Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

Published: December 22, 2014 doi: 10.3791/52117
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 1
1Department of Biology, San Diego State University, 2DOE Joint Genome Institute, 3Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado, 4Department of Pediatrics, School of Medicine, University of Colorado

Summary

שימוש בדרכי נשימת סיסטיק פיברוזיס כדוגמא, את כתב היד מציגה עבודה מקיפה הכוללת שילוב של גישות metagenomic וmetatranscriptomic לאפיין את החיידקים וקהילות נגיפיות בדגימות הקשורים לבעלי חיים.

Abstract

הנגישות של רצף תפוקה גבוהה יש מהפכה בתחומים רבים של ביולוגיה. על מנת להבין טוב יותר קהילות נגיפיות וחיידקים הקשורים מארח, עבודה מקיפה להפקת DNA ו- RNA פותחה. העבודה במקביל יוצרת metagenomes נגיפי וחיידקים, כמו גם metatranscriptomes, ממדגם יחיד עבור סידור הדור הבא. הצימוד של גישות אלה מספק סקירה של שני מאפייני המיון השונים ופונקציות הקהילה מקודדת. שיטות שהוצגו להשתמש סיסטיק פיברוזיס ליחה (CF), סוג מדגם בעייתי, משום שהוא צמיג במיוחד ומכיל כמות גבוהה של mucins, DNA נויטרופילים חופשי, ומזהמים אחרים לא ידועים. הפרוטוקולים שתוארו כאן למקד את הבעיות הללו והצלחה לשחזר DNA הנגיפי וחיידקים עם זיהום הדנ"א אנושי מינימאלי. כדי להשלים את לימודי metagenomics, פרוטוקול metatranscriptomics היה מותאם להתאושש שני החיידקיםוmRNA מארח המכיל רצפי מעטים יחסית RNA ריבוזומלי (rRNA). סקירה של מאפייני הנתונים מוצגת ללשמש כנקודת התייחסות להערכת ההצלחה של השיטות. דגימות כיח CF נוספות גם נאספו ל( i) להעריך את העקביות של פרופילי Microbiome על פני שבעה ימים רצופים בתוך מטופל בודד, וכן (ii) להשוות את העקביות של גישת metagenomic לסידור המבוסס על גן 16S RNA ריבוזומלי. התוצאות הראו כי תנודות יומיות של פרופילי חיידקים ללא ההפרעות אנטיביוטיקה היו מינימליות ופרופילי טקסונומיה של החיידקים הקשורים CF הנפוצים היו דומים מאוד בין ספריות 16S rDNA וmetagenomes שנוצרו מDNA תמוגה hypotonic (HL) -derived. עם זאת, ההבדלים בין פרופילי מיון שונים 16S rDNA שנוצרו מDNA הכולל וDNA נגזר HL מציעים שתמוגה hypotonic והצעדים הכביסה ליהנות בלא הסרת DNA האדם נגזר בלבד, אלא גם של חיידקים שמקורם בextracellulDNA ar שעלול לסלף את הפרופילים של חיידקים בפועל.

Introduction

קהילות ויראלי וחיידקים הקשורים לגוף האדם נחקרו בהרחבה בעשור האחרון באמצעות היישום של טכנולוגיות רצף 1,2. התוצאות הובילו להכרה בחשיבות החיידקים בבריאות ומחלות של בני אדם. היוזמה העיקרית הגיעה מהפרויקט האנושי Microbiome המתאר את החיידקים (וגם כמה חיידקים קדומים) המתגורר בעור אדם, ובתוך חלל פה, דרכי הנשימה, בדרכי מין ושתן, ומערכת עיכול 3. מחקרי Microbiome נוספים של דרכי הנשימה של אדם בריא באמצעות שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL) 4,5 ומטליות אף ולוע 4 הראו כי הריאות יכולות לשמש כמכשיר דגימה סביבתי, תוצאות בקולוניזציה של חיידקים חולפים בדרך הנשימה. עם זאת, ההשפעה של קולוניזציה חיידקים במשטחים בדרכי נשימה לקויה יכולה לגרום לזיהומי ריאות חמורים וכרוניים, כגון אלה שראו בסיסטיק פיברוזיס (CF) מטופלים.

t "> CF הוא מחלה גנטית קטלנית הנגרמת על ידי המוטציה בסיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור (CFTR) גן 6. מוטציות אלה להצמיח חלבוני CFTR פגומים שבתורו משפיע על הובלת יון transepithelial פני משטח הפסגה של האפיתל. המחלה פוגעת מספר רב של מערכות איברים, אבל הרוב המכריע של תמותה ותחלואה מיוחסת למחלת ריאות CF 7. CF הריאות מספקת מערכת אקולוגית ייחודית להתיישבות חיידקים. הפגם בהובלת יון גורם ריר לבנות בדרכי נשימת CF, יצירת מייקרו-הסביבות מורכבות של אירובי , Microaerophilic, ותאים אנאירוביים מעוגנים על ידי משטח הרירי עשירים בחומרים מזין סטטי. סביבה זו מאפשרת התישבות ושגשוגם של חיידקים, כולל, חיידקים, ופטריות נגיפיות. אקוטי וזיהומי חיידקי ריאה כרוניים להוביל לתגובות חיסוניים קבועות, אבל לא אפקטיביות, וכתוצאה מכך שיפוץ נרחב בדרכי נשימה, אובדן כושר ריאות, ובסופו pulmoכישלון nary.

קהילות חיידקים הקשורים לריאות CF תוארו גם באמצעות שני גישות תלויות התרבות ותרבות העצמאית, הכוללים שימוש ב16S RNA ריבוזומלי (rRNA) רצף של גנים 8 וmetagenomics רובה 9,10. הגישה מבוססת-rRNA 16S היא מסוגלת לאפיין מגוון רחב של מינים של חיידקים וללכוד משמרות רחבות במגוון קהילה. עם זאת, הוא מוגבל בהחלטתה בהגדרת הקהילות (מסוכם בClaesson et al. 2010 11) והתחזיות של פוטנציאלי חילוף חומרים מוגבלות לפונקציות הכלליות אלה ידועים למינים שזוהו. לכן, שיטות לקביעת רצף גן 16S rRNA אינן מספיקות לדיוק האנליטי הטקסונומי ופונקציונלי ההכרחי של קהילות חיידקים השונות הנמצאות בריאות CF. גישת metagenomic המתוארת כאן משלימה את הגישה מבוססת-rRNA 16S, מתגברת על המגבלות שלו, ומאפשרת דרך יעילה יחסיתכדי לנתח את שתי טקסונומיה קהילת חיידקים ותוכן גנטי בריאות CF.

DNA של חיידקים שבודדו מהדגימות הקשורים לבעלי חיים לעתים קרובות מכיל כמות גדולה של DNA מארח. דגימות כיח או רקמת הריאה CF מכילות בדרך כלל כמות גדולה של DNA האנושי שפורסמה על ידי נויטרופילים בתגובה החיסונית, לעתים קרובות יותר מ- 99% של ה- DNA הכולל 12 - 14. למרות שחלק מתאים אנושיים שלמים יכולים להיות נוכחים, רוב ה- DNA הזה הוא חופשי בפתרון או את הספיחה של חיידקים. בנוסף, הנוכחות של תקעים צמיגים במיוחד ריר, סלולרית פסולת ומזהמים ידועים אחרים לסבך עוד יותר את הבידוד של תאי חיידקים. כמה שיטות נבדקו למדלדלות דגימות אלה של ה- DNA האנושי, כוללים שיפועי Percoll לאדם נפרד מתאי חיידקים 15, הטיפול בDNase אני, ethidium ברומיד monoazide להשפיל DNA האנושי 16, וערכת MolYsis, כל עם הצלחה מוגבלת באופן סלקטיבי. עד כה הליך טיהור DNA של חיידקים היעילים ביותר לליחת CF כבר שינוי של התהליך שתואר על ידי Breitenstein et al. (1995) 17. גישה זו, במסמך הידוע בשם שיטת hypotonic תמוגה (HL), משתמשת בשילוב של β-mercaptoethanol כדי להפחית אג"ח mucin דיסולפיד, תמוגה hypotonic של תאים האיקריוטים, ואני DNase טיפול בDNA המסיס 9. למרות חוסר חלופות שיטת HL העלתה חששות בשל (i) הטיות אפשריות הנובעות מתמוגה לא רצויה של חיידקים ו( ii) אם התנודות שנצפו בהרכב קהילת 9,10 הם תוצר של תנודות הקשורות לעיבוד המדגם. בנוסף לדור של metagenomes רובה, אנו לטפל בבעיות אלה על ידי השוואת הפרופילים גנטי 16S rRNA של DNA הכולל וDNA של חיידקים שחולץ מן שיטת HL באמצעות אותה הקבוצה של דגימות כיח שנאספו ממטופל אחד על פני שבעה ימים רצופים.

