Studera de tidigaste händelserna preneoplastisk cell progression och medfödda immunceller interaktion är avgörande för att förstå och behandla cancer. Här beskriver vi en metod för att villkor framkalla epitelceller transformationer och den efterföljande live-avbildning av medfödda immunceller interaktion med HRAS G12V uttrycker hudceller i zebrafisk larver.
Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.
Överväxt av en preneoplastisk cell avkomma inom en annars normal epitelark beror mycket på en interaktion med sin mikromiljö. Interaktionen med sin värd vävnaden kommer sannolikt att vara den avgörande faktorn för huruvida ett preneoplastisk cell har möjlighet att upprätta en klonal nisch att ytterligare utvecklas till ett fullskaligt cancer. Trots dess betydelse vid utveckling, är denna inledande fas av cancer progression otillgängliga i de flesta vanligen använda modellsystem in vivo.
Den zebrafisk, Danio rerio, är en väletablerad modellorganism för levande imaging studier på grund av dess öppenhet i hela utvecklingen, möjligheten för genetisk manipulation och tillgänglighet för vattenlösliga läkemedel. Nya studier med hjälp av en larvzebrafisk modell, som överuttrycker det mänskliga onkogen HRAS G12V att omvandla epitelceller, visade att värdcellen härstammar signaler, särskilt H2O 2 leder tillrekrytering av medfödda immunceller. Intressant, rekryterade immunceller, neutrofiler och makrofager, visade sig ha en trofisk roll för att stödja preneoplastisk celltillväxt 2,3.
För att förstå de tidiga händelserna i tumör initiering och progression samt bidrag ett inflammatoriskt svar, måste man kunna bilden dessa händelser från den tidigaste tidpunkten och framåt. Därför är det nödvändigt att kontrollera celltransformationer i en temporal och vävnadsspecifikt sätt. Vi utnyttjar Gal4 / UAS-system som har framgångsrikt anpassat från Drosophila 4 till villkor uttrycka människans onkogen HRAS G12V under kontroll av huden specifika promotorn keratin 4 (krt4) 5. Den modifierade versionen av den transkriptionella aktiva Gal4, nämligen KalTA4 6, möjliggör uttryck av HRAS G12V under kontroll av utvinningsaktiverande sekvensen (UAS). Att villkor inducera transkriptionsaktivator uttrycket har KalTA4 varit smält till mutant ligand-bindande domänen av humana östrogenreceptor α (ER T2) 7, som binder specifikt 4-hydroxitamoxifen (4-OHT) 1. I avsaknad av 4-OHT ER T2 är bunden i cytoplasman genom värmechockproteiner. Vid 4-OHT bindning av värmechocksproteiner dissociera, vilket tillåter en nukleär translokation av KalTA4-ER T2 och efterföljande aktivering av de UAS kontrollerade gen av intresse 8 (Figur 1C, b). Eftersom detta expressionssystem beror på närvaron av 4-OHT är KalTA4 kontrollerade uttrycket av en gen av intresse reversibel. I motsats till den Cre-ER T2 / Lox-systemet, vilket leder till en irreversibel rekombinationshändelse, är induktionen av transkriptionell aktivering genom KalTA4-ER T2 reversibel genom tillsats eller borttagande av 4-OHT.
Följande protokoll allo ws ett villkor transformation av hudceller i zebrafisk larver och en efterföljande övervakning av interaktionen med medfödda immunceller genom fluorescerande protein uttryck. De grundläggande metoder som används i detta protokoll liknar några vanliga tekniker inom zebrafisk samfundet 9-13.
Den generation och kombinato användning av transgena linjer tillsammans med mikroinjektion av transgena konstruktioner möjliggör en övergående inställning till endast omvandla enstaka celler i en mosaik sätt. Syrepermeabiliteten hos embryonala och larvzebrafisk huden ökar möjligheten för time-lapse levande imaging studier av högupplösande mikroskopi från timmar till dagar. Dessutom kommer tillgängligheten till vattenlösliga läkemedel att framtida mekanistiska studier och övervakning av cellbiologiska händelser in vivo som kan leda till en bättre förståelse av de tidigaste stadierna av cancerutveckling.
