
  3. Initial dykke trening (tHird dag)
    1. Sett start kammeret. Fylle tanken med vann (se 2.2.1.), Slik at vann-nivået er over åpningen til startområdet.
    2. Sett målområdet og kanaldelere for å lage 5 svømmekanaler. Plasser en horisontal stykke pleksiglass umiddelbart utenfor startområdet for å skape en 5 cm lang tunnel dykking.
    3. I løpet av tredje dykket treningsøkt rotta har å dyppe hodet under kanten på startkammeret og svømme 5 cm under vann for å nå det åpne vannet av svømme-kanalen. La rotte å fortsett deretter svømming gjennom labyrinten til målområdet.
      MERK: Når plassert i startområdet, rotter starte sin egen undervanns nedsenkning, og dermed disse anses å være "frivillige" dykk.
    4. La rottene forbli i målområdet i minst ett min mellom forsøkene.
      MERK: Ikke bruk ekstern belønning (dvs. mat) under trening, slik som å hindre aktivering av belønningskretser i hjernen.
    5. Etter målområdet venteperioden, hold rottene for 1 min før du starter neste rettssaken. Forsiktig tørke rotter med et håndkle i løpet av denne pre-rettssaken hold.
    6. Gjenta 5.3.3. gjennom 5.3.5. å fullføre 3 til 5 forsøk for hver rotte å bli trent under dette dykket treningsøkt.
    7. Fjern alle kanaldelere, start kammer og avslutt området fra tanken.
    8. Tøm vannet fra tanken. Se 2.2.2.
  4. Ukentlig dykk treningsopplegg
    1. Gjennomføre daglige treningsøkter (se 5.3.) 5 dager per uke, helst på samme tid hver dag.
    2. Begynn den første rettssaken fra avstanden hell forhandlet på gårsdagen. Begynn den andre og tredje forsøk med en økt dykking avstand.
    3. Med hver etterfølgende daglige treningsøkt øke lengden på dykket tunnel ved å legge til flere horisontale skillevegger for å forlenge avstanden rottene har å svømme under vann. For første par treningsøkter økning this avstand med 5-10 cm. Etter rottene virker mer komfortabel med dykking, øke avstanden med 30-50 cm.
      MERK: Ikke anstrengt dykket avstand forsøkt under påfølgende studier. Hvis det er nødvendig å løfte opp den ende av kanalen dekselet horisontale å gi kortere dykke avstander. Hvis det under et dykk prøve en rotte ikke når slutten av dykket tunnel og begynner å snu under vann, raskt løft opp på slutten av dekselet kanalen og la rotta til overflaten og fortsette sin svømmetur. Dette vil gjøre det mulig rat å fullføre en lengre dykk avstand. Denne positiv forsterkning vil holde rotte fremover gjennom den undersjøiske tunnelen med hvert dykk rettssaken.
    4. Bruke større Økninger i dykke avstander mens rottene lærer å dykke en rett del av en svømmetur kanal. I kontrast, lære å dykke rundt hårnålssvinger mellom kanaler kan ta 2-3 treningsøkter.
      MERK: Ofte, mens du venter i målområdet, rotter vil gå inn igjen the vann å svømme, og / eller senke hodet under vann mens de fortsatt sitter på målområdet plattformen.
    5. Gjenta dette daglig trening protokoll over 3 uker for å sikre en vellykket dykking av hele fem kanaler. Denne repeterende trening protokollen sikrer vellykket gjennomføring av labyrinten, spesielt siden labyrinten inkluderer vekselvis venstre og høyre hårnålssvinger.
      MERK: Hele seks ukers svømme og dykke treningsopplegg sammenfaller med vekst på 35 g nylig avvent rotter til å nå en kroppsvekt på 300 g.
    6. Etter daglige treningsøkter er fullført, og rottene har blitt returnert til sine hjem bur, sørge for rotter raskt tørke pelsen gjennom grooming, eller om nødvendig, plassere en varmepute under deres bur for å holde rottene varm før pelsen er tørr.

