Studere de tidligste hendelsene i preneoplastiske celle progresjon og medfødte immunceller samhandling er avgjørende for å forstå og behandle kreft. Her beskriver vi en metode for å betinget indusere epiteliale celletransformasjoner og den påfølgende levende avbildning av medfødte immunceller interaksjon med HRAS G12V uttrykker hudceller i sebrafisk larver.
Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.
Overvekst av en preneoplastiske celle avkom innenfor en ellers normal epitel ark sterkt avhengig av et samspill med sin mikromiljøet. Interaksjonen med vertens vev er egnet til å være den viktigste faktor for hvorvidt en preneoplastiske celle er i stand til å etablere en klonal nisje å videreutvikle til en fullverdig kreft. Til tross for sin betydning i utvikling, er denne innledende fase av kreft progresjon utilgjengelige i de fleste vanlig anvendte modellsystemer, in vivo.
Sebrafisk, Danio rerio, er en veletablert modellorganisme for live imaging studier på grunn av sin åpenhet gjennom utvikling, muligheten for genetisk manipulasjon, og tilgjengelighet for vannløselige stoffer. Nyere studier ved hjelp av en larve sebrafisk modell, overekspresjon menneske onkogen HRAS G12V å forvandle epitelceller, viste at vertscelle avledet signaler, særlig H 2 O 2 ledelse tilrekruttering av medfødte immunceller. Interessant, rekruttert immunceller, nøytrofile granulocytter og makrofager, ble vist å ha en trofisk rolle i å støtte preneoplastiske celleproliferasjon 2,3.
For å forstå de tidlige hendelsene i startfasen og progresjon, samt bidrag av en betennelsesreaksjon, må man være i stand til bilde disse hendelsene fra den tidligste tidspunkt utover. Derfor er det nødvendig å kontrollere celletransformasjoner i et tidsmessig og vevsspesifikk måte. Vi benytter Gal4 / UAS system som har blitt tilpasset fra Drosophila 4 til betinget uttrykke det humane onkogen HRAS G12V under kontroll av huden promoter keratin 4 (krt4) 5. Den modifiserte versjonen av den transkripsjonelle aktivator Gal4, nemlig KalTA4 6, muliggjør ekspresjon av HRAS G12V under kontroll av den Upstream Activating Sequence (UAS). For å betinget indusere ekspresjon transkripsjonen aktivator, har KalTA4 blitt kondensert til den mutante ligand-bindende domene av human østrogenreseptor α (ER T2) 7 som binder spesifikt 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) 1. I fravær av 4-OHT ER T2 er bundet i cytoplasma av varmesjokkproteiner. Ved 4-OHT binding av varmesjokk-proteiner dissosierer, noe som gir et atomtranslokasjon av KalTA4-ER T2 og påfølgende aktivering av UAS kontrollerte genet av interesse 8 (figur 1C, b). Ettersom dette ekspresjonssystem er avhengig av nærvær av 4-OHT, er KalTA4 kontrollert ekspresjon av et gen av interesse reversibel. I motsetning til den Cre-ER T2 / LOX-system, noe som fører til en irreversibel rekombinasjon, er dannelse av transkripsjonen aktivering av KalTA4-ER T2 reversibel ved tilsetning eller fjerning av 4-OHT.
Følgende protokoll allo ws en betinget transformasjon av hudceller på sebrafisk larver og en etterfølgende kontroll av samspillet med medfødte immunceller ved fluorescerende protein uttrykk. De grunnleggende metoder som benyttes i denne protokollen er lik noen brukte teknikker innenfor sebrafisk samfunnet 9-13.
Generering kombinatoriske bruk av transgene linjer sammen med mikroinjeksjon av transgene konstruksjoner gjør det mulig for en transient måte å omdanne bare enkeltceller i et mosaikk måte. Oksygenpermeabiliteten av embryonale og larvesebrafisk hud øker muligheten for intervall levende imaging studier av høy oppløsning mikroskopi fra timer til dager. Videre vil tilgjengeligheten til vannløselige legemidler tillate fremtidige mekanistiske studier og overvåking av cellebiologiske hendelser i vivo som kan føre til en bedre forståelse av de tidligste stadier av kreftutviklingen.
