शाही सेना अनुक्रमण विश्लेषण द्वारा EML Hematopoietic अग्रदूत साबित कोशिकाओं में आत्म नवीकरण और भेदभाव विनियमन मुख्य कारक की पहचान
Summary
शाही सेना अनुक्रमण और जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण माउस EMLcells की लिन-CD34 + और लिन-CD34- उप-जनसंख्या में काफी और विभिन्न व्यक्त प्रतिलेखन कारक की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया. ये प्रतिलेखन कारक स्वयं renewing लिन-CD34 + और आंशिक रूप से भेदभाव लिन-CD34- कोशिकाओं के बीच स्विच निर्धारित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है.
Abstract
Hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (HSCs) ऐसे ल्यूकेमिया और लिम्फोमा के रूप में कई रोगों में एक मरीज की hematopoietic प्रणाली के पुनर्निर्माण के लिए प्रत्यारोपण उपचार के लिए चिकित्सकीय उपयोग किया जाता है. HSCs आत्म नवीकरण और भेदभाव को नियंत्रित तंत्र elucidating अनुसंधान और नैदानिक उपयोगों के लिए HSCs के आवेदन के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, यह कारण इन विट्रो में पैदा करना उनकी अक्षमता को HSCs की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए संभव नहीं है. इस बाधा को दूर करने के लिए, हम इस अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में, एक माउस अस्थि मज्जा व्युत्पन्न सेल लाइन, EML (erythroid, माइलॉयड, और Lymphocytic) सेल लाइन का इस्तेमाल किया.
शाही सेना अनुक्रमण (आरएनए Seq) तेजी से जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए माइक्रोएरे को बदलने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हम यहाँ EML सेल आत्म नवीकरण और भेदभाव के नियमन में संभावित महत्वपूर्ण कारकों की जांच के लिए शाही सेना Seq प्रौद्योगिकी के उपयोग की एक विस्तृत विधि की रिपोर्ट. इस पत्र में प्रदान प्रोटोकॉल को तीन भागों में बांटा गया है. पहला बराबरटी कैसे संस्कृति EML कोशिकाओं और अलग लिन-CD34 + और लिन-CD34- कोशिकाओं को बताते हैं. प्रोटोकॉल के दूसरे भाग में कुल शाही सेना की तैयारी और उच्च throughput अनुक्रमण के लिए बाद में पुस्तकालय निर्माण के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं प्रदान करता है. पिछले भाग आरएनए Seq डेटा विश्लेषण के लिए विधि का वर्णन करता है और लिन-CD34 + और लिन-CD34- कोशिकाओं के बीच विभिन्न व्यक्त प्रतिलेखन कारक की पहचान करने के लिए डेटा का उपयोग करने के लिए बताते हैं. सबसे महत्वपूर्ण विभिन्न व्यक्त प्रतिलेखन कारक EML सेल आत्म नवीकरण और भेदभाव को नियंत्रित संभावित कुंजी नियामकों होने की पहचान की गई. इस पत्र की चर्चा खंड में, हम इस प्रयोग के सफल प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण कदम पर प्रकाश डाला.
संक्षेप में, इस पत्र EML कोशिकाओं में आत्म नवीकरण और भेदभाव के संभावित नियामकों की पहचान करने के लिए शाही सेना Seq प्रौद्योगिकी का उपयोग करने का एक तरीका प्रदान करता है. पहचान महत्वपूर्ण कारक इन विट्रो और मैं में नीचे की ओर कार्यात्मक विश्लेषण के अधीन हैंएन विवो.
Introduction
Hematopoietic स्टेम सेल वयस्क अस्थि मज्जा आला में मुख्य रूप से रहते हैं कि दुर्लभ रक्त कोशिकाओं रहे हैं. वे रक्त की भरपाई करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं और प्रतिरक्षा प्रणाली 1 के उत्पादन के लिए जिम्मेदार हैं. स्टेम कोशिकाओं का एक प्रकार के रूप में, HSCs आत्म नवीकरण और भेदभाव दोनों में सक्षम हैं. HSCs के भाग्य का फैसला है कि नियंत्रण तंत्र elucidating, आत्म नवीकरण या भेदभाव या तो ओर, रक्त रोग शोध और नैदानिक उपयोग 2 के लिए HSCs के हेरफेर पर बहुमूल्य मार्गदर्शन प्रदान करेगी. शोधकर्ताओं द्वारा सामना की एक समस्या यह HSCs बनाए रखा और एक बहुत ही सीमित हद तक इन विट्रो में विस्तार किया जा सकता है; उनकी संतान के विशाल बहुमत आंशिक रूप से संस्कृति 2 में भेदभाव कर रहे हैं.
एक जीनोम व्यापक पैमाने पर आत्म नवीकरण और भेदभाव की प्रक्रियाओं को नियंत्रित कि प्रमुख नियामकों की पहचान करने के लिए, हम एक मॉडल प्रणाली के रूप में एक माउस आदिम hematopoietic पूर्वज सेल लाइन EML इस्तेमाल किया. गुसेल लाइन murine अस्थि मज्जा 3,4 से प्राप्त किया गया है. विभिन्न विकास कारकों से तंग आ चुके हैं, तो EML कोशिकाओं इन विट्रो 5 में एर्य्थ्रोइद, माइलॉयड, और ल्य्म्फोइड कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं. महत्वपूर्ण बात है, इस सेल लाइन संस्कृति के माध्यम से उनके multipotentiality बनाए रखना अभी भी स्टेम सेल कारक (एस सी एफ) युक्त और में बड़ी मात्रा में प्रचारित किया जा सकता है. EML कोशिकाओं स्वयं renewing लिन-एससीए + CD34 + के उप-जनसंख्या में विभाजित है और आंशिक रूप से सतह मार्कर CD34 और एससीए 6 पर आधारित लिन-एससीए-CD34- कोशिकाओं विभेदित किया जा सकता है. अल्पकालिक HSCs, एससीए + CD34 + कोशिकाओं के लिए इसी प्रकार आत्म नवीकरण के लिए सक्षम हैं. तेजी लिन-एससीए + CD34 + और लिन-एससीए-CD34- कोशिकाओं की एक मिश्रित आबादी पुनर्जन्म और 6 पैदा करना जारी रख सकते हैं एस सी एफ, लिन-एससीए + CD34 + कोशिकाओं के साथ व्यवहार करते हैं. दो आबादी आकृति विज्ञान में समान हैं और सी-किट mRNA और प्रोटीन 6 के समान स्तर है. लिन-एससीए-CD34- कोशिकाओं आईएल -3 के बजाय एस सी एफ 3 युक्त मीडिया में प्रचार करने में सक्षम हैं. Unveilinजी hematopoiesis दौरान जल्दी विकास संक्रमण में सेलुलर और आणविक तंत्र की बेहतर समझ प्रदान करेगी EML सेल भाग्य निर्णय में महत्वपूर्ण नियामकों.
आत्म नवीकरण लिन-एससीए + CD34 + और आंशिक रूप से भेदभाव लिन-एससीए-CD34- कोशिकाओं के बीच अंतर्निहित आणविक मतभेद की जांच करने के लिए, हम विभिन्न व्यक्त जीनों की पहचान करने के लिए शाही सेना Seq इस्तेमाल किया. प्रतिलेखन कारक सेल भाग्य का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण हैं के रूप में विशेष रूप से, हम, प्रतिलेखन कारक पर ध्यान केंद्रित. आरएनए Seq प्रोफ़ाइल और जीनोम 7,8 से लिखित RNAs यों (NGS) प्रौद्योगिकियों अगली पीढ़ी के अनुक्रमण की क्षमताओं का उपयोग एक हाल ही में विकसित दृष्टिकोण है. संक्षेप में, कुल शाही सेना है पाली-एक प्रारंभिक template.The शाही सेना टेम्पलेट फिर रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग सीडीएनए में बदल जाता है के रूप में चुना और खंडित. सीडीएनए पुस्तकालय के निर्माण के लिए बरकरार, गैर अपमानित शाही सेना का उपयोग, पूर्ण लंबाई शाही सेना टेप नक्शा करने के क्रम में महत्वपूर्ण है. पुर के लिएअनुक्रमण का ढोंग, विशिष्ट एडाप्टर दृश्यों सीडीएनए के दोनों सिरों को जोड़ रहे हैं. फिर, ज्यादातर मामलों में, सीडीएनए अणुओं पीसीआर द्वारा परिलक्षित कर रहे हैं और एक उच्च throughput ढंग से अनुक्रम.
अनुक्रमण के बाद, जिसके परिणामस्वरूप संदर्भ जीनोम और एक transcriptome डेटाबेस के लिए गठबंधन किया जा सकता है पढ़ता है. की संख्या संदर्भ जीन को मानचित्र में गिना जाता है और इस जानकारी जीन अभिव्यक्ति के स्तर का अनुमान किया जा सकता है कि पढ़ता है. यह भी गैर-मॉडल जीवों 9 में transcriptomes के अध्ययन को सक्षम करने, एक संदर्भ जीनोम के बिना नए सिरे से इकट्ठा किया जा सकता पढ़ता है. आरएनए-सेक तकनीक भी ब्याह isoforms 10-12, उपन्यास टेप 13 और जीन fusions 14 का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. प्रोटीन कोडिंग जीन का पता लगाने के अलावा, आरएनए Seq भी ऐसे ही गैर-कोडिंग RNAs के प्रतिलेखन स्तर उपन्यास का पता लगाने और विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लंबे समय siRNA आदि 18 आरएनए 15,16, microRNA 17, गैर-कोडिंग. क्योंकि टी कीइस विधि से वह शुद्धता, यह एकल nucleotide विविधताओं 19,20 का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया है.
आरएनए Seq प्रौद्योगिकी के आगमन से पहले, माइक्रोएरे जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया मुख्य विधि था. पूर्व डिजाइन जांच संश्लेषित और बाद में एक माइक्रोएरे स्लाइड 21 फार्म करने के लिए एक ठोस सतह से जुड़े होते हैं. mRNA के निकाले और सीडीएनए में बदल जाती है. रिवर्स प्रतिलेखन प्रक्रिया के दौरान, fluorescently लेबल न्यूक्लियोटाइड सीडीएनए में शामिल कर रहे हैं और सीडीएनए माइक्रोएरे स्लाइड पर संकरित किया जा सकता है. एक विशिष्ट स्थान से एकत्र संकेत की तीव्रता उस स्थान 21 पर विशिष्ट जांच के लिए बाध्य सीडीएनए की राशि पर निर्भर करता है. आरएनए Seq तकनीक के साथ तुलना में, माइक्रोएरे कई सीमाएं हैं. आरएनए Seq प्रौद्योगिकी इसके उपयोग करते समय जो सीमा सापेक्ष उच्च पृष्ठभूमि स्तर पर उपन्यास टेप पता लगाने में सक्षम है, जबकि पहले, माइक्रोएरे, जीन एनोटेशन के पूर्व मौजूदा ज्ञान पर निर्भर करता है जीईपूर्वोत्तर अभिव्यक्ति स्तर कम है. कारण पृष्ठभूमि और संकेतों की संतृप्ति के लिए, माइक्रोएरे की सटीकता दोनों अत्यधिक और नीच व्यक्त जीनों 7,22 के लिए सीमित है, जबकि इसके अलावा, आरएनए Seq प्रौद्योगिकी, पहचान (8,000 गुना) 7 की बहुत अधिक गतिशील रेंज है. अंत में, माइक्रोएरे जांच एक नमूना 23 के भीतर अलग टेप के रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना जब परिणाम कम विश्वसनीय बनाने के जो उनके संकरण क्षमता में भिन्न होते हैं. आरएनए Seq माइक्रोएरे पर कई फायदे हैं, अपने डेटा विश्लेषण जटिल है. यह कई शोधकर्ताओं ने अभी आरएनए seq के बजाय माइक्रोएरे का उपयोग करने वाले कारणों में से एक है. विभिन्न जैव सूचना विज्ञान उपकरण आरएनए Seq डाटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण 24 के लिए आवश्यकता होती है.
कई अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) प्लेटफॉर्म के अलावा, 454, Illumina, ठोस और आयन टोरेंट सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं. 454 पहला वाणिज्यिक NGS मंच था. अन्य अनुक्रमण प्लेटफार्मों के विपरीतऐसे Illumina और ठोस रूप में, 454 मंच पढ़ पाएंगे उत्पन्न लंबाई 25 (औसत 700 आधार पढ़ता है). कारण अब उच्च क्षमता 25 इकट्ठा उनके लिए transcriptiome के प्रारंभिक लक्षण वर्णन के लिए बेहतर हैं पढ़ता है. 454 मंच के मुख्य नुकसान अनुक्रम का megabase प्रति अपनी उच्च लागत है. उत्पन्न Illumina और ठोस प्लेटफार्मों बढ़ी संख्या और कम लंबाई के साथ पढ़ता है. अनुक्रम की megabase प्रति लागत 454 मंच की तुलना में काफी कम है. कारण Illumina और ठोस प्लेटफार्मों के लिए पढ़ता कम की बड़ी संख्या के लिए, डेटा विश्लेषण और अधिक computationally गहन है. आयन टोरेंट मंच के लिए अनुक्रमण के लिए साधन और अभिकर्मकों की कीमत सस्ती है और अनुक्रमण समय 25 कम है. हालांकि, त्रुटि दर और अनुक्रम की megabase प्रति लागत अधिक Illumina और ठोस प्लेटफार्मों की तुलना कर रहे हैं. विभिन्न प्लेटफार्मों के अपने फायदे और नुकसान हैं और डेटा विश्लेषण के लिए विभिन्न तरीकों की आवश्यकता होती है. पीएलएtform अनुक्रमण उद्देश्य और धन की उपलब्धता के आधार पर चुना जाना चाहिए.
इस पत्र में, हम एक उदाहरण के रूप Illumina आरएनए Seq मंच ले. हम EML सेल आत्म नवीकरण और भेदभाव में प्रमुख नियामकों की जांच के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में EML सेल का इस्तेमाल किया, और अभिव्यक्ति के स्तर गणना और उपन्यास प्रतिलिपि का पता लगाने के लिए शाही सेना Seq पुस्तकालय निर्माण और डेटा विश्लेषण का एक विस्तृत तरीकों प्रदान की. हम EML मॉडल प्रणाली 2 में आरएनए seq के अध्ययन, जब कार्यात्मक परीक्षण (जैसे shRNA पछाड़ना) hematopoietic भेदभाव की प्रारंभिक अवस्था के आणविक तंत्र को समझने में एक शक्तिशाली तरीका प्रदान के साथ मिलकर कि हमारे पिछले प्रकाशन में दिखाया गया है, और एक के रूप में सेवा कर सकते हैं सामान्य में सेल आत्म नवीकरण और भेदभाव के विश्लेषण के लिए मॉडल.
Protocol
Representative Results
Discussion
स्तनधारी transcriptome 34-38 बहुत जटिल है. आरएनए Seq प्रौद्योगिकी यह जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए अन्य तरीकों पर कई फायदे हैं transcriptome विश्लेषण, उपन्यास टेप का पता लगाने और एकल nucleotide भिन्नता खोज आदि के अध्ययन…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JQW, SZ, SD and KC are supported by grant from the National Institutes of Health and the Staman Ogilvie Fund—Memorial Hermann Foundation.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | BHK cell culture |
| Anti-Mouse CD34 FITC | eBioscience | 11-0341-81 | FACS sorting |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE | eBioscience | 12-5981-81 | FACS sorting |
| APC Mouse Lineage Antibody Cocktail | BD Biosciences | 558074 | FACS sorting |
| BD FACSAria Cell Sorter | BD Biosciences | Special offer sysmtem | FACS sorting |
| Corning™ Cell Culture Treated Flasks 75cm2 | Corning incorporated | 430641 | Cell culture |
| Corning™ Cell Culture Treated Flasks 25cm2 | Corning incorporated | 430639 | Cell culture |
| Deoxyribonuclease I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068-015 | Library preparation |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | BHK cell culture |
| DPBS | Gibco | 14190 | Cell culture |
| HI FBS | Invitrogen | 16140071 | BHK cell culture |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050-122 | EML cell culture |
| IMDM | HyClone | SH30228.02 | EML cell culture |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Cell culture |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Isolation of lineage negative cells |
| NanoVue Plus spectrophotometer | GE Healthcare | 28-9569-62 | Quality control |
| Thermo Scientific™ Napco™ 8000 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Scientific | 15-497-002 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | EML cell culture |
| TRIzol® Reagent | Invitrogen | 15596-018 | RNA exraction |
| TruSeq™ RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48rxn) | Illumina | RS-122-2002 | Library preparation |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939AA | Quality control |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | Cell culture |
| 0.45 µm Syringe Filters | Nalgene | 190-2545 | Cell culture |
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