_content "> Detta protokoll kan anpassas för att utföra villkor genuttryck i alla vävnader av intresse för zebrafisk larver i en mosaik sätt. Man kan också optimera mikroskopet inställningen för att leva bild andra än huden djupare vävnader.Under embryogenes och larvutveckling, är den embryonala zebrafisk hud sammansatt av två epiteliala skikt, det ytliga skiktet kallas periderm och ett skikt av basala keratinocyter som är fästa till det underliggande basalmembranet 19 (Figur 1C, a). Protokollet presenteras här beskriver en enkel metod för att villkor framkalla preneoplastisk-celltransformation i ytliga hudlagret av zebrafisk larver, och möjliggör efterföljande interaktionsanalys med medfödda immunceller genom levande avbildning. De grundläggande metoder inom våra protokoll följer väletablerade zebrafisk tekniker 9-13, och våra protokoll kan enkelt anpassas och modifieras.
Den krt4 promotorn 5 används här driver KalTA4-ER T2 uttryck specifikt i det yttersta hudlagret (Figur 1C, b). Emellertid, det modulära Multisite Gatewaykloning strategi, som används för att generera krt4: KalTA4-ER T2 konstruktion (Figur 1D, a), ger möjlighet att klona någon promotor av intresse framför KalTA4-ER T2 i ett enda kloningssteg. En anpassning av metoden som presenteras häri är därför möjligt för de flesta vävnader under embryogenes och larvstadier. Tillgängligheten av promotorsekvenser är härmed den begränsande faktorn. Dessutom kan nästan alla gen av intresse klonad bakom en UAS vara villkoröveruttryckt i olika utvecklingsstadier genom användning av den rumsliga och tidsmässigt styrd KalTA4-ER T2 uttryck. Därför kan våra protokoll anpassas för att utföra villkor genuttryck i alla vävnader av intresse för zebrafisk larver i en mosaik sätt. Man kan också optimera mikroskopet inställningen för att leva bild djupare vävnader såsom lever eller bukspottkörtel.
Vi har beskrivit ett program med hjälp av protokollet hanre, på samma sätt kan man överuttrycker andra inflammations modulatorer använder detta protokoll för att studera regleringen av inflammatoriska svar, som man kan lätt sökarbilden neutrofila och makrofag beteendeförändringar efter induktion och gripandet i uttrycket av en kandidat inflammatorisk modulator. Dessutom skulle anpassat protokollet också vara till nytta för dem som vill spåra cellrörelse och beteendeförändringar under olika stadier av vävnadsmorfogenes och organbildning och slutligen sökarbilden interaktionen av medfödda immunceller interaktioner med andra specifika cellinjer som kan riktas av det inducerbara KalTA4-ER T2 / UAS expressionssystem.
Vi använde pDestTol2CG vektorn från zebrafisk Tol2kit 20-23 som innehåller en cmlc2: eGFP-pA kassetten (figur 1D, a) som möjliggör efterföljande val av embryon av gröna fluorescerande positiva hjärtan som a seling markör 20 som förenklar F0 screening process. En stabil insättning av transposonen flanke genen av intresse i genomet underlättas av sam-injektion av plasmid-DNA tillsammans med transposas mRNA. Beredningen av plasmid-DNA och transposaset mRNA för mikroinjektion följer standardprotokoll. Men en framgångsrik integration av konstruktionen i genomet beror på Tol2 Baserade införlivande 14. Detta belyser särskild uppmärksamhet ägnas åt att arbeta på is under sterila förhållanden för att undvika föroreningar och försämringar av RNaser och DNaser. Mikroinjektion i en cell skede embryon är en robust och väletablerad teknik för vinst och förlust av funktionsstudier i zebrafisk 9,10. Även om en vältränad person lätt kan injicera i gulan av över 1.000 embryon i 1 timme, den injektion i blastocysten (Figur 1A, asterisk) kräver mer erfarenhet och utbildning. Kritisk under denna procedur is hantering av nålen. Nålen måste vara mycket tunn för att penetrera cellen utan skador och måste brytas endast på mycket dess spets därför. Det är viktigt att regelbundet kontrollera och mäta droppstorleken under insprutningen för att garantera en enhetlig injektion i varje embryo. Försiktigt hanteras, nålen kan användas för att rotera embryot. Detta behövs ofta för att hitta blastocysten och optimal penetrationsvinkeln.
Koncentrationen av DNA och transposas mRNA används för injektion nästan säkert påverkar uttrycket effektiviteten. Högre doser kan leda till en ökad andel av celler som uttrycker transgenen men med högre koncentrationer av DNA (> 50 ng / ul) och transposas-mRNA (> 100 ng / ul) även är aktuell potentialen för toxiska effekter bland injicerade embryon. Vi föredrar användning av 10 ng / ul DNA och 20 ng / ul transposas mRNA för injektion, vilket motsvarar 50 pg av plasmid-DNA och 100 pg av RNA per injicerad embryo. 100% av embryon som injicerats med dessa koncentrationer inte utvecklas normalt, och mellan 40-70% show eGFP-HRAS G12V uttryck, efter 4-OHT induktion, beroende på injektionseffektiviteten i en enda cell. Bland positiva embryon vi normalt hittar ca 30% som har 1-10 kloner, 40% som har 10-50 kloner och 30% har mer än 50 kloner. Tack vare våra forsknings mål, gynnar vi användning av embryon med färre kloner som uttrycker EGFP-HRAS G12V. Vi väljer embryon med 10-50 kloner för våra transienta experiment. För generering av transgena grundare fisk, rekommenderar vi att bara välja embryon med både eGFP positiva hjärtmarkör och ett stort antal eGFP-HRAS G12V positiva kloner i deras epidermis.
(Z) -4-hydroxitamoxifen undergår en cis-trans (EZ) interomvandling när den utsätts för ljus 24. Det visade sig att cis-isomeren (E) är 100x mindre anti-östrogena än sin trans motsvarighet 25,26. Exposure för ljus måste därför undvikas. Den 4-OHT stamlösning löst i etanol kan lagras vid -20 ° C i mörker under en lång tidsperiod. Vi rekommenderar användning av en låda för att skydda petriskålar från ljus under målet geninduktion inom inkubatorn och transport. Även området imaging är mycket liten och exponering av 4-OHT för UV-ljus reduceras till ett minimum, ett ständigt utbyte av induktionslösning varje 2 timmar medan avbildning över längre tidsperioder rekommenderas för att bibehålla högsta uttrycksnivåer. 4-OHT permeabilizes effektivt genom chorion och de yttersta hudlagren under zebrafisk embryogenes, därför kan inducera genuttryck mycket snabbt. Vi kan lätt konstatera eGFP utsläpp efter 2 h av induktion och det har rapporterats att första tecknen på mål-genuttryck kan observeras efter 1 timme och platå efter 3 tim behandling 8. Skillnaderna kan bero på den annan promotor som används i vår studie. Som har previously rapporterade att 4-OHT behandling är dosberoende 8,27, valde vi att använda den högsta rapporterade koncentrationen av 5 iM att uppnå robusta och reproducerbara uttrycksnivåer i vår gående strategi. Detta bör garantera att alla celler som bär transgenen kommer att inducera målgenuttryck.
Det måste beaktas att den transienta synsätt som presenteras här kan leda till varierande uttrycksnivåer på grund av risken för flera och slumpmässiga genomet insättningshändelser. Vidare användning av transposaset mRNA i Tol2 transgen bakgrund av Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 kan leda till potentiella införlivanden av UAS transgen som kan resultera i geners uttryck eller störningar. Men eftersom metoden presenteras här representerar en övergående strategi, är det första urvalet av embryon efter den injektion obligatoriskt. Många laboratorier har funnit att UAS sekvenser tenderar att tystas i den transgena avkomman, alltså ijecting den pTol2-krt4: KalTA4-ER T2, cmlc2: eGFP bygga in Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 embryon kanske inte vara så effektiv som att injicera en UAS konstruera in Tg (krt4: KalTA4-ER T2, cmlc2: GFP ) embryon. Användningen av den stabila transgena linjen Tg (krt4: KalTA4-ER T2) korsas med Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 kommer att möjliggöra en noggrann övervakning av on / off kinetik tids doseringen beroende 4-OHT genaktivering .
Ett kritiskt steg under monteringen av larver är överföringen till LMP agaros och på täckglaset (Figur 1B). Det är bara en kort tidsram för flytande LMP agaros temperatur som möjliggör en säker överföring och orientering förvalda larver utan att skada fisken antingen värmechock eller härdning av gelén. Larverna ska orient direkt på täckglaset för att minska arbetsavståndet för den efterföljande mikroskopisk analysis. Eftersom detta kan vara en begränsande faktor under mikroskopi valet av lämpliga mål är obligatoriskt. När monterade, kan larven hållas från timmar till dagar.
Villkorlighet systemmodell som presenteras häri möjliggör upprepad omvandling av 4-OHT aktivering av transgenen. Uttrycket system beror på närvaron av 4-OHT och därför KalTA4 kontrollerade uttrycket av en gen av intresse är reversibel (Figur 1D, b). I motsats till den Cre-ER T2 / Lox-systemet, vilket underlättar en irreversibel genomisk rekombinationshändelse 28, kan KalTA4-ER T2 / UAS aktiveras och avaktiveras vid tillsats eller avlägsnande av 4-OHT och denna potential för upprepad induktion är en fördel med tekniken över Cre-ER T2 / Lox-systemet. Dock är kravet på konstanta nivåer av 4-OHT en begränsning om experimentet måste förlängas från dagar till veckor.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a Wellcome Trust Sir Henry Dale Fellowship to Y. F. 100104/Z/12/Z.
We would like to thank Dr. Carl Tucker and the team of the fish facility at the Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh. We like to thank Michael Millar of the immunohistology and imaging facility of the MRC Centre for Reproductive Medicine, University of Edinburgh for support.
We thank Prof. Dr. Matthias Hammerschmidt and Dr. Heiko Loehr of the Institute of Developmental Biology, University of Cologne for providing the p5E-krt4 entry vector. We also would like to thank Dr. Dirk Sieger of the Centre of Neuroregeneration, Univerity of Edinburgh for providing the pDestTol2CG destination vector.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
(Z)-4-Hydroxytamoxifen | Sigma Aldrich | H7904 | dilute in ethanol and store in the dark at -20°C |
20x Objective | Zeiss | 20x/0,5 Ph2 ∞/0,17 | |
40x Objective | Zeiss | 40x/1,2W Korr ∞/0,14-0,18 | |
63x Objective | Zeiss | 63x/1.4 Oil Ph3 ∞/0,17 | |
BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 META | |
Cover glass | VWR | 631-0171 | Diameter 25mm |
Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPSV | |
Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma Aldrich | MKBL4135V | |
Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | Program: heat 530, pull 200, velocity 80 and time 150 |
Fluorescent stereoscope | Leica | M205 FA | |
Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Microinjection mold TU-1 | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
Microloader tip | Eppendorf | 930001007 | |
Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1348 | |
Nuclease-free water | Invitrogen | AM9937 | |
Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV820 | |
Pneumatic pico pump | Warner Instruments | PLI-90A | |
pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP | Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh | ||
QIAprep Spin Miniprep Kit | Quiagen | 27106 | |
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma Aldrich | R8881 | 10mg/μl in water |
Stereoscope | Leica | M80 | |
Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg | BMC developmental biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007) | ||
Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 | PloS one 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010) | ||
Tricaine/MS-222 | Sigma Aldrich | A5040 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-031 | 25:24:1, v/v |