_content "> Denne protokollen kan tilpasses til å utføre betinget genuttrykk i noen vev av interesse i sebrafisk larver, i en mosaikk måte. Man kan også optimalisere mikroskop innstillingen for å leve bilde dypere enn huden vev.I løpet av embryogenesen og larveutvikling, er den embryoniske sebrafisk hud sammensatt av to lag epitelceller, overfladiske lag som kalles periderm og et lag av basale keratinocytter som er festet til den underliggende grunnmembran 19 (figur 1C, a). Protokollen presenteres her beskriver en grei metode for å betinget indusere preneoplastiske-celle transformasjon i den overfladiske hud laget av sebrafisk larver, og gjør det mulig for påfølgende interaksjonsanalyse med medfødte immunceller ved levende avbildning. De grunnleggende metoder i vår protokoll følger veletablerte sebrafisk teknikker 9-13, og vår protokoll kan enkelt tilpasses og endres.
Den krt4 promoter 5 anvendes her driver KalTA4-ER T2 uttrykket spesifikt i det ytterste hudlaget (figur 1C, b). Men den modulære Multisite Gatewaykloningsstrategi, som brukes til å generere krt4: KalTA4-ER T2-konstruksjonen (figur 1D, a), gir mulighet for å klone en hvilken som helst promoter av interesse foran KalTA4-ER T2 i et enkelt kloningstrinn. En tilpasning av fremgangsmåten presentert heri er derfor mulig for de fleste vev under embryogenese og larvestadiet. Tilgjengeligheten av promotersekvenser er herved den begrensende faktor. Videre kan nesten en hvilken som helst gen av interesse klonet bak en UAS være betinget overuttrykt på forskjellige utviklingsstadier ved bruk av romlig og tidsmessig styrt KalTA4-ER T2 ekspresjon. Derfor kan vår protokollen bli tilpasset til å utføre betinget genekspresjon i ethvert vev av interesse for sebrafisk larver, i en mosaikk måte. Man kan også optimalisere mikroskop innstillingen for å leve bilde dypere vev slike som lever eller bukspyttkjertel.
Vi har beskrevet et program ved hjelp av protokollen hanre, på samme måte, kan man overuttrykke andre betennelses modulatorer bruke denne protokollen for å studere reguleringen av betennelsesreaksjoner, som man kan lett levende bilde nøytrofile og makroatferdsendringer etter induksjon og arrest i uttrykket av en kandidat inflammatorisk modulator. Videre vil tilpasset protokollen også være gunstig for de som ønsker å spore mobil bevegelse og atferdsendring under ulike stadier av vev morphogenesis og orgel dannelse og, endelig levende bilde samspillet av medfødte immuncelle interaksjoner med andre spesifikke celle linjene som kan være målrettet av induserbare KalTA4-ER T2 / UAS uttrykk system.
Vi brukte pDestTol2CG vektor fra sebrafisk Tol2kit 20-23 som inneholder en cmlc2: EGFP-pA kassett (figur 1D, a) som gjør det mulig påfølgende valg av embryoer av grønne fluorescerende positive hjerter som en selection markør 20 som forenkler F0 screening prosessen. En stabil innsetting av transposon flankert genet av interesse i genomet lettes ved ko-injeksjon av plasmid-DNA sammen med transposase mRNA. Utarbeidelse av plasmid DNA og transposase mRNA for mikroinjeksjon følger standardprotokoller. Men en vellykket integrering av konstruksjonen i genomet avhenger Tol2-baserte trans 14. Dette understreker særlig oppmerksomhet skal betales for å arbeide på is under sterile forhold for å unngå forurensing og ødeleggelse av RNases og DNaser. Mikroinjeksjon i én-celle scene embryo er et robust og godt etablert teknikk for gevinst og tap av funksjon studier i sebrafisk 9,10. Selv en godt trent person lett kan injisere i plommen av over 1000 embryoer i 1 time, injeksjon inn i blastodisc (figur 1A, stjerne) krever mer erfaring og trening. Kritisk under denne prosedyren is håndtering av nålen. Nålen må være meget tynt for å trenge inn i cellen uten å ta skade, og derfor må brytes bare på sin spiss. Det er viktig å kontrollere og regelmessig måle dråpestørrelsen under injeksjon for å garantere en ensartet injeksjon i hvert embryo. Omhyggelig behandlet, nålen kan brukes til å rotere embryo. Dette er ofte nødvendig for å finne den blastodisc og optimal penetrasjon vinkel.
Konsentrasjonen av DNA og transposase mRNA brukes for injeksjon nesten helt sikkert påvirker ekspresjonen effektivitet. Høyere doser kan føre til en øket andel av celler som uttrykker transgenet, men med høyere konsentrasjoner av DNA (> 50 ng / mL) og transposase mRNA (> 100 ng / mL) også potensialet for toksiske effekter blant injiserte embryoer ikke oppstår. Vi foretrekker å bruke 10 ng / pl DNA og 20 ng / mL transposase mRNA for injeksjon, noe som svarer til 50 pg av plasmid-DNA og 100 pg RNA pr injisert embRyo. 100% av embryoer injisert med disse konsentrasjoner ikke utvikle seg normalt, og mellom 40 til 70% viser EGFP-HRAS G12V ekspresjon, etter at 4-OHT induksjon, avhengig av injeksjonseffektiviteten inn i én celle. Blant positive embryoer vi vanligvis finner ca 30% som har 1-10 kloner, 40% som har 10-50 kloner og 30% har mer enn 50 kloner. På grunn av våre forsknings mål, vi favorisere bruk av embryoer med færre kloner uttrykker EGFP-HRAS G12V. Vi velger embryoer med 10-50 kloner for våre forbigående eksperimenter. For generering av transgen grunnleggeren fisk, anbefaler vi å bare velge embryoer med både EGFP positive hjerte markør og et stort antall EGFP-HRAS G12V positive kloner i sine epidermis.
(Z) -4-Hydroxytamoxifen gjennomgår en cis-trans (EZ) omdannelse når de utsettes for lys 24. Det ble funnet at cis-isomeren (E) er 100x mindre anti-østrogenisk enn dens trans motstykke 25,26. Exposure til lys må derfor unngås. Det 4-OHT stamløsning oppløst i etanol kan lagres ved -20 ° C i mørket over en lang tidsperiode. Vi anbefaler bruk av en boks for å beskytte petriskåler fra lys under målgen induksjon i kuvøse og transport. Selv om området for avbildning er svært liten, og eksponering av 4-OHT for UV-lys reduseres til et minimum, en konstant utveksling av induksjonsløsning hver 2 timer mens avbildning over lengre tidsperioder er det anbefalt å opprettholde maksimale ekspresjonsnivåer. 4-OHT permeabilizes effektivt gjennom chorion og de ytterste hudlagene under sebrafisk embryogenese, derfor kan det indusere genuttrykk svært raskt. Vi kan lett observere EGFP utslipp etter 2 timer for induksjon, og det har blitt rapportert at de første tegn på target-genekspresjon kan observeres etter 1 time og platå etter 3 timers behandling 8. Forskjellene kan være på grunn av den forskjellige promoter anvendt i vårt studium. Som har vært previously rapportert at fire-OHT behandling er doseavhengig 8,27, valgte vi å bruke den høyeste rapporterte konsentrasjonen av fem mikrometer for å oppnå robuste og reproduserbare uttrykk nivåer i vår forbigående tilnærming. Dette skal sikre at alle celler som bærer transgenet, vil indusere target-genekspresjon.
Det må tas hensyn til at den transiente tilnærming presentert her kan føre til varierende ekspresjonsnivåer på grunn av muligheten av flere og tilfeldige genom innsetting hendelser. Videre er bruken av transposase-mRNA i Tol2 transgen bakgrunn av Tg (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 kan føre til mulige transponering av UAS transgenet som kunne resultere i genet Slå eller avbrudd. Men som den metoden som presenteres her representerer en forbigående tilnærming, er den forhåndsvalg av embryoer påfølgende til injeksjon obligatorisk. Mange laboratorier har funnet ut at UAS sekvenser tendens til å bli brakt til taushet i den transgene avkom, derav irager den pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: EGFP konstruere inn Tg (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 embryoer kan ikke være så effektiv som å injisere en UAS konstruere inn Tg (krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: GFP ) embryoer. Bruken av den stabile transgen linje Tg (krt4: KalTA4-ER T2) krysset med Tg (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 vil tillate en nøyaktig måling av på / av kinetikk tids dosering avhengig 4-OHT genaktivering .
Et kritisk trinn under monteringen av larver er overføringen inn i LMP-agarose og inn på dekkglasset (figur 1B). Det er bare en kort tidsramme for flytende LMP agarose temperatur som muliggjør en sikker overføring og orientering av den forhåndsvalgte larver uten å skade fisken enten ved varmesjokk eller herding av gel. Larvene bør orienteres direkte på dekkglass for å redusere arbeidsavstanden for den påfølgende mikroskopisk analysis. Da dette kan være en begrensende faktor ved mikros valg av passende mål er obligatorisk. Når den er montert, kan larven opprettholdes fra timer til dager.
Kondisjonalitet av modellsystemet som presenteres her gir mulighet for gjentatt transformasjon av 4-OHT aktivering av transgenet. Uttrykket system avhenger av nærvær av 4-OHT og derfor KalTA4 kontrollert ekspresjon av et gen av interesse er reversibel (figur 1D, b). I motsetning til den Cre-ER T2 / LOX-system, som muliggjør en irreversibel genomisk rekombinasjon 28, kan KalTA4-ER T2 / UAS aktiveres og deaktiveres ved tilsetning eller fjerning av 4-OHT og dette potensialet for gjentatt induksjon er en fordel teknikken over Cre-ER T2 / Lox system. Imidlertid er kravet til konstante nivåer av 4-OHT en begrensning dersom forsøket har til å bli forlenget fra dager til uker.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a Wellcome Trust Sir Henry Dale Fellowship to Y. F. 100104/Z/12/Z.
We would like to thank Dr. Carl Tucker and the team of the fish facility at the Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh. We like to thank Michael Millar of the immunohistology and imaging facility of the MRC Centre for Reproductive Medicine, University of Edinburgh for support.
We thank Prof. Dr. Matthias Hammerschmidt and Dr. Heiko Loehr of the Institute of Developmental Biology, University of Cologne for providing the p5E-krt4 entry vector. We also would like to thank Dr. Dirk Sieger of the Centre of Neuroregeneration, Univerity of Edinburgh for providing the pDestTol2CG destination vector.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
(Z)-4-Hydroxytamoxifen | Sigma Aldrich | H7904 | dilute in ethanol and store in the dark at -20°C |
20x Objective | Zeiss | 20x/0,5 Ph2 ∞/0,17 | |
40x Objective | Zeiss | 40x/1,2W Korr ∞/0,14-0,18 | |
63x Objective | Zeiss | 63x/1.4 Oil Ph3 ∞/0,17 | |
BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 META | |
Cover glass | VWR | 631-0171 | Diameter 25mm |
Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPSV | |
Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma Aldrich | MKBL4135V | |
Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | Program: heat 530, pull 200, velocity 80 and time 150 |
Fluorescent stereoscope | Leica | M205 FA | |
Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Microinjection mold TU-1 | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
Microloader tip | Eppendorf | 930001007 | |
Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1348 | |
Nuclease-free water | Invitrogen | AM9937 | |
Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV820 | |
Pneumatic pico pump | Warner Instruments | PLI-90A | |
pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP | Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh | ||
QIAprep Spin Miniprep Kit | Quiagen | 27106 | |
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma Aldrich | R8881 | 10mg/μl in water |
Stereoscope | Leica | M80 | |
Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg | BMC developmental biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007) | ||
Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 | PloS one 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010) | ||
Tricaine/MS-222 | Sigma Aldrich | A5040 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-031 | 25:24:1, v/v |