6. Eksperimentelle Variasjoner

MERK: Den grunnleggende eksperimentelle oppsett og dyretrening har blitt beskrevet ovenfor. Men atferdstrening kun provides en modell som skal benyttes med andre eksperimentelle teknikker for å samle inn data av interesse. Grunnleggende protokoller er modifisert for å undersøke spesifikke aspekter av dykking respons. Eksempler på slike endringer, og noen betraktninger for innsamling av data ved hjelp av disse fysiologiske og nevroanatomi teknikker, er gitt nedenfor.

  1. Implanterbare tele Sendere
    1. Etter gjennomføring av trening, bruke kommersielt tilgjengelige telemetriske sendere å sende pulserende arterielt blodtrykk fra svømming og dykking rotter. Får lokal IACUC godkjenning for prosedyrer vedrørende kirurgi og postoperativ utvinning. Følg implantasjon prosedyrer foreslått av selskapet for deres senderen, og sikre fullstendig gjenoppretting fra kirurgi før retur rotte i vannet.
    2. Sørg for at antennen mottar radiosignalet er i nærheten når rotta er i vannet.
      MERK: Vann demper radiosignaler, og så avstanden radiosignalet needs å reise gjennom vannet blir en begrensende faktor av tankdimensjonene.
    3. Bruk en håndholdt antenne wand, snarere enn en rotte-bur størrelse antenne, for å følge rotte som det skrider frem gjennom labyrinten. Hold tryllestaven antenne innen 30 cm av rotte for å sikre at radiosignalet ikke går tapt mens rotta er under vann.
  2. Trailing Kanyler
    1. Redesign kanal skillevegger og horisontale stykker skaper taket av dykking tunnel slik at kanylen stier langs bak rotten i løpet av sin progresjon gjennom labyrinten.
      MERK: Det modulære designet av kanalene er av største betydning og må også tillate rask gjenopprette av rotte fra undervanns labyrint. Hvis en kanyle rifter og ble løsnet fra rotte, kunne rotten snart blø ut mens undervanns hvis kanylen er ikke raskt reattached.
    2. Bruk følgende arteriell kanyler til å spille inn arterielle blodtrykket og puls i frivillig dykke rotter. Bruk en 90 cm stykke PE50 somen etterfølgende kanyle.
      MERK: Dette kanyle lengden er lang nok til å koble rotte til trykkgiver som samtidig gir rotta å komme seg gjennom labyrinten, men er kort nok til å minimere kanyle dead plass og er nær nok til trykkgiveren å gi tilstrekkelig troskap av arterietrykk signal.
    3. Bruk følgende venøs (eller arteriell) kanyler til å injisere farmasøytiske midler, for eksempel parasympatiske og sympatiske agonister og antagonister, eller eventuelt tilføre sporstoffer eller fargestoffer som bestemmer fordelingen av blodsirkulasjon.
    4. Uttak av blodprøver fra rotter ved hjelp av den venøse (eller arterielt) kanyler mens rottene er under vann for å bestemme undervanns nivåer av katekolaminer eller blodkjemien.
      MERK: Reduser lengden på slepe kanyle og står for kanylen dead space når blod uavgjorte.
  3. Påvisning av Aktivert hjernestammen Nerveceller
    1. Bruk immunologisk påvisning av Fos-proteinet for å identify bestemte områder av hjernestammen som er en del av dykkrespons.
      MERK: Under repetitive initiering av en kardiorespiratorisk refleks, hjernestammen nevroner som er en del av at refleks krets kan bli aktivert og produsere et protein kalt Fos.
    2. Gjentagelser dykke rotter gjennom labyrinten hver 5 min i 2 timer for en total av 24 dykk.
      MERK: Andre protokoller som også induserer nevronale Fos produksjonen kan også brukes. For å unngå aktivering av hjernestammen nevroner involvert i respons på stress, bør atferd som gjentas inngå som en del av atferdstrening.
  4. Blood corticosterone Nivåer under Dykking
    1. Bruk corticosterone som en indikator på nivået av stress rotter opplevelse under bading og dykking.
    2. For å få blod for corticosterone analyse, tegne 0,1 ml blodprøver fra halevenen av rotter 15 min etter 3 frivillige svømmer eller dykk.
      MERK: Innledende forsøk viste at 15 min er sufficient tid for å tillate produksjon og frigjøring av corticosteron i sirkulasjonen og forårsake en topp i plasma corticosteron nivåene. Siden kortikosteron nivåer har en døgnrytme, planlegge alt blod trekker på samme tid på dagen og korresponderte med timingen av treningsøktene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vellykket gjennomføring av de beskrevne svømming og dykking trening rutiner kan redusere stress opplevd av rotter når dykking under vann. Blood kortikosteron nivåer indikerer at repetitive daglige trening reduserer stressfulness forbundet med frivillig dykking, og trente rottene finner dykking ikke mer stressende enn å bli håndtert daglig av et menneske (figur 2; 17). Omvendt, rotter ikke har opplæring i dykking protokollen finner frivillig dykking stressende (figur 2; 17). I tillegg finne både rotter trenet og utrenet tvunget dykking å være den mest belastende (Figur 2; 17).