אף אוזן גרון "> בהשוואה לקהילות חיידקים, האפיון של קהילות נגיפיות הקשורים לבעלי חיים הוא מוגבל 18,19 קהילות ויראלי בדרכי נשימת CF יש רק מאופיינות מינימאלית 20 -.. 22 המחקר metagenomic הראשון המאפיין את ה- DNA של קהילות ויראלי בדרכי נשימת CF הראה כי רוב הווירוסים הקשורים לריאות CF הם פאגים 20. הפוטנציאל המטבולי של הפאג בCF ויחידים שאינם CF היה שונה באופן משמעותי. באופן ספציפי, קהילות הפאג באנשי CF נשאו גנים רעיוני של עיבודי מארח חיידקים לפיסיולוגיה של דרכי הנשימה CF, ומחקרי חיידקי ארסיות 20. לאחר metagenomic של וירוסים ברקמת הריאה CF הפגינו ההטרוגניות המרחבית שונה של קהילות נגיפיות בין אזורים אנטומיים 22. בנוסף, רקמת הריאה CF טיפחה את המגוון הנגיפי הנמוך ביותר שנצפה עד כה בכל מערכת אקולוגית 22. רוב הווירוסים שזוהו היו פאגיםעם הפוטנציאל להדביק פתוגנים CF. עם זאת, וירוסים האיקריוטים כגון herpesviruses, אדנו-וירוסים, ווירוסי הפפילומה אנושיים (HPV) היו גם זוהו. באירוע אחד, שבו ציסטות ברקמת הריאה נצפו במהלך נתיחה, יותר מ 99% מהגנום וירוס הפפילומה אנושי היה התאושש, למרות שהמטופל מעולם לא אובחן עם הפפילומה או קרצינומה של ריאות. זה מצביע על כך הווה הגיוון הנגיפי משקף לא רק את חומרת נזק לרקמות, אלא גם עלול לחשוף ולהסביר מחלה uncharacterized בסיסית. הפרוטוקולים שתוארו כאן מספקים דרך פשוטה, אך רבת עוצמה לבודד את חלקיקים נגיפיים דמוי (VLPs) מדגימות שמורכבות מכמויות גדולות של ריר סמיך, מארח ותאי חיידקים, DNA החופשי, כמו גם פסולת תא.

משלים metagenomics, metatranscriptomics משמש כדי לפקח על הדינמיקה בביטוי גנים ברחבי קהילת החיידקים והמארח 9,23. במקרה זה, שני חיידקים והוזt mRNA צריך להיבחר באופן מועדף. מאז mRNAs חיידקים אינם polyadenylated, לא ניתן לנצל שיטה נפתחת mRNA מבוסס אוליגו-DT. ההגברה RNA polyadenylation תלוי לא ניתן להשתמש בדגימות הקשורים מארח אם הדגימות ידועות מכילות כמויות גדולות של mRNA אוקריוטים. דוגמאות רבות הקשורים בבעלי חיים, כוללים ליחה CF, מכילות צפיפות גבוהה של תאים בנוסף לסכומים גבוהים של פסולת הסלולר וnucleases הכוללים RNases. לכן, עוד משימה מאתגרת היא למנוע השפלה RNA נרחבת במהלך metatranscriptome עיבוד. ברוב המקרים, רנ"א הכל חולץ מליחת CF הוא מושפל באופן חלקי, המגביל את היישומים ושירות במורד הזרם של RNA נגזר. בשנים האחרונות, במספר גישות לדלדול rRNA פותחו והותאמו בערכות זמינות מסחרי. היעילות של גישות אלה עם זאת מוגבל, במיוחד כשעובדים עם אופן חלקי מושפל 9,24 rRNA. השיטות המועסקות כאן לאפשרed לאחזור של רנ"א הכל המושפל באופן חלקי המתאים להסרה מוחלטת rRNA במורד הזרם יעיל. השוואה ישירה של היעילות בהסרת rRNA מרנ"א הכל המושפל באופן חלקי השוואת שתי ערכות שונות שהומחש על ידי אל Lim et. (2012) 9.

בסך הכל, המטרה של כתב היד הזה היא לספק סט שלם של פרוטוקולים (איור 1) כדי ליצור metagenomes רובה נגיפי וחיידקים, וmetatranscriptome, ממדגם הקשורים לבעלי חיים יחיד, תוך שימוש במדגם ליחה נגרם כדוגמא. עבודה מעבדה מולקולרית צריכה לכלול אזורים נפרדים הגברה לפני ואחרי כדי למזער את הזיהום צולב. השיטות להתאמה בקלות לסוגי מדגם אחרים, כגון רקמה 22, אף ולוע ומטליות לוע תחתונים 25, שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL) ואלמוגים (נתונים שלא פורסמו). כל דגימה צריכה להיות מעובד מייד עם אוסף במיוחד כאשר metagenomics חיידקים ונפגשהמחקרי atranscriptomics הם רצויים. אם הדגימות הוקפאו, הוא מגביל את הבידוד של תאי חיידקים שלמים לmetagenomes חיידקים כהקפאת פוטנציאל לשבש את שלמות התא. עם זאת, הקפאה אינה מונעת metatranscriptomics ובידוד נגיפי, אבל איכות של RNA וכמות חלקיקים נגיפיים התאוששו עשויה להיות מושפע בתהליך ההפשרה הקפאה. חשוב לציין כי ליחה מושרה שימשה כמקור העיקרי של דגימות במחקרים רבים הקשורים לחולי CF מבוגרים ומחלות ריאה כרוניות אחרות 26,27 כBAL יכול להיות פולשני מדי. במחקרים שלנו, דגימות כיח נאספו עם שיטה זהירה ועקבית דגימה, כלומר, מי פה הבא ושטיפה של חלל הפה באמצעות תמיסת מלח סטרילית כדי לשמור על זיהום חיידקים אוראליים בתוך דגימות הליחה למינימום.

Protocol

הערה: דגימות כיח מושרה נאספו בהתאם לאוניברסיטת קליפורניה Institutional Review Board (HRPP 081,500) ומדינת אוניברסיטת Institutional Review Board סן דייגו (SDSU IRB # 2,121), על ידי רכז המחקר של אוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו (UCSD ) מרפאת CF המבוגר.

אוסף דוגמאות 1. וטיפול קדם (דוגמאות טרום לטפל בתוך 30 דקות לאחר גבייה)

  1. אוסף לפני לטעום, תווית ארבעה 15 מיליליטר צינורות כ: (i) metagenome ויראלי, (ii) metagenome חיידקים, (iii) metatranscriptome, ו( iv) ליחה נוספת. חזור על פעולה עבור כל דגימה. הוסף 2 מיליליטר של חרוזים סיליקה 0.1 מ"מ לתוך הצינור שכותרתו "Metatranscriptome", ואחריו 6 מיליליטר של חיץ מבוסס isothiocyanate guanidine תמוגה RNA (חיץ GITC-תמוגה).
  2. במהלך איסוף דגימה, להשתמש בפתרון סטרילי מלוח (60 מיליליטר) כשטיפת פה כדי למזער את הזיהום על ידי חיידקים פה. לאסוף דגימות כיח על פני פרק זמן של 30 דקות לאחרשאיפה של 4 מיליליטר של 7% מלוחים hypertonic באמצעות nebulizer. דגימות תהליך באופן מיידי, כפי שתתוארנה להלן.
  3. לדלל את המדגם כדי בהיקף כולל של 8 מיליליטר.
    1. להעריך נפח דגימה על ידי שקילת כוס כיח ריקה לפני ואחרי איסוף דגימה.
    2. אם הנפח של מדגם הוא פחות מ 8 מיליליטר, להוסיף כמות מתאימה של PBS 1x 0.02 מיקרומטר מסוננים כדי ליצור נפח דגימה כולל של לפחות 8 מיליליטר.
    3. מייד homogenize המדגם עם מזרק 3 מיליליטר עד גושים לא גלויים להישאר בליחה
    4. שימוש באותו מזרק, להכין 2 מיליליטר של ליחה ופנה מייד לשלב 1.4.
  4. שמירת RNA סה"כ מדוגמא הליחה
    1. להזריק 2 מיליליטר מדגם ליחה מצעד 1.3.4 לתוך הצינור "metatranscriptome" המכיל חרוזים סיליקה וחיץ GITC-תמוגה.
    2. סגור את המכסה ולאטום את הצינור בצורה מאובטחת עם Parafilm כדי למנוע דליפה.
    3. Homogenize הליחה מייד במהירות בינונית במשך 10 מילn. בהתאם לvortexer זמין, במקום הצינור אופקי ובטוח עם קלטת במידת צורך.
    4. שמור את הצינור על 4 מעלות צלזיוס או בתיבת קרח והובלה למעבדה במידת צורך.
  5. שימוש באותו המזרק, aliquot 2 מיליליטר של ליחה כל לתוך הצינורות שכותרתו "metagenome ויראלי" ו- "metagenome חיידקים" ולהעביר את הליחה שנותרה מכוס כיח לתוך הצינור שכותרתו "ליחה נוספת".
  6. אחסן את כל הצינורות בC 4 מעלות או תיבת קרח והובלה למעבדה במידת צורך.

2. יצירת ויראלי Metagenome

  1. הכנת המאגרים ופתרונות
    1. הכן 50 dithiothreitol מ"מ (DTT) מראש ולאחסן ב 4 ° C. זה יציב במשך 2 שבועות.
    2. הכן תמיסת מלח מגנזיום חיץ (SM) (250 מיליליטר): 1 M NaCl, 10 מ"מ MgSO 4, 50 מ"מ טריס-HCl; להתאים את ה- pH 7.4. סנן לעקר (גודל נקבובית 0.02 מיקרומטר) ולאחסן בטמפרטורת חדר. הכן DNase אני אנזים 100 U / μl (במי כיתה מולקולריים) מDNase לבלב שור lyophilized אני בהתאם לפעילות שהוגדרה על ידי יחידת Dornase / מ"ג משקל יבש.
    3. הכן 10x DNase אני חיץ (50 מיליליטר): 100 מ"מ MgCl 2, 20 מ"מ CaCl 2; להתאים את ה- pH 6.5. סנן לעקר (גודל נקבובית 0.02 מיקרומטר) ולאחסן בטמפרטורת חדר.
    4. הכן 4 paraformaldehyde%.
    5. הכן 200x TE מאגר: 2 M טריס- HCl (pH 8.5), 0.2 M EDTA. סנן לעקר (גודל נקבובית 0.02 מיקרומטר) ולאחסן בטמפרטורת חדר.
    6. הכן 10 מיליליטר של 10% Dodecyl נתרן גופרתי (SDS) שימוש במי כיתה מולקולריים.
    7. הכן 50 מיליליטר CTAB / NaCl (10% CTAB. 700 מ"מ NaCl) שימוש במי כיתה מולקולריים. לפזר CTAB הלילה. אם משקעים להתמיד, לחמם את הפתרון על 65 מעלות צלזיוס. הפתרון הוא צמיג מאוד בטמפרטורת חדר.
      הערה: הסינון של מאגרים באמצעות 0.02 מיקרומטר סינון מאפשר ההסרה של חלקיקים כמו-נגיפיים בתוך הפתרון, אבל לאזיהום חומצות גרעין חופשי.
  2. טיפול קדם לדוגמא
    1. הכן כמות מתאימה של dithiothreitol הטרי 6.5 מ"מ (DTT).
    2. לדלל את homogenate על ידי הוספת חיץ SM 0.02 מיקרומטר מסוננים כדי ליצור נפח כולל של 6 מיליליטר.
    3. כדי לסייע בפירוק ליחה, להוסיף נפח שווה (6 מיליליטר) של 6.5 dithiothreitol מ"מ (DTT) לדוגמא, מערבולת במרץ לערבב דגירה במשך השעה 1 ב 37 ° C.
    4. מערבולת המדגם שטופל בנחישות ובספין בשעה 10 ° C, 3056 XG במשך 15-20 דקות.
    5. לאסוף את supernatant לתוך צינור 15 מיליליטר חדש.
    6. חזור על שלב 2.2.3 ו2.2.5 לדוגמא הבאה.
    7. העברה ולסנן את supernatant עם מסנן 0.45 מיקרומטר רכוב על מזרק לתוך צינור 15 מיליליטר חדש.
      הערה: אם קבקבי המסנן, לאחזר את הדגימות מהמזרק ולהשמיט את צעד הסינון.
    8. קח subsample 100 μl של 0.45 המדגם מיקרומטר המסונן, לבצע כלורופורם וDNase אני טיפול (ראה section 2.3.12-2.3.15) ולהוסיף נפח שווה של paraformaldehyde 4% כדי לתקן את המדגם עבור מיקרוסקופיה epifluorescence (איור 2 א).
    9. לגישת העשרת חלקיקים נגיפיים "לתפוס-כל" (ראה דיון), עבור לשלב 2.3.12 להשמיט בחירת חלקיקים נגיפיים המבוסס על ultracentrifugation שיפוע צזיום כלוריד. עם זאת, זה עלול לגרום לזיהום חיידקי כלורופורם עמיד וכמות גבוהה יותר של המארח-DNA בlysate ויראלי.
  3. חלקיקים דמויי ויראלי (VLPs) העשרה וטיהור
    1. הכן פתרונות צזיום כלוריד הבודד (CsCl) על ידי המסת הכמות המתאימה של CsCl עם חיץ SM-מסונן שאינו לצפיפות הרצויה (1.7 גר '/ מיליליטר, 1.5 גר' / מיליליטר, 1.35 גר '/ מיליליטר, ו1.2 גרם / מיליליטר). לסנן כל פתרון דרך פילטר 0.02 מיקרומטר לפני השימוש.
    2. הגדר את שיפוע CsCl כפי שמוצג באיור 2.
    3. עומס 1 מיליליטר של 1.7 גר '/ מיליליטר לכל צינור, עומס 1 מיליליטר של 1.5 גר' / מיליליטר לכל צינור, עומס 1 מיליליטר של 1.35 גר '/ מיליליטר לכל צינור, עומס 1.2 גר '/ מיליליטר לכל צינור (לא חובה), ולבסוף לטעון מדגם מיליליטר 6-8 לתוך הצינור בהתאמה. שכבות בודדות מארק לציון מיקומו של כל חלק.
    4. לאזן כל זוג צינורות המתנגד לבתוך 1 מ"ג.
    5. לטעון בזהירות כל צינור לתוך דלי הספין. ספין כל הדליים גם אם הם ריקים. טען את דלי הספין על הרוטור.
    6. צנטריפוגה ב82844 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 2.
    7. בעקבות צנטריפוגה, להסיר בזהירות את הצינורות מהמחזיק מבלי לשבש את מפלי הצפיפות.
    8. באמצעות מזרק 3 מיליליטר עם מחט G 18, לחדור את הצינור ממש מתחת לג '/ מיליליטר שכבת צפיפות 1.5 (איור 2, חץ אדום) ולמשוך ~ 1.5 מיליליטר לתוך המזרק.
    9. לאסוף את החלק העליון על ידי הסרת לאט את המחט ומאפשר את השבר שנותר בצינור לטפטף לתוך צינור 15 מיליליטר חדש באמצעות הניקור. תווית זו כ" פסולת חלק עליונה ".
    10. לאסוף את g / ml fractio 1.5n (המכיל VLPs) מהמזרק על ידי ולהוציא את התוכן לשני צינורות microfuge חדשים.
    11. חזור על שלב 2.3.8-2.3.10 עבור כל הדגימות.
    12. להוסיף 0.2 בנפח של כלורופורם ללהתרכז ויראלי, לנער במרץ, דגירה על RT למשך 10 דקות, ספין במהירות מקסימלית של 5 דקות, ולאסוף את השלב המימי.
    13. הוסף חוצץ 10x DNase וDNase אני (ריכוז סופי = 2.5 U / μl) ללהתרכז ויראלי שטופל כלורופורם, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1.5-2 שעות.
    14. להשבית את פעילות DNase על 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    15. הסר 15 μl של chloroform- וחלק נגיפי שטופל אני DNase לתוך צינור חדש, ולהוסיף paraformaldehyde 15 μl 4% כדי לתקן את המדגם עבור מיקרוסקופיה epifluorescence.
  4. הפקת DNA
    1. תרכיזים נגיפיים בריכה מכל מדגם לצינור צנטריפוגות 50 ניקה וautoclaved מיליליטר Oak Ridge במהירות גבוהה.
    2. להוסיף את הדברים הבאים: מאגר 200x 0.1 הנפח TE, 10 μl 0.5 M EDTA לכל מיליליטר של יםבשפע, נפח של 1 פוראמיד, ו -10 גליקוגן μl. מערבבים היטב דגירה בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
    3. שימוש באמצעי האחסון החדש, להוסיף 2 כרכים של טמפרטורת חדר אתנול 100%. מערבבים היטב דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות.
    4. DNA גלולה ידי ספינינג הצינור ב17226 XG במשך 20 דקות, בשעה 4 ° C באמצעות הרוטור SS-34.
    5. בטל supernatant בזהירות באמצעות פיפטה סרולוגיות. שטוף את הכדור פעמיים עם אתנול 70% קרים כקרח.
    6. להסיר כמה שיותר נוזלים ככל האפשר ולאפשר לגלולה לאוויר יבש בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות.
    7. Resuspend גלולה DNA ב567 μl של חיץ 1x TE (pH 8.0).
      הערה: אפשר לפחות 15 דקות לresuspension מלא בטמפרטורת חדר. אחסן את ה- DNA resuspended לילה ב 4 מעלות צלזיוס עד עיבוד נוסף.
    8. העבר את כל 567 μl של פתרון ה- DNA המושעה לתוך צינור 1.5 מיליליטר microfuge חדש. הוסף 30 μl של SDS 10% מראש חימם ו -3 μl של proteinase K (20 _6; g / ml), ומערבב היטב דגירה במשך שעה 1 ב 56 מעלות צלזיוס. טרום חם CTAB / NaCl ב 65 מעלות צלזיוס.
    9. הוספה של 5 M NaCl 100 μl ומערבבים היטב. להוסיף 80 μl של פתרון CTAB / NaCl מראש חימם, מערבולת, ודגירה של 10 דקות על 65 מעלות צלזיוס.
    10. להוסיף נפח שווה של כלורופורם, מערבולת לערבב, וספין ב16100 XG במשך 5 דקות.
    11. מעביר את supernatant לצינור microfuge 1.5 מיליליטר חדש. הוסף נפח שווה של פנול / כלורופורם, מערבולת לערבב, וספין ב16100 XG במשך 5 דקות.
    12. מעביר את supernatant לצינור microfuge 1.5 מיליליטר חדש. הוסף נפח שווה של כלורופורם, מערבולת לערבב, וספין ב16100 XG במשך 5 דקות.
    13. מעביר את supernatant לצינור microfuge 1.5 מיליליטר חדש. להוסיף נפח שווה של isopropanol לשבריר supernatant, לערבב, ודגירה ב -20 ° C במשך לפחות 30 דקות.
    14. גלולה DNA, הספין ב16100 XG במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. פיפטה את supernatant בזהירות ולשטוף את הכדור פעמיים עם אתנול 70% קרים כקרח. לבצע ספין קצר ולהסיר את אתנול שנותר מהצינור. אוויר יבש גלולה במשך 15 דקות.
    15. Resuspend גלולה DNA עם 50 μl של חיץ elution (5 מ"מ טריס, pH 8.5). לאפשר לגלולה לרעננות במשך לפחות 5 דקות בטמפרטורת חדר.
    16. לכמת את ה- DNA באמצעות assay הקרינה מבוססת רגישות גבוהה.
  5. הגברה באמצעות Phi29 פולימראז (אופציונלית)
    1. הכן חיץ חישול 2x: 80 מ"מ טריס-HCl (pH 8.0), 20 מ"מ MgCl 2.
    2. לדלל פולימראז Phi29 DNA עד 5 U / μl.
    3. מאגר של טרום-תערובת מדגם, כולל את 50 פריימר μl האקראי hexamer (100 מיקרומטר), 125 חיץ חישול μl 2x, ו -25 מים μl. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
    4. המאגר של טרום-תערובת תגובה, מורכב של 100 μl חיץ Phi29 10x, 40 μl 10 מ"מ dNTPs, ומי 560 μl. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
    5. להוסיף תבנית ה- DNA μl 1 ל -4 חיץ מדגם μl.
    6. דגירה התערובת דואר על 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ומגניבות על קרח.
    7. להוסיף 14 μl של חיץ תגובה לתוך התערובת מ2.4.4, מערבב על ידי pipetting מעלה ומטה.
    8. הוסף 1 μl של פולימראז Phi29 DNA, מערבב על ידי pipetting מעלה ומטה, ולדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות ואחריו 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    9. לנקות את התגובות באמצעות עמודות הגנומי DNA או פנול / כלורופורם ומשקעי אתנול.
  6. Epifluorescence מיקרוסקופית (עיין האס et al. 2,014 28 להתקנת מערכת סינון)
    הערה: בעקבות בידוד וטיהור, מיקרוסקופיה epifluorescence עם צבעי חומצות גרעין יכולה לשמש כדי לאמת את הנוכחות וטוהר של חלקיקים נגיפיים בדגימות (2A דמויות ו2C). DNA חינם במדגם יכול להצמיח הקרינה רקע גבוהה. לכן, המדגם צריך להיות שטופל אני DNase לפני הקיבעון והכתים לmicrographs.
    1. הכן פתרון הר (חומצה אסקורבית 0.1%, 50% גליצרול). הוספה של 10% חומצה אסקורבית 100 μl 4.9 מיליליטר של פוספט 1x שנאגרו (PBS), ומערבב היטב. הוסף 5 מיליליטר של גליצרול 100% לתערובת, מערבב היטב ולתייג את הצינור כ" הר ".
    2. מסנן הר באמצעות מסנן 0.02 מזרק חד פעמי מיקרומטר מטריצת אלומינה, aliquot לתוך צינורות microfuge, ולאחסן ב -20 ° C.
    3. Aliquot של מדגם 100 μl לתוך צינור microfuge חדש ולהוסיף נפח שווה של paraformaldehyde 4% כדי לתקן את VLPs. דגירה את התערובת בטמפרטורת חדר למשך לפחות 10 דקות.
    4. הפוך את עוצמת הקול עד 1 מיליליטר על ידי הוספת 800 μl של 0.02 מים מסוננים מיקרומטר. הוסף 1 μl של כתם SYBR זהב לתוך צינור דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
    5. הגדר את מערכת הסינון על ידי הפעלת משאבת הוואקום בין psi -9 ו-10 (-62.1 ו-68.9 kPa).
    6. שטוף את הכן עם מים ומניח את מסנן מטריצת אלומינה 0.02 מיקרומטר עם טבעת תמיכת פוליפרופילן טבעתי לכן המסנן.
    7. הנח מגדל מסנן על גבי הדום המסנן עם המסנן ומאובטח עם מהדק.
    8. פיפטה התוכן מצינור microfuge 1.5 מיליליטר למגדל המסנן, ולאפשר כמה דקות למדגם לסנן דרך.
    9. התווית ופיפטה 10 μl של מגיב הר לשקופיות מיקרוסקופיות.
    10. השאר את הוואקום בעת הסרת מגדל המסנן ומהדק.
    11. מוציא בזהירות את המסנן מדום המסנן ולמחוק את חלקו התחתון של המסנן עם Kimwipe, ואז למקם את המסנן ישירות על ראש ההר בשקופית המיקרוסקופית.
    12. פיפטה עוד 10 μl של מגיב הר על המסנן ובמקום coverslip על המסנן.

3. יצירת החיידקים Metagenome

  1. הכנת מאגרים ופתרונות
    1. הכן 50 מיליליטר של חיץ 1x DNase: 50 מ"מ NaAc, 10 מ"מ MgCl 2, 2 מ"מ CaCl 2; להתאים את ה- pH 6.5. סנן לעקר (0.22 מיקרומטר) וחנותבטמפרטורת חדר.
    2. הכן DNase אני אנזים 1000 U / μl (במי כיתה מולקולריים) מDNase לבלב שור lyophilized אני בהתאם לפעילות שהוגדרה על ידי יחידת Dornase / מ"ג משקל יבש.
    3. הכן של חיץ SE 100 מיליליטר: 75 מ"מ NaCl, 25 מ"מ EDTA; להתאים את ה- pH 7.5. סנן לעקר (0.22 מיקרומטר) ולאחסן בטמפרטורת חדר.
  2. טרום טיפול מדגם לפני הפקת DNA
    1. לדלל את homogenate על ידי הוספת 5 כרכים של PBS 1x 0.22 מיקרומטר מסונן. לדוגמא, להוסיף 10 מיליליטר של 1x PBS לתוך 2 מיליליטר של מדגם.
    2. להוסיף β-mercaptoethanol עד 2% (V / V) ריכוז סופי. רוק התערובת (במנדף הכימי) בטמפרטורת חדר למשך שעה 2.
    3. ספין המדגם ב 10 מעלות צלזיוס ו3056 XG במשך 15 דקות, ולהשליך supernatant.
    4. Resuspend גלולה ב 10 מיליליטר של מים כיתה מולקולריים (או 0.22 מיקרומטר מים מסוננים), ודגירה בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות.
    5. חזור על שלבים 3.2.3 ו3.2.4 פעם.
    6. SPIn ב 10 ° C ו3056 XG במשך 15 דקות, ולהשליך supernatant.
    7. Resuspend גלולה ב 5 מיליליטר 1x חיץ DNase ולהוסיף 15 DNase μl אני (1000 U / μl) לכל מיליליטר של מדגם.
    8. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם הערבוב חוזר ונשנה לשעה 2.
    9. להשבית את פעילות DNase על 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    10. ספין על 10 מעלות צלזיוס ו3056 XG במשך 15 דקות, ולהשליך supernatant. Resuspend גלולה ב 10 מיליליטר חיץ SE.
    11. חזור על שלב 3.2.10.
    12. ספין על 10 מעלות צלזיוס ו3056 XG במשך 15 דקות, ולהשליך supernatant.
    13. Resuspend גלולה ב 2 חיץ מיליליטר SE, ולהעביר לשני צינורות microfuge.
    14. גלולה התאים בצינורות microfuge. ספין הצינורות ב 16100 XG בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות.
    15. הסר את supernatant ולחלץ DNA מתאי הטבליות באמצעות ערכה הגנומי DNA חילוץ, פרוטוקול וריאציה גרם-חיובי.

4. יצירת Metatranscriptome

  1. טרום מדגם-treatment
    1. בצע תמוגה המכנית של תאים על ידי מכות חרוז במאגר GITC-תמוגה מייד לאחר איסוף דגימה ולתפעול. ראה שלב 1.4.
    2. ספין את התערובת על 4 מעלות צלזיוס ו 600 XG במשך 5 דקות עד גלולה חרוזים סיליקה.
    3. מעביר את supernatant לתוך צינור חדש.
    4. הוסף 200 μl של כלורופורם לכל 750 μl של חיץ GITC-תמוגה משמש, לנער במרץ ביד במשך 15 שניות, דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות, וספין על 4 מעלות צלזיוס ו3056 XG במשך 15 דקות. במהלך 15 דקות הספין הזה, להתכונן לשלב 4.2.
    5. אחרי ספין 15 דקות (הפרדה ברורה של צורות שלב שלב-הביניים-אורגניים מימיות), לחלץ את השלב המימי (מבלי לשבש את שלבי ביניים) לצינור חדש ללא RNase (ים).
      הערה: השלב המימי מכיל RNA. שמור את הצינורות על קרח עד לשלב הבא.
  2. לבצע הפקת RNA מוחלטת וטיהור באמצעות ערכות זמינות מסחרי המבוסס על טור טיהור RNA או conveהממטרים RNA ntional מבוסס isopropanol.
    1. טיהור RNA המבוסס על טור סיליקה
      1. מדוד את הנפח הכולל של החלק המימי שהושג.
      2. להוסיף נפח מתאים של חיץ מחייב RNA לדגום ומערבבים היטב.
      3. התאם תערובת לנכס את המצב מחייב על פי הפרוטוקול של היצרן. מערבבים היטב ולעשות סיבוב קצר.
      4. טען את התערובת לתוך RNA-הטור. לדוגמא נפח גדולה, להשתמש בטעינה מרובה ולטעון כל עמודה עד 4x. אחרת, שקלו להשתמש בעמודות מרובות עבור כל דגימה.
      5. לשטוף את העמודה מתאימה על פי הפרוטוקול של היצרן.
      6. Elute RNA עם לפחות 30 μl מים RNase חינם. Double-elution מעט תהיה להגדיל את התשואה של RNA. עם זאת, זה יהיה לדלל את ריכוז RNA.
      7. למדוד את ריכוז RNA ולהמשיך ישירות לDNase אני טיפול. השתמש Bioanalyzer כדי לבדוק את האיכות של RNA (מומלץ).
      8. RNA רטיבות
        1. להוסיף נפח שווה של isopropanol (למשל, 500 μl של isopropanol לתוך 500 μl של חלק המימי) ו- 2 μl של 10 מיקרוגרם / גליקוגן RNase ללא μl למדגם.
        2. דגירה את התערובת בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
        3. ספין ב XG 12,000 ו -4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
        4. מוציא בזהירות את supernatant, להוסיף 1 מיליליטר של אתנול 75% RNase חינם. ספין את התערובת על 7,500 XG ו- C ° 4 במשך 5 דקות כדי לוודא גלולה היא ללא פגע.
        5. מוציא בזהירות את אתנול.
        6. חזור על שלבים 4.2.2.4 ו4.2.2.5 פעם.
        7. אוויר יבש גלולה במשך 10 דקות.
        8. רעננותם את הכדור ב 50 μl מים RNase ללא, לדגור על 55 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהמשיך ישירות לטיפול DNase. השתמש Bioanalyzer כדי לבדוק את האיכות של RNA (מומלץ).
        9. RNA החנות aliquots ב -20 ° C, או -80 ° C לאחסון לטווח ארוך.

Representative Results

Metagenomes ויראלי

ליחה צמיגה CF היא יוצא דופן והוא מכיל כמות גבוהה של mucin וDNA החופשי (איור 2 א); ultracentrifugation שיפוע הצפיפות מאפשר חיסול DNA המופק ממארח ​​(איור 2). התוצאות ממחקר קודם 9 מראה שמונה viromes שנוצר מהעבודה שהוצגה מסוכמות כאן (טבלת 1). שבע דגימות (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A, וCF5-B; טבלת 1) עובדו כאמור בסעיף 2. viromes נוצר הכיל מעט (0.02 % -3.7%) רצפי אדם נגזר עם רק חריג אחד (70%). CF4-הושמט מצעד ultracentrifugation שיפוע צפיפות (CF4-A) וvirome שנוצר מהמדגם הספציפי הזה הכיל רצפי> 97% אדם נגזר (טבלת 1). איור 2 מראה דוגמא של התמונה מיקרוסקופית של epifluorescence טיפוסי CF sputuמדגם מ 'לפני (איור 2 א) ואחרי ultracentrifugation שיפוע צפיפות (איור 2 ג). חלקיקים נגיפיים ברורים-כמו (VLPs) נצפו בmicrographs ללא חלקיקים גדולים הבאים הפרדת שיפוע צפיפות. לאחר מיצוי DNA VLPs, זיהום חיידקים לעתים קרובות נבדק באמצעות ההגברה 16S rDNA לפני הרצף של VLPs DNA.

Metagenomes החיידקים

שבע דגימות כיח המוצגים כאן נאספו ממטופל CF יחיד על פני שבעה ימים רצופים. החולה החל באנטיביוטיקה דרך הפה (ציפרופלוקסאצין ודוקסיציקלין) ביום 3 לאחר כיח נאסף. הנפח של כל דגימת כיח שנאסף ממטופל זה היה 15 מיליליטר בכל 7 ימים; לכן, PBS לא הוסיף למדגם. המטרה של אירוע דגימה זו הייתה להעריך את הפרוטוקולים שהוצגו בעבודה זו על ידי (i) הערכת התנודות יומיות של מבנה קהילת חיידקים, וכן (ii) להשוותמבנה חיידקי הקהילה ורזולוציה בין metagenomics ורצף 16S rDNA. לכן, DNA הכולל וHL-DNA חולצו מכל מדגם.

ריכוז HL-DNA של כל דגימת כיח הבא מיצוי DNA מוצג בלוח 2. התשואה הכוללת של HL-DNA נעה בין 210 ng ל> 5 מיקרוגרם. ספריות רצף Illumina נוצרו עם חומר המוצא כולל של 1 ng עבור כל דגימה (איור 3). המאפיינים של נתונים metagenomics מוצגים בטבלה 2. אבל כל ספרייה אחת הניבה יותר מ 1 מיליון רצפים ורצפים באיכות גבוהה יותר מ- 85% היו נשמרת בעת עיבוד המקדים נתונים באמצעות תוכנת PRINSEQ 29. כל מערכי נתונים שעברו עיבוד ראשוני ראשון כדי להסיר כפילויות ורצפים של איכות נמוכה (ציון איכות מינימאלית של 25), ואחריו הקרנה וההסרה של רצפי אדם נגזר באמצעות 30 DeconSeq נוספות. הסכום של בני-deזיהום רצף מבוקע תלוי מאוד במאפייני המדגם. הנה, את הסכום הכולל של רצפי אדם נגזר נע 14-46% (טבלה 2). רצפי העיבוד הראשוניים ולאחר מכן היו מפורשים בשימוש בצינור Metaphlan 31 כמו גם שרת MG-RAST 32.

בנוסף לmetagenomes, ספריות amplicon 16S rDNA נוצרו משני DNA הכולל וHL-DNA באמצעות פריימרים מיקוד כ -300 נ"ב באזור משתנה V1-V2 בגן 16S rRNA 33,34. מוצרי PCR מדגימות בודדות היו מנורמלים ונקוו לרצף באמצעות הרצף לזווג-סוף Illumina 500 מחזור שבוצע על פלטפורמת MiSeq. רצפי amplicon מותאם-סוף 16S rDNA מוינו על ידי מדגם באמצעות ברקודים באמצעות סקריפט פייתון והמותאם קורא נאספו באמצעות phrap 35,36. קצות רצף מורכבים היו גזוז עד ציון האיכות הממוצעת היה ≥20 באמצעות חלון 5 NT. מפלצות פוטנציאל היוn להסיר באמצעות Uchime 37 נגד קבוצת משנה ללא הכימרה של רצפי התייחסות סילבה 38. Taxanomy הוטל על האיכות הגבוהה קוראת עם SINA 39 (גרסה 1.2.11) באמצעות 418497 רצפי חיידקים מבסיס נתוני סילבה 38. רצפים עם משימות הטקסונומית זהות היו מקובצים לייצר יחידות מבצעיות טקסונומי (OTUs). תהליך זה נוצר 1655278 רצפים במשך 16 דגימות (גודל ממוצע: 103455 רצפים / מדגם; דקות: 72603; מקסימום: 127113). הציון מוצרי חציון הכיסוי, מידה של שלמות של רצף, היה ≥ 99.9%. חבילת תוכנת Explicet 40 (v2.9.4, www.explicet.org) שימש לניתוח ודור דמות. Alpha-גיוון (פנים-מדגם) ובטא גיוון (בין מדגם) חושבו בExplicet בנקודת 72603 רצפים עם מחדש דגימות 100 bootstrap ואקום.

השאלה הראשונה על כוונת של מחקר זה הייתה האם preferenti תמוגה hypotonicברית בוחרת ל( כלומר, מעדיפים שומרת או lyses) קבוצות מסוימות של חיידקים. לאחר תמוגה hypotonic הראשונה, מחדש תלויים תאי pelleted היו subsampled משתי הדגימות הראשונות (CF1-1A * וCF1-2A *) כדי להשוות עם אותו הדגימות לאחר תמוגה hypotonic השנייה (CF1-1and CF1-2). טופלו כל הדגימות באופן שווה, כלומר, שטופלו בDNase אני לפני מיצוי DNA, ואחרי מיצוי DNA וצינור הרצף. כפי שניתן לראות באיור 4, פרופילי החיידקים של subsamples דומים מאוד לדגימות לאחר שני טיפולי תמוגה hypotonic. בנוסף, תמוגה hypotonic השנייה מגדילה את החלק היחסי של רצפים שאינם בני אדם על ידי 6-17% בתוך metagenomes (טבלה 2).

כדי לבדוק הבדלים בהרכב חיידקים בין metagenomic- ואפיון מבוסס rDNA 16S, ולשינויים לפני ואחרי תמוגה hypotonic שעשוי להסביר את ההבדלים ראו בעבר בין ההרבעה שלנוies ואחרים, ספריות רצף 16S rDNA חיידקים נוצרו משני DNA הכולל וDNA נגזר HL (איור 4). ברמת סוג, פרופילי טקסונומיה של החיידקים הקשורים CF הנפוצים כגון Pseudomonas, Stenotrophomonas, Prevotella, Veillonella, וStreptococcus היו דומים מאוד בין ספריות 16S rDNA וmetagenomes שנוצרו מDNA הנגזר HL. עם זאת, זיהוי Rothia בספריות 16S rDNA לא היה בשפע כמו עם ספריות metagenomic. כאשר משווה את פרופילי המיון השונים 16S rDNA שנוצרו מDNA הכולל וDNA נגזר HL, Pseudomonas היה מיוצג באופן דיפרנציאלי בDNA הכולל בהשוואה להתחלת DNA הנגזר HL מיום 3.

Metatranscriptomes

בדרך כלל, רנ"א הכל חולץ מליחת CF הוא מושפל באופן חלקי והגודל נע בין 25-4,000 bps (5A דמויות ו et al. 2,012 9. את החלק יחסי של rRNA בתוך metatranscriptomes המדולדל שאינו נע 27-83%, והשפע היחסי של rRNA מגוון על פני דגימות (לוח 3; הנתונים שחולצו מהים ואח '9.). עם זאת, דלדול עם ערכת Ribo-Zero ירד השפע היחסי rRNAs של rRNA ל1-5% למעט מדגם CF1-F. הווריאציה ביעילות של הסרת rRNA יכולה לשקף את האיכות של RNA שחולץ, או הבדלים בהווה קהילת החיידקים, ולכן הנגישות של rRNAs לבדיקות הכלאה 9. Electropherograms של מוצלחים (איור 5) ולא מוצלח הליך ההסרה (איור 5D) rRNA שימוש בערכת הסרת Ribo-Zero rRNA שונה, שבו פסגות rRNA נראות בהסרה מוצלחת.

טווח הגודל של cDNA ספריות generated לעתים קרובות משקף את מגוון גודל מדגם RNA מתחיל. ספריות cDNA מוצגות כאן נוצרו עם ערכת הגברה transcriptome שלמה (WTA2) על דלדול rRNA אחרי Roche-454 הכנת ספריית רצף 9. CDNA שנוצר להכיל שברים החל 50-4,000 bps (5E דמויות ו5F) ועולה בקנה אחד מאוד על פני דגימות (Lim et al. 2012) 9. הזמינות של ערכות פלטפורמה ספציפית אחרות RNA-Seq הכנת ספרייה מספקת כיום יותר אפשרויות חלופיות לאחד לשלב סינתזת cDNA והכנת ספריית רצף בתנאים אופטימליים. אפשרות מומלצת אחת עד כה היא ערכת זהב מלא ScriptSeq שילוב חומרים כימיים rRNA ההסרה מומלצים לעיל וערכת הכנת ספריית RNA-Seq.

איור 1
איור 1: Workflow להכנה aration של דגימות הקשורים מארח, כגון מדגם ליחה, לvirome, Microbiome, ורצף metatranscriptome.

איור 2
איור 2: ultracentrifugation צזיום כלוריד מפלי צפיפות להקל על חיסולו של DNA תאי וחלקיקים גדולים (), ולאפשר לבידוד אופטימלי של חלקיקים כמו-נגיפיים מCF ליחה. מיליליטר אחד של כל שיפוע שכבות על גבי כל אחד אחר לפני טעינת המדגם שטופל מראש (B). בידוד החלקיקים הבאים וטיהור, מיקרוסקופיה epifluorescence עם צבעי חומצת גרעין כגון SYBR זהב משמשים לאימות הנוכחות וטוהר של חלקיקים נגיפיים בדגימות. חלקיקים נגיפיים ברורים-כמו (C; חץ לבן) נצפו הבא הפרדת שיפוע הצפיפות של מדגם הליחה CF.

לשמור-together.within-page = "תמיד"> איור 3
איור 3:. סכום דוגמא להתפלגות הגודל של ספריות Nextera XT שנוצרו מng 1 של HL-DNA שהביא microbiomes כיח CF נורמליזציה הספרייה, איגום, וטעינה נעשה כמתואר בפרוטוקול היצרן ללא כל סטייה.

איור 4
איור 4: ניתוח הטקסונומי של קהילות חיידקים בתשע דגימות שנאספו מlongitudinally חולה CF אחד () פרופילי מיקרוביאלית מבוססים על ספריות metagenomic שנוצרו מDNA מבוסס שיטת תמוגה hypotonic.. משימת המינים התבססה על העיבוד המקדים נתונים הצינור הבא Metaphlan שלהסיר כפילויות ורצפים עם איכות נמוכה והומולוגיה ברצף אנושי. כדי להראות ששני-steps תמוגה hypotonic לא עשתה מעדיף בוחרת עבור קבוצות מסוימות של חיידקים, subsamples (*) לאחר תמוגה hypotonic הראשונה נכללו. (ב) פרופילי מיקרוביאלית מבוסס על אזור V1V2 של רצף גן 16S rRNA מDNA הכולל (T) ושיטת תמוגה hypotonic DNA מבוסס (HL). נתונים אלה לא פורסמו בעבר.

איור 5
איור 5: דוגמאות של 2100 electropherograms Bioanalyzer Agilent של RNA (AD) וcDNA (EF) שנוצרו עבור ספריות metatranscriptomic, באמצעות פיקו RNA וצ'יפס dsDNA רגישות גבוהה בהתאמה. (א) ו- (ג) להראות את דוגמאות של electropherograms לפני הליכי הסרת rRNA. Electropherograms של מוצלח (B) והליך ההסרה (D) rRNA לא מוצלח באמצעות כוללת ערכת הסרת rRNA שונה במקצת,t שrRNA פסגות נראה בהסרה מוצלחת. טווח הגודל של cDNA (EF) שנוצר באמצעות הערכה השלמה-transcriptome הגברה (סיגמא אולדריץ ') דומה לטווח הגודל של RNA-מדולדל rRNA מתחיל, ומתואם היטב על פני שני המדגמים שונים. אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.

CF1-D CF1-E CF1-F CF4- CF4-B CF4-C CF5- CF5-B
מספר כולל של קורא 224859 87891 106189 93301 140020 1,558 272552 217438
עיבוד מקדים קורא 109389 73624 67070 82011 68617 1,137 215808 158432
49% 84% 63% 88% 49% 73% 79% 73%
מספר הבסיסים 47239573 33351525 28922479 27667695 29386841 243986 95205805 69581811
אומר אורך קריאה 432 453 431 337 428 215 441 439
רצפי מארח ב 240 526 28 79774 13 797 585 5859
0.21% 0.71% 0.04% 97.27% 0.02% 70.10% 0.27% 3.70%
ג להיטי ויראלי 7214 23550 4070 737 4642 22 6466 5981
6.59% 31.99% 6.07% 0.90% 6.77% 1.93% 3.00% 3.78%
לא הוקצה קורא ד 103888 60490 32780 1,935 68440 311 105612 119551
94.97% 82.16% 48.87% 2.36% 99.74% 27.35% 48.94% 75.46%
קורא אחרי נתונים מראש processing ידי PRINSEQ 29.
ב האדם קורא זוהה על ידי 30 DeconSeq תוספת קורא עם להיט הכי טוב BLASTn (מסד נתונים נוקלאוטיד צמח השדה) מַעֲרָכָה Chordata.
ג tBLASTx פוגע נגד בסיס הנתונים הגנום נגיפי בבית. אחוז חושב באמצעות המספר הכולל של העיבוד ראשוני קורא.
ד קורא ללא BLASTn פגע מול מסד הנתונים של נוקלאוטיד צמח השדה. אחוז חושב באמצעות המספר הכולל של העיבוד ראשוני קורא. חלק קורא ללא BLASTn פגע מול מסד הנתונים של נוקלאוטיד צמח השדה זוהו כויראלי ברמת חלבון בניתוח tBLASTx.

טבלה 1:. מאפייני ספרייה של שמונה viromes שנוצר מדגימות כיח באמצעות זרימת עבודה שהוצגה בטבלה זו מופק מים <em> et al. (2012) 9. שבע דגימות (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A, וCF5-B) עובדו כאמור בסעיף 2 ונוצר viromes שהכיל מעט (0.02% - 3.7 %) אדם הנגזר רצפים עם חריג אחד (70%). CF4-הושמט מצעד ultracentrifugation שיפוע צפיפות (CF4-A) וvirome נוצר שהכיל רצפי אדם נגזר> 97%.

לדוגמא ריכוז תשואה סה"כ מס 'סה"כ קורא מס 'סה"כ קורא (ב מעובד) רצפים שאינם בני אדם
(Ng / μl) (Ng) (Raw) (%)
CF1-1A * 2.3 1098454 937688 691541
74%
CF1-1 13 1,300 2212756 1958910 1574520
80%
CF1-2A * 2.1 210 672878 588106 407530
69%
CF1-2 5.2 520 1944012 1697010 1455174
86%
CF1-3 28.8 2,880 1048304 896756 560852
63%
CF1-4 24.1 2,410 1154922 984702 621098
63%
CF1-5 33.6 3,360 1029622 888630 481548
54%
CF1-6 43.2 4,320 1434016 1256504 725858
58%
CF1-7 57.8 5780 1000174 872036 565376
65%
* 1 מיליליטר של מדגם subsampled מCF1 -1 וCF1-2 הבא הצעד הראשון hypotonic תמוגה (שלב 3.1.5) לפני הליך תמוגה hypotonic השני. התאים היו הסתחררו מטה כפי שמתוארים ב3.1.7 ולהמשיך דרך הפרוטוקול שנותר ללא כל שינוי.
Illumina בלתי מעובד קורא מ2 x 300 ריצת רצף MiSeq נ"ב.
ב קורא הוערכו, גזוז, והוציאו מבוסס על איכות ואורך כמתואר בדיון.

טבלה 2:. מאפייני microbiomes שנוצר מדגימות כיח באמצעות זרימת עבודה הציגה ריכוז ה- DNA של כל דגימה ב100 חיץ μl elution (5 מ"מ טריס / HCl, pH 8.5) ואת המאפיינים של נתוני רצף מוצגות. כולל של 1 ננוגרם היה לשמש ליצירת ספרייה בודדת באמצעות ערכת הכנת ספריית Nextera XT.

0 "fo: לשמור-together.within-page =" תמיד "> לדוגמא CF1-D CF1-F CF4-B CF4-C טיפול אף אחד Ribo-Zero אף אחד Ribo-Zero אף אחד Ribo-Zero אף אחד Ribo-Zero עיבוד מקדים קורא 2,088 1,991 40876 25238 19728 32737 31791 36172 אומר אורך קריאה 275 245 262 270 233 259 240 267 סה"כ rRNA קורא 1,737 91 29499 17267 5285 291 16371 1,761 83.20% 4.60% 72.20% 68.40% 26.80% 0.90% 51.50% 4.90% החיידקים rRNA 1,414 32 19978 12035 23 227 6916 1,076 67.70% 1.60% 48.90% 47.70% 0.10% 0.70% 21.80% 3.00% Eukaryota rRNA 323 59 9,520 5232 5262 64 9455 683 15.50% 3.00% 23.30% 20.70% 26.70% 0.20% 29.70% 1.90% % הוסרו rRNA * 0% 95% 0% 5% 0% 97% 0% 91% ללא rRNA קורא 351 (16.8%) 1,900 (95.4%) 11377 (27.8%) 7971 (31.6%) 14443 (73.2%) 32446 (99.1%) 15420 (48.5%) 34411 (95.1%) להיטי NR סה"כ 102 (4.9%) 691 (34.7%) 3327 (8.1%) 2,857 (11.3%) 4938 (25.0%) 10751 (32.8%) 5905 (18.6%) 15766 (43.6%) אוקריוטים 74 407 2,790 2,524 4,614 10227 4553 8274 חיידקים 26 283 520 312 287 471 1,326 7442 לא הוקצה קורא 249 (11.9%) 1,209 (60.7%) 8050 (19.7%) 5114 (20.3%) 9505 (48.2%) 21695 (66.3%) 9515 (29.9%) 18645 (51.5%) * הסכום של rRNA הוסר מבוטא כאחוז מהסכום הנוכחי בaliquot המדולדל שאינו.

לוח 3:. מאפייני ספרייה של metatranscriptomes עם ובלי דלדול rRNA הנתונים מופקים מים ואח '(2012) 9, שבה יש השוואה נוספת של ערכות הסרת rRNA אחרות ואת ההשפעה של cDNA עִרפּוּל לפני הכנת ספריית רצף..

Discussion

Metagenomics ויראלי

חלקיקים נגיפיים מרוכזים באמצעות פוליאתילן גליקול ממטרים (PEG) או ריכוז נפח קטן. במקרים מסוימים, ייתכן שלא יהיה צורך בריכוז, אבל מראש סינון או צעדי צנטריפוגה במהירות נמוכים משמשים להסרת תאים האיקריוטים וחיידקים. lysates ויראלי יהיה מועשר יותר ומטוהר באמצעות ultracentrifugation צפיפות שיפוע 9,41 או מסנני גודל קטנים (למשל, 0.45 מיקרומטר) להסרת תאי חיידקים האיקריוטים וגדולים 25. ultracentrifugation שיפוע צפיפות מבוצע בדרך כלל עם פתרונות צפופים אבל אינרטי כגון כלוריד סוכרוז או צזיום לבודד ולהתרכז חלקיקים נגיפיים 41. הפרדה פיזית מבוססת על הגודל וצפיפות קלילה של חלקיקים נגיפיים. לכן, בחירה נכונה של גודל נקבובית מסנן וההכנה הקפדנית של מילויים הן חיוניים לבודד את הקהילות נגיפיות ספציפיות, כמו ההצלחה של ההתאוששות הפיסית שלVLPs קובע את הקהילה מבודדת 41 (כלומר, חלקיקים נגיפיים שאינו עוברים דרך המסנן או נפילה בתוך צפיפות החילוץ לא יזוהה בmetagenome). לאחר בידוד וריכוז נגיפיים, ייתכנו זיהום נוכחי חומר הגנומי שאינו נגיפי במדגם הן בצורה של חומצות גרעין וחופשיות של חיידקים ותאים האיקריוטים. לכן, זה קריטי כדי לוודא את טוהר של חלקיקים נגיפיים בדגימות (איורים 1 א ו -1 B). טיפול כלורופורם משמש בדרך כלל לlyse תאים הנותרים, ואחריו טיפול nuclease להשפיל חומצות גרעין חופשיות לפני מיצוי חומצות גרעין.

אזהרה לעבודה שהוצגה הייתה השימוש בהפרדת שיפוע צפיפות לבודד חלקיקים נגיפיים כפי שהוא עשוי לכלול חלקיקים נגיפיים עטפו שעשויה להיות קליל מדי כדי להזין את שיפוע CsCl. חלופי "לתפוס את כל-" השיטה היא להשמיט separ שיפוע הצפיפותation ולבודד את ה- DNA הקהילה מ0.45 מיקרומטר - filtrates טופל בכלורופורם וDNase I. גישה זו היא גם מתאים כדי להתאים כרכי מדגם קטנים כמו אלה ממטליות או פלזמה דם. עם זאת, זה עלול לגרום לזיהום חיידקי כלורופורם עמיד וכמות גבוהה יותר של DNA תאי DNase I-עמיד.

פרוטוקולי רצף הנוכחיים דורשים 1 ng עד 1 מיקרוגרם של חומצות גרעין להכנת ספריית רצף לפי תשואות DNA גבוהות יותר לספק מבחר רחב יותר של אפשרויות סידור. ריכוז ה- DNA של viromes נוצר לעתים קרובות נע בין מתחת לסף הגילוי ליותר מ -200 ng / μl. הסכום של חומצות גרעין נגיפיות התאוששו עשוי להיות מספיק להכנת ספריית רצף ישירה. במקרים כאלה, הגברה חומצות גרעין היא חיונית. ספריות הגברה רובה לינקר (LASLs) 2,42,43 והגברת הגנום כולו מבוססת על הגברה עקירה מרובה (מד"א) הן שנישיטות נפוצות ביותר ליצירת DNA מספיק עבור סידור. שיטות מד"א כגון אלה המבוססים על DNA פולימרז Phi29 ידועות סובלות מהטיות הגברה, ואולי מעדיפים להגביר ssDNA וDNA המעגלי, וכתוצאה מכך המיון שונה שאינו כמותיים ואפיון פונקציונלי 44,45. גרסה מותאמת של גישת LASLs הוכח להציג רק הטיות מינימליות, מקדמת רגישות גבוהה יותר (לכמויות קטנות של חומר מוצא), והוא מותאם בקלות לפלטפורמות שונות רצף 43. עם זאת, יש לו את הגישה שלבים רבים, דורשת ציוד מיוחד כדי להקטין את איבוד DNA, ומוגבל לתבניות dsDNA. במעבדה שלנו, גישה זו הותאמה בהצלחה להגברת כמות לזיהוי וגילוי של DNA שחולץ מlavage- רונכואלוואולרית, VLPs coral- וים-נגזרים המים (לא פורסם והורביץ et al. 46).

יש לפתח צינורות ניתוח נתונים CLAssically היה אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של ניתוח metagenomics הנגיפי בשל האופי המגוון מאוד וידוע ברובם של קהילות ויראלי. אמנם יש 10 8 גנוטיפים מוערכים נגיפיים בביוספרה, למאגרי מידע נגיפיים הנוכחיים תאריך להכיל ~ 4,000 הגנום נגיפי, שזה בערך 1 / 100,000 של גיוון נגיפי כולל משוער זה. לכן, חיפושים מבוססי דמיון (כגון תפציץ 47) למשימה הטקסונומי ופונקציונלית בmetagenomes הנגיפי יש אתגרים הגלומים. רצפים רבים נכשלים יש קווי דמיון משמעותיים לגנומים באתר, ולכן, מסווגים כידועים. למרות חיפושים מבוססי הומולוגיה הם היישומים החשובים ביותר לצורך קביעת טקסונומיה ולתפקד רצף נתונים, גישות חלופיות המבוססות על ניתוח של מסדי נתונים עצמאיים פותחו -48 50. Fancello et al. 51 מספקים סקירה של כלים חישוביים ואלגוריתמים המשמשים בVira מלאהmetagenomics l.

החיידקים metagenomics

בדרך כלל, את הסכום הכולל של ה- DNA שחולץ מקהילות hypotonic טופל תמוגה חיידקים (HL-DNA) נע בין 20 ng עד 5 מיקרוגרם. התשואה תלויה מאוד במצב בריאותו של המטופל ואת כמות מדגם ליחה שנאסף, מה שמסביר את השינויים ראו בתשואה הכוללת של HL-DNA שחולץ במחקר זה (טבלה 2). השלבים הקריטיים כדי להפיק נתונים רצף איכות טובה להסתמך על האיכות של ספריות רצף שנוצרו. איור 2 מציג מגוון גודל אופייני לספריות רצף שנוצרו מה- DNA של חיידקים שמקורם בכיח CF באמצעות הליך פיצול ה- DNA מבוסס האנזימטית. גודל הספרייה האופטימלי תלוי בבחירה של פלטפורמת רצף ויישום, ולכן, יכול להיות מותאם הליך הפיצול, במידת צורך, דרך גישות חלופיות כגון sonication ועִרפּוּל. בנוסף לתוצאות הנציג הציגו, ההצלחה של השיטה המוצגת בכיח CF שנאסף מחולים מרובים על פני נקודות זמן מרובות היא גם מאוירת באל Lim et. (2012) 9 וLim et al. (2014) 10.

מחקרים קודמים 9,10 מציעים שכל חולה מטפח קבוצה ייחודית של קהילת חיידקים שעוברת לאורך זמן, ובכך משקף את ההתמדה של השחקנים המרכזיים בקהילה תוך תנודות צפויות עקב הפרעות כגון טיפולים אנטיביוטיים. אם תנודות אלה מתרחשות מדי יום גם ללא הפרעות חיצוניות או בשל שיטת דגימה ועיבוד מדגם, עדיין בשאלה. בהתבסס על metagenomic HL-DNA וניתוח amplicon 16S rDNA, דגימת אורך 7 הימים מראה כי התנודות יומיות של פרופילי חיידקים ללא ההפרעות אנטיביוטיות (יום 1, 2, ו -3) היה מינימאלי (איורים 3 א ו 3 ב '). על introduction של אנטיביוטיקה דרך הפה מייד לאחר דגימת יום 3, שינויים בפרופיל הקהילה התבררו ביום 4. בעוד ציפרופלוקסצין האנטיביוטיקה מיועד למגוון רחב של חיידקים פתוגנים ידועים כגון P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, ודלקת ריאות Streptococcus, הטיפול הגדילו את השפע היחסי של P. aeruginosa תוך הפחתת spp Streptococcus. ופ melaninogenica. לפי יום 6, הקהילה התאוששה לאט למבנה קהילת המוצא הראשוני. התוצאות מצביעות על כך שתנודות של פרופילים של חיידקים בתוך מטופל אחד יש סיכוי גבוה יותר בשל הפרעות קהילה בדרכי הנשימה.

בהתחשב בעקביות בין פרופילי חיידקים של ספריות 16S rDNA וmetagenomes מDNA נגזר HL, שללנו ההטיות שמקורן בפריימרים 16S rRNA שימשו במחקר זה. הסבר אפשרי אחד להבדלים לראות פני הטקסונומית 16S rDNAפרופילי אל שנוצרו מDNA הכולל וDNA נגזר HL (איור 3) עשויים להיות הנוכחות של כמויות גבוהות של spp Pseudomonas. DNA תאי לאחר הטיפול האנטיביוטי. זו נתמכת על ידי הממצאים שההבדלים אלה היו בולטים ביותר ביום 7, שלושה ימים לאחר הטיפול באנטיביוטיקה, אשר מטרות spp Pseudomonas. בנוסף לאחרים. ציפרופלוקסצין משמש בדרך כלל כטיפול הקו הראשון בחולים עם CF ופ הכרוני זיהום aeruginosa למרות שהספקטרום של פעילותה כולל את רוב פתוגנים הקשורים CF. חוקרים שערנו כי הטיפול האנטיביוטי מבטל קהילות רגישות כולל spp Streptococcus. ולכן יצירת נישה מולא על ידי פ 'עמיד aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa עשוי להרוויח התנגדות באמצעות הגדלת קהילות biofilm וDNA תאי הוכח להיות התמיכה המבנית העיקרית של אדריכלות biofilm 52. אפילו כtהוא מבנה הקהילה התאושש, DNA תאי אולי נשאר בכיח CF. לכן, נתונים אלה מצביעים על כך שתמוגה hypotonic ושלבי הכביסה שהוצגו בעבודה זו עשויה להיות תועלת בכך שלא להסיר את ה- DNA המופק רק בני האדם, אבל DNA תאי גם הנגזרות של חיידקים שעלולות לסלף את הפרופילים של חיידקים בפועל.

Metatranscