At studere de tidligste begivenheder af præneoplastiske celle progression og medfødte immunforsvar interaktion celle er afgørende at forstå og behandle kræft. Her beskriver vi en metode til betinget fremkalde epitelcelletyper transformationer og den efterfølgende live-billeddannelse af medfødte immunforsvar interaktion celle med HRAS G12V udtrykker hudceller i zebrafisk larver.
Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.
Overvækst af en afkom præneoplastiske celle i en ellers normal epitelial ark stærkt afhængig af et samspil med dens mikromiljø. Samspillet med sin vært væv vil sandsynligvis være den afgørende faktor for, om en præ-neoplastisk celle er i stand til at etablere en klonal niche til at videreudvikle sig til en fuldstændig blæst kræft. På trods af sin betydning i udviklingen, denne første fase af cancer progression er utilgængelige i de fleste almindeligt anvendte modelsystemer, in vivo.
Zebrafisken, Danio rerio, er en veletableret model organisme for levende billeddiagnostiske undersøgelser på grund af sin gennemsigtighed udvikling, muligheden for genetisk manipulation, og tilgængelighed for vandopløselige stoffer. Nylige undersøgelser ved hjælp af en larve zebrafisk model, overudtrykker den humane onkogen HRAS G12V at transformere epitelceller, viste, at værtscelle afledt signaler, især H 2 O 2 fører tilrekruttering af medfødte immunceller. Interessant, de rekrutterede immunceller, neutrofiler og makrofager, viste sig at have en trofisk rolle i at støtte præneoplastiske celleproliferation 2,3.
For at forstå de tidlige begivenheder af tumor initiering og progression samt indskud af et inflammatorisk respons, er man nødt til at være i stand til at afbilde disse begivenheder fra det tidligste tidspunkt og fremefter. Det er derfor nødvendigt at kontrollere celle transformationer i en tidsmæssig og vævsspecifik måde. Vi udnytter Gal4 / UAS system, der er med succes blevet tilpasset fra Drosophila 4 til betinget udtrykke den menneskelige onkogen HRAS G12V under kontrol af huden promotor keratin 4 (krt4) 5. Den modificerede version af den transskriptionelle aktivator Gal4, nemlig KalTA4 6, muliggør ekspression af HRAS G12V under kontrol af den opstrøms aktiverende sekvens (UAS). Om betinget inducere transkriptionsaktivator udtryk har KalTA4 blevet fusioneret til mutant ligand-bindende domæne af den humane østrogen-receptor α (ER T2) 7, som binder specifikt 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) 1. I fravær af 4-OHT ER T2 er bundet i cytoplasmaet af varmechokproteiner. Ved 4-OHT binding af varme-shock-proteiner dissocierer, hvilket tillader en nuklear translokation af KalTA4-ER T2 og efterfølgende aktivering af UAS kontrollerede gen af interesse 8 (figur 1C, b). Da dette ekspressionssystem afhænger af tilstedeværelsen af 4-OHT, den KalTA4 kontrolleret ekspression af et gen af interesse er reversibel. I modsætning til den Cre-ER T2 / Lox-system, hvilket fører til en irreversibel rekombination omstændigheder induktion af transkriptionel aktivering med KalTA4-ER T2 er reversibel ved tilsætning eller fjernelse af 4-OHT.
Følgende protokol allo ws en betinget transformation af hudceller i zebrafisk larver og en efterfølgende kontrol af samspillet med medfødte immunceller ved fluorescerende protein udtryk. De grundlæggende metoder, der anvendes i denne protokol ligner nogle almindeligt anvendte teknikker inden for zebrafisk samfund 9-13.
Frembringelsen og kombinatoriske anvendelse af transgene linier sammen med mikroinjektion af transgene konstruktioner muliggør en forbigående tilgang til kun at transformere enkelte celler i en mosaik måde. Ilt permeabilitet embryonale og larver zebrafisk hud rejser muligheden til tidsforskudte levende billeddiagnostiske undersøgelser foretaget af høj opløsning mikroskopi fra timer til dage. Desuden vil dens tilgængelighed for vandopløselige stoffer tillade fremtidige mekanistiske undersøgelser og overvågning af cellebiologiske hændelser in vivo, som kunne føre til en bedre forståelse af de tidligste stadier af kræft udvikling.
_content "> Denne protokol kan tilpasses til at udføre betinget genekspression i hvilket som helst væv af interesse i zebrafisk larver i en mosaik måde. Man kan også optimere mikroskopet indstilling for at leve billedet dybere end huden væv.Under embryogenese og larveudvikling, er den embryoniske zebrafisk hud består af to epiteliale lag, det overfladiske lag kaldet periderm og et lag af basale keratinocytter, der er fastgjort til den underliggende basalmembran 19 (figur 1C, a). Protokollen præsenteres her beskriver en enkel metode til betinget inducere præneoplastiske-celle transformation i det overfladiske hudlag af zebrafisk larver, og giver mulighed for efterfølgende interaktionsanalyse med medfødte immunceller ved direkte billedvisning. De grundlæggende metoder i vores protokol følger veletablerede zebrafisk teknikker 9-13, og vores protokol kan let tilpasses og ændres.
Den krt4 promotor 5 anvendes her driver KalTA4-ER T2 ekspression specifikt i det yderste hudlag (figur 1C, b). Men den modulære MultiSite Gatewaykloning strategi, der anvendes til at generere krt4: KalTA4-ER T2 konstrukt (figur 1D, a), giver mulighed for at klone en hvilken som helst promotor af interesse foran KalTA4-ER T2 i et enkelt kloningstrin. En tilpasning af metoden præsenteret heri er derfor muligt for de fleste væv under embryogenese og larvestadier. Tilgængeligheden af promotorsekvenser er herved den begrænsende faktor. Desuden kan næsten alle gen klonet bag en UAS interesse betinget overudtrykt på forskellige udviklingsstadier ved brug af den rumlige og tidsmæssigt styret KalTA4-ER T2 udtryk. Derfor kan vores protokol tilpasses til at udføre betinget genekspression i hvilket som helst væv af interesse i zebrafisk larver i en mosaik måde. Man kan også optimere mikroskopet indstilling for at leve billedet dybere væv, såsom lever eller bugspytkirtel.
Vi har beskrevet en ansøgning ved anvendelse af protokollen hanre, på samme måde kan man overudtrykke andre inflammatoriske modulatorer ved hjælp af denne protokol til at studere reguleringen af inflammatoriske reaktioner, som man nemt kan levende billede neutrofile og makrofag adfærdsændringer efter induktion og anholdelse i udtrykket for en kandidat inflammatorisk modulator. Desuden ville den tilpassede protokol også være til gavn for dem, der ønsker at spore celle bevægelse og adfærdsændring i forskellige stadier af vævsmorfogenese og dannelse orgel og endelig levende billede samspillet mellem medfødte immun celle interaktioner med andre specifikke cellelinier, der kan målrettes af det inducerbare KalTA4-ER T2 / UAS ekspressionssystem.
Vi brugte pDestTol2CG vektor fra zebrafisk Tol2kit 20-23, der indeholder en cmlc2: eGFP-pA kassette (figur 1D, a) som gør det muligt efterfølgende udvælgelse af embryoner af grønne fluorescerende positive hjerter som en selvlektion markør 20, som forenkler F0 screening proces. En stabil insertion af transposonet flankeret genet af interesse i genomet lettes ved co-injektion af plasmid-DNA sammen med transposase mRNA. Fremstillingen af plasmid-DNA og transposasen mRNA for mikroinjektion følger standardprotokoller. Men en vellykket integration af konstruktionen i genomet afhænger Tol2-baserede gennemførelse 14. Dette understreger den særlige opmærksomhed til at arbejde på is under sterile forhold for at undgå forureninger og forringelser af RNaser og DNaser. Mikroinjektion i én-celle embryoer er en robust og veletableret teknik for gevinst og tab af funktion studier i zebrafisk 9,10. Selvom en veluddannet person let kan tilføre blommen af over 1.000 embryoner i 1 time, det injektion i blastocysten (figur 1A, stjerne) kræver mere erfaring og uddannelse. Kritisk under denne procedure is håndtering af nålen. Nålen skal være meget tynd for at trænge ind i cellen uden beskadigelse og skal kun brydes på spidsen derfor. Det er vigtigt at regelmæssigt kontrollere og måle dråbestørrelsen under injektionen at sikre en ensartet injektion i hvert foster. Håndteres forsigtigt, nålen kan anvendes til at rotere embryoet. Dette er ofte nødvendigt for at finde den blastocysten og den optimale penetration vinkel.
Koncentrationen af DNA og transposasesekvenser mRNA anvendes til injektion næsten helt sikkert påvirker ekspressionen effektivitet. Højere doser kan føre til en øget andel af celler, der udtrykker transgenet, men med højere koncentrationer af DNA (> 50 ng / pl) og transposasen mRNA (> 100 ng / pl) også potentialet for toksiske effekter blandt injicerede embryoner ikke opstår. Vi fremme anvendelsen af 10 ng / pl DNA og 20 ng / pl transposase mRNA til injektion, hvilket svarer til 50 pg af plasmid-DNA og 100 pg af RNA pr injiceret embRyo. 100% af embryoner injiceret med disse koncentrationer kan udvikle sig normalt og mellem 40-70% show eGFP-HRAS G12V ekspression efter 4-OHT-induktion, afhængigt af injektion effektivitet i enkelt celle. Blandt positive embryoner vi normalt finde ca. 30%, der har 1-10 kloner, 40%, der har 10-50 kloner, og 30% har mere end 50 kloner. På grund af vores forsknings målsætninger, vi fremme anvendelsen af embryoner med færre kloner, der udtrykker eGFP-HRAS G12V. Vi udvælger embryoer med 10-50 kloner for vores transiente eksperimenter. Til fremstilling af transgene grundlægger fisk, anbefaler vi at kun vælge fostre med både eGFP positive hjerte- markør og et stort antal eGFP-HRAS G12V positive kloner i deres hud.
(Z) -4-hydroxytamoxifen undergår en cis-trans (EZ) interomdannelse når de udsættes for lys 24. Det blev konstateret, at cis-isomeren (E) er 100x mindre anti-østrogene end trans modstykke 25,26. Exposure for lys skal derfor undgås. 4-OHT stamopløsning opløst i ethanol kan opbevares ved -20 ° C i mørke over en lang tidsperiode. Vi anbefaler brug af en kasse for at beskytte petriskåle mod lys under målgen induktion i inkubatoren og transport. Selvom området billeddannelse er meget lille og eksponering af 4-OHT til UV-lys er reduceret til et minimum, en konstant udveksling af induktion opløsning hver 2 timer, mens billeddannelse over længere tidsperioder anbefales at opretholde maksimale ekspressionsniveauer. 4-OHT effektivt permeabiliserer gennem chorion og de yderste hudlag under zebrafisk embryogenese, det kan derfor inducere genekspression meget hurtigt. Vi kan let observere eGFP emission efter 2 timer af induktion og det er blevet rapporteret, at de første tegn på target-genekspression kan observeres efter 1 time og plateau efter 3 timer af behandlingen 8. Forskellene kan skyldes den anden promotor, der anvendes i vores studie. Som det har været previously rapporteret, at 4-OHT behandling er dosisafhængig 8,27, vi valgte at bruge den højeste rapporterede koncentration på 5 uM at opnå robuste og reproducerbare ekspressionsniveauer i vores forbigående tilgang. Dette skal sikre, at alle celler, der bærer transgenet vil inducere målgenekspression.
Det skal tages i betragtning, at forbigående fremgangsmåde præsenteres her kan føre til varierende ekspressionsniveauer på grund af muligheden af flere og tilfældige genom indsættelse begivenheder. Desuden er brugen af transposase mRNA i Tol2 transgene baggrund af Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 kan føre til potentielle gennemførelser af UAS transgen, som kan resultere i gendæmpning eller forstyrrelser. Men som den metode præsenteres her repræsenterer en forbigående tilgang, den første udvælgelse af embryoner efterfølgende injektion er obligatorisk. Mange laboratorier har fundet, at UAS-sekvenser tendens til at blive bragt til tavshed i transgene afkom dermedprojicere den pTol2-krt4: KalTA4-ER T2, cmlc2: eGFP konstruktion i Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 embryoner måske ikke være så effektive som injektion af en UAS konstruktion i Tg (krt4: KalTA4-ER T2, cmlc2: GFP ) embryoner. Brugen af den stabile transgene linje Tg (krt4: KalTA4-ER T2) krydset med Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 vil tillade en præcis overvågning af ON / OFF-kinetik time-dosis afhængig 4-OHT genaktivering .
Et afgørende skridt under montering af larver er overførslen i LMP agarose og på dækglasset (figur 1B). Der er kun en kort tidsramme for flydende LMP agarose temperatur, der giver en sikker overførsel og orientering af forvalgte larver uden at skade fisk ved enten varme stød eller hærdning af gelen. Larverne bør være orienteret direkte på dækglasset at reducere arbejdsafstanden for den efterfølgende mikroskopisk ANALYsis. Da dette kan være en begrænsende faktor under mikroskopi valget af passende mål er obligatorisk. Når monteret, kan larven opretholdes fra timer til dage.
Betingelserne i modelsystemet præsenteret heri muliggør gentagen transformation ved 4-OHT aktivering af transgen. Ekspressionssystemet afhænger af tilstedeværelsen af 4-OHT og derfor KalTA4 kontrolleret ekspression af et gen af interesse er reversibel (figur 1D, b). I modsætning til den Cre-ER T2 / Lox-system, som letter en irreversibel genomisk rekombinationshændelse 28 kan KalTA4-ER T2 / UAS aktiveres og deaktiveres ved tilsætning eller fjernelse af 4-OHT og dette potentiale til gentagen induktion er en fordel teknikken over Cre-ER T2 / Lox system. Men kravet om konstante niveauer af 4-OHT er en begrænsning, hvis forsøget skal forlænges fra dage til uger.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a Wellcome Trust Sir Henry Dale Fellowship to Y. F. 100104/Z/12/Z.
We would like to thank Dr. Carl Tucker and the team of the fish facility at the Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh. We like to thank Michael Millar of the immunohistology and imaging facility of the MRC Centre for Reproductive Medicine, University of Edinburgh for support.
We thank Prof. Dr. Matthias Hammerschmidt and Dr. Heiko Loehr of the Institute of Developmental Biology, University of Cologne for providing the p5E-krt4 entry vector. We also would like to thank Dr. Dirk Sieger of the Centre of Neuroregeneration, Univerity of Edinburgh for providing the pDestTol2CG destination vector.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
(Z)-4-Hydroxytamoxifen | Sigma Aldrich | H7904 | dilute in ethanol and store in the dark at -20°C |
20x Objective | Zeiss | 20x/0,5 Ph2 ∞/0,17 | |
40x Objective | Zeiss | 40x/1,2W Korr ∞/0,14-0,18 | |
63x Objective | Zeiss | 63x/1.4 Oil Ph3 ∞/0,17 | |
BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 META | |
Cover glass | VWR | 631-0171 | Diameter 25mm |
Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPSV | |
Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma Aldrich | MKBL4135V | |
Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | Program: heat 530, pull 200, velocity 80 and time 150 |
Fluorescent stereoscope | Leica | M205 FA | |
Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Microinjection mold TU-1 | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
Microloader tip | Eppendorf | 930001007 | |
Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1348 | |
Nuclease-free water | Invitrogen | AM9937 | |
Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV820 | |
Pneumatic pico pump | Warner Instruments | PLI-90A | |
pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP | Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh | ||
QIAprep Spin Miniprep Kit | Quiagen | 27106 | |
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma Aldrich | R8881 | 10mg/μl in water |
Stereoscope | Leica | M80 | |
Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg | BMC developmental biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007) | ||
Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 | PloS one 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010) | ||
Tricaine/MS-222 | Sigma Aldrich | A5040 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-031 | 25:24:1, v/v |