De kardiovaskulære svar fra svømming, frivillig dykking og tvunget dykke rotter har blitt spilt inn ved hjelp av implanterte telemetri enheter (figur 3; 8,17-20) og etterfølgende kanyler (figur 4; 21-23). Umiddelbart etter frivilligneddykking, og innen en enkelt beat, puls reduseres med 78% og mener arterielle blodtrykket synker med 25% 17. Disse resultatene viser at frivillig dykke rotter viser samme cardiorespiratory endringene vanligvis sett i andre dykking dyr. Etterfølgende arterielle kanyle er blitt anvendt for å injisere den muskarine antagonisten atropin, noe som eliminerer bradykardi forbundet med frivillig dykking (figur 4; 21), og for å bestemme fordelingen av hjertets minuttvolum 22, inklusive cerebral blodstrøm 23, under frivillig dykking. Løpende kanyler har også blitt brukt for å vise at rotter ignorere økende arteriell hypoksemi og hyperkapni mens de er nedsenket 18, og at eksisterende chemoreceptor stasjonen ikke har noen effekt på hjerte- og svar på frivillig dykking 21.

Nevroner innenfor lameller I og II av ventral medullær dorsalhornet (MDH) uttrykker Fos During frivillig dykking, og disse nevronene kan utgjøre den første hjernestammen afferent relé av dykkerespons (figur 5; 24). Viktige hjernestammen cardiorespiratory kontrollområder, slik som hale soren området (CPA), nucleus tractus solitærplante (NTS), rostralt ventrolateral medulla (RVLM), og peribrachial regioner, alle viser økt Fos merking under frivillig dykking sammenliknet med svømming 25. Nevroner i kjemosensitiv regioner av hjernestammen uttrykke Fos etter lang varighet tvunget dykk 18.

Figur 1
Figur 1:. Skjematisk av Diving Tank A Pleksiglass tank (100 x 60 x 15 cm) ble brukt til å lage en enkel labyrint bestående av fem 1 m lange kanaler. Tanken ble fylt med 30 ° C varmt springvann, og rotter ble opprinnelig opplært til negotiate labyrinten ved å svømme på overflaten av vannet, fra Start-området (øverst til venstre) til mål-området (nederst til høyre). Rottene ble trenet til å dykke deretter gjennom labyrinten, holdt under vann ved hjelp av horisontale Plexiglas stykker plassert 2-3 cm under vannoverflaten. [Dette tallet har blitt forandret fra 26]

Figur 2
Figur 2: kortikosteron-målinger. Blood trekker fra rottehalevenene ble brukt til å måle kortikosteron konsentrasjoner (gjennomsnitt ± SE) fra rotter igjen i burene (naive), rotter behandlet i 10 min / dag (håndteres), rotter opplært til å svømme og dykke (trent), og rotter som mottok ingen svømme eller dykke trening (utrent). Corticosterone ble målt etter trente rottene hadde fullført sine svømme trening (Venstre satt av barer), hadde etter trente rotter fullført sin frivillig dive trening (senter sett barer), og etter trente rottene hadde fullført sin tvunget dykke trening (Høyre satt av barer). 1 indikerer verdien er betydelig større enn naive; 2 indikerer verdi er vesentlig større enn håndteres; 3 indikerer verdi er vesentlig større enn Opplært; * Viser at i Trained rotter verdi under tvang dykk er betydelig større enn under frivillig dykk. [Dette tallet har blitt forandret fra 17]

Figur 3
Figur 3: arterieblodtrykk spor fra telemetriske sendere rådata spor som viser pulserende arterielt blodtrykk under svømming (venstre kolonne), frivillig dykking (midterste kolonne), og tvang dykking (høyre kolonne) fra rotter opplært til å svømme og dykke gjennom labyrinten. (nederste linje) og fra rotter som ikke hadde hatt training prosedyre (øverste rad). Dykking undervanns (begge frivillig og tvungen nedsenkning) produserte en umiddelbar inntreden bradykardi og langsommere økning i arterielt trykk, mens svømmer på overflaten av vannet forårsaket ingen slike kardiovaskulære endringer. Linjene under spor indikerer perioder med nedsenkning. Brudd i spor indikerer perioder når telemetrisk signalet gikk tapt. [Dette tallet har blitt forandret fra 17]

Figur 4
Figur 4: Atropin eliminerer dykking bradykardi. Originale innspillinger av pulserende arterielt blodtrykk på frivillig dykke rotter (A) før og (B) etter atropin forbehandling. Spor ble erholdt ved hjelp av en etterfølgende arteriell kanyle. Før atropin forbehandling, arterietrykk sank svakt ved neddykking, men thøne øket til høyere enn pre-dykket i resten av dykket. Hjertefrekvens ble bestemt ut fra tilstøtende puls trykkintervaller. Ved neddykking det var en umiddelbar og betydelig bradykardi som ble opprettholdt under hele dykket. Etter parasympatiske blokade av atropin forbehandling bradykardi ble eliminert. Det var også en økning i blodtrykk under dykket. Linjen under spor indikerer perioden druknings. [McCulloch, upublisert]

Figur 5
Figur 5: Fos merking innenfor MDH. Photomicrographs av trigeminal medullær dorsalhornet (MDH) og spinal trigeminal kanalen (SP5) hos rotter opplært til å dykke under vann. (A) I en kontrollrotte som ikke gjentagelser dykke er det ingen Fos merking. (B) I en bade rat det er veldig tenttle Fos etiketten i MDH (store pilspiss) eller paratrigeminal nucleus (liten pil) innen SP5. (C) I en dykker rat det er mer Fos merking ventralt i både MDH (store pilspiss) og paratrigeminal nucleus (små piler) sammenlignet med svømming og kontroll rotte. Sett i panelet (A) indikerer den rostrokaudale plassering av panelene AC. Scale bar i panel C er 100 mikrometer. [Dette tallet har blitt forandret fra 24]

Figur 6
Figur 6: Aktivert catecholaminergic nevroner fra dykking rotter. Mikrofotografiene viser medullas av et ikke-dykking kontrollrotte (A, C og E) og en frivillig dykker rotte (B, D og F). Hjernevevet ble immunohistologically behandlet for både Fos end tyrosin-hydroksylase (TH), og produserer TH Somas brune og sorte Fos kjerner. Åpne pilspisser identifisere enkelt merket TH-positive nevroner, mens solide piler identifisere Fos + TH dobbel-merket nevroner. A1 neuroner er identifisert i A og B. C1 neuroner er identifisert i C og D. A5 neuroner er identifisert i E og F. Flere Fos og TH dobbeltmerket er sett i A1, C1, og A5 regioner av rotte enn dykke i den ikke-dykking kontrollrotte. Kalibrering bar i E er for paneler AF, og er 250 mikrometer. Kalibrering bar i innfelt i F er for alle innfellinger, og er 50 mikrometer. [Dette tallet har blitt forandret fra 26]

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rotter i deres feral skjemaet kan og vil utnytte semi-akvatiske miljøer, og vil ofte dykke under vann mens foraging for mat 6. Det er derfor ikke så overraskende at rotter kan være veldig lett trent til frivillig dykke under vann. De beskrevne opplæringsprosedyrer kan vare opptil seks uker, noe som vil bringe nylig avvent rotter til en kroppsstørrelse som brukes i de fleste voksen rottehjerne atlas (~ 300 g). Således hjernene fra disse dyrene trenet vil lettere sammenlignbare med de anatomiske strukturer som er identifisert i disse atlas.

Etter å ha blitt plassert i startområdet fleste rotter vil starte sin undervanns svømme innen 20 sek. Men noen ganger en rotte vil ta opp til 5 minutter eller mer før du starter sitt frivillige dykk. Mens det kan være fristende på dette trinn for å tvinge rottene inn i undersjøisk tunnel, er dette generelt bør unngås for å hindre rotter i å assosiere vannet med en negativ erfaring. Gnagere kan være sta og kan tt ig ngalliert nekter å dykke under treningene, men når de innser den eneste måten å gå ut av vannet, er å fylle dykket gjennom labyrinten, de vanligvis initiere sine dykk snart etter å ha blitt plassert i startområdet.

Et kritisk aspekt av de repeterende og metodisk opplæring fremgangsmåter er at de er utført på en slik måte for å redusere stress opplevd av rottene. La rotter utforske sine omgivelser, spesielt mens i målområdet mellom forsøkene, ser ut til å redusere stress. Rotter vil ofte gå inn igjen i vannet for å svømme, og / eller senke hodet under vann mens de fortsatt sitter på målområdet plattformen. Dette tyder på at rotter er ikke iboende vann motvilje. I tillegg, mens det ikke er uvanlig for rotter å produsere ekskrementpelletene under bading eller dykking, eller når venter i målområdet, daglige trening fører igjen til færre ekskrementpelletene 17. Generelt mindre stresset rottene er under trening, jo færre pefilet de vil produsere. Eventuelle fekale pelleter som er produsert blir fjernet fra vannet eller målområdet så snart som mulig for å holde vannet forholdsvis ren.

Rotter kan av og til få blodig nese mens svømming og dykking, som kan være et resultat av innblåsing av vann inn i nesegangene. Utseendet av blod kan være på grunn av osmotiske spenninger i neseslimhinnen. Mens i målområdet mellom forsøkene rottene vil stelle seg selv. Som en konsekvens blod fra nesen kan bli omfordelt over rotter hode og snute, noe som gir rottene et svakt rødlig skjær, spesielt rundt øynene, i løpet av en treningsøkt. Dessuten kan en og annen rotte finne dykking stressende og / eller har negative dykkeopplevelser (dvs., ved å snu rundt og får mistet under dykking under vann (se notat etter 5.4.3. Om hvordan du kan forhindre at dette skjer)). I disse rottene porfyrin kan vises i hjørnene av øynene deres, signaliserer en stress response.

Størrelsen av dykker tank vil i noen grad bestemme kravene ingen. Den beskrevne tank er konstruert for å ha rotter svømme 2-3 cm under overflaten av vannet gjennom en 5 m lang pleksiglass labyrint for å gi en undervannssvømming varighet på 10-15 sek 17,19,24,26,27. Skulle et eksperiment være utformet for å måle respons fra en lengre varighet dykk, eller fra et dypere dykk under vann, kan tanken må re-designet. Rom-krav kan da også endre for å passe dimensjonene på en re-designet dykkertank. Hvis det ikke er tilgjengelig gulvsluk i prosedyren rommet, kan vannet fra tanken bli samlet i en stor beholder, for eksempel en 60 gal søppel kan, som deretter kan tømmes andre steder på en praktisk måte.

Den Fos teknikken kan benyttes med andre neuronal påvisningsmetoder for ytterligere å identifisere og karakterisere nevroner som er en del av kretsen i hjernestammen dykk respons. For eksempel,Fos deteksjon i forbindelse med tyrosinhydroksylase farging har identifisert catecholaminergic nevroner i A1, C1, A2, A5 og sub-coeruleus områder (figur 6; 26), og globosa neuroner innenfor den laterale A7 området 26,27, som aktiveres under frivillig dykking. Dessuten har Fos deteksjon i forbindelse med den retrograde tracer koleratoksin identifiserte cellen organer av hjerte vagale motorneurons innenfor den ytre dannelsen av kjernen ambiguus som er aktivert i løpet av 20 frivillige dykking.

Utforskning av sentralnerve integrering av de cardiorespiratory responser til dykking er viktig for en rekke årsaker 6,8,28. Dykkeresponsen gjør at dyr, inkludert mennesker, å forbli under vann uten å puste i lengre perioder av gangen. Dykkrespons representerer en funksjonell reorganisering av hjernestammen homeostatisk kontroll, og demonstrerer en av de mektigste patterns av autonome reflekser observert hos dyr. Dykkeresponsen kan også være viktig klinisk hos mennesker som en del av trigemino-hjerte refleks, nasofaryngealt refleks, og / eller krybbedød. Til slutt vil en forståelse av nevronale kretser som eksisterer innenfor hjernestammen til rotter å fastslå hvor kortikal afferente signaler kan endre grunnleggende hjernestammen autonome reflekser. Alle disse hensynene gjør studie av de sentrale aspektene av pattedyr dykking respons iboende verdt og interessant. Ved hjelp av de beskrevne prosedyrer for å trene rotter til frivillig å dykke under vann vil tillate bedre etterforskning av de sentrale aspektene av pattedyr dykking respons enn vil bruk av tvang dykket dyr. Dette er fordi de treningsprosedyrer som beskrevet 1) reduserer aktivering av CNS-spenningskrets, og 2) aktiverer ikke CNS belønning kretser fordi eksterne premier ikke blir brukt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren er en konsulent for Stoelting Company, og gitt den generelle design og spesifikasjoner for McCulloch Dive Tank Maze til dem for kommersielle formål.

Acknowledgments

Forskning støttet av midler fra Midwestern Universitetet Office of Forskning og sponsede programmer. Takk også til Midwestern Universitetet Animal Facility og Erik Warren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
McCulloch Diving Tank Maze Stoelting Company 60139
1 inch internal diameter tubing  Fisher 14-169-63 Used to fill or drain tank
Plexiglas rodent restraint device (Economy flat bottomed restrainer) Braintree FB-M/L  For forced dives
Telemetric transmitters  DSI Model PA-C40 (270-0040-008) Used to transmit pulsatile arterial blood pressure
Hand-held antenna wand DSI Model RLA 3000 (272-5007) Used to ensure radio antenna is near to transmitter while rat is negotiating underwater maze
Intramedic PE50, 0.023" ID Fisher 14-170-12B Used as trailing arterial cannula
N95 mask - Moldex #2300N Series Fisher 19-003-246D Used to limit inhalation of rat allergens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butler, P. J., Jones, D. R. Advances in Comparative Physiology and Biochemistry. Lowenstein, O. 8, Academic Press. 179-364 (1982).
  2. Butler, P. J., Jones, D. R. Physiology of diving birds and mammals). Physiol. Rev. 77, 837-899 (1997).
  3. Butler, P. J. Metabolic regulation in diving birds and mammals. Resp. Physiol. Neurobiol. 141, 297-315 (2004).
  4. Foster, G. E., Sheel, A. W. The human diving response, its function, and its control. Scand. J. Med. Sci. Sports. 15, 3-12 (2005).
  5. Lindholm, P., Lundgren, C. E. G. The physiology and pathophysiology of human breath-hold diving. J. Appl. Physiol. 106, 284-292 (2009).
  6. McCulloch, P. F. Animal models for investigating the central control of the mammalian diving response. Front. Physiol. 3, 1-16 (2012).
  7. Krogh, A. The progress of physiology. Am. J. Physiol. 90, 243-251 (1929).
  8. Panneton, W. M., Gan, Q., Juric, R. The rat: a laboratory model for studies of the diving response. J. Appl. Physiol. 108, 811-820 (2010).
  9. Lin, Y. C. Autonomic nervous control of cardiovascular responses during diving in the rat. Am. J. Physiol. 227, 601-605 (1974).
  10. Lin, Y. C., Baker, D. G. Cardiac output and its distribution during diving in the rat. Am. J. Physiol. 228, 733-737 (1975).
  11. Huang, T. F., Peng, Y. I. Role of the chemoreceptors in diving bradycardia in the rat. Jap. J. Physiol. 26, 395-401 (1976).
  12. Fahlman, A., Bostrom, B. L., Dillon, K. H., Jones, D. R. The genetic component of the forced diving bradycardia response in mammals. Front. Physiol. 2, 1-7 (2011).
  13. Blix, A. S., Folkow, B. Handbook of Physiology. Shepher, J. T., Abboud, F. M. , American Physiological Society. 917-944 (1984).
  14. Kooyman, G. L. Diverse Divers. 200, Springer-Verlag. (1989).
  15. MacArthur, R. A., Karpan, C. M. Heart rates of muskrats diving under simulated field conditions: persistence of the bradycardia response and factors modifying its expression. Can. J. Zool. 67, 1783-1792 (1989).
  16. McCulloch, P. F., Jones, D. R. Cortical influences on diving bradycardia in muskrats (Ondatra zibethicus). Physiol. Zool. 63, 1098-1117 (1990).
  17. McCulloch, P. F., Dinovo, K. M., Connolly, T. M. The cardiovascular and endocrine responses to voluntary and forced diving in trained and untrained rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 298, 224-234 (2010).
  18. Panneton, W. M., Gan, Q., Dahms, T. E. Cardiorespiratory and neural consequences of rats brought past their aerobic dive limit. J. Appl. Physiol. 109, 1256-1269 (2010).
  19. Chotiyanonta, J. S., DiNovo, K. M., McCulloch, P. F. Bilateral sectioning of the anterior ethmoidal nerves does not eliminate the diving response in voluntarily diving rats. Physiol. Reports. 1, (2013).
  20. Panneton, W. M., Anch, A. M., Panneton, W. M., Gan, Q. Parasympathetic preganglionic cardiac motoneurons labeled after voluntary diving. Front. Physiol. 5, 1-10 (2014).
  21. McCulloch, P. F., Ollenberger, G. P., Bekar, L. K., West, N. H. Trigeminal and chemoreceptor contributions to bradycardia during voluntary dives in rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 273, 814-822 (1997).
  22. Ollenberger, G. P., Matte, G., Wilkinson, A. A., West, N. H. Relative distribution of blood flow in rats during surface and submerged swimming. Comp. Biochem. Physiol. A. 119, 271-277 (1998).
  23. Ollenberger, G. P., West, N. H. Distribution of regional cerebral blood flow in voluntarily diving rats. J. Exp. Biol. 201, 549-558 (1998).
  24. McCulloch, P. F. Activation of the trigeminal medullary dorsal horn during voluntary diving in rats. Brain Res. 1051, 194-198 (2005).
  25. Panneton, W. M., et al. Activation of brainstem neurons by underwater diving in the rat. Front. Physiol. 3, 1-13 (2012).
  26. McCulloch, P. F., Panneton, W. M. Activation of brainstem catecholaminergic neurons during voluntary diving in rats. Brain Res. 984, 42-53 (2003).
  27. McCulloch, P. F. Globosa neurons: a distinct subgroup of noradrenergic neurons in the caudal pons of rats. Brain Res. 964, 164-167 (2003).
  28. Panneton, W. M. The mammalian diving response: an enigmatic reflex to preserve life. Physiology. 28, 284-297 (2013).

Tags

Atferd Rat, Frivillig dykking dykking respons dykking refleks autonom refleks sentral integrering
Trening Rats å frivillig Dive Underwater: Undersøkelser av pattedyr Diving Response
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCulloch, P. F. Training Rats to… More

McCulloch, P. F. Training Rats to Voluntarily Dive Underwater: Investigations of the Mammalian Diving Response. J. Vis. Exp. (93), e52093, doi:10.3791/52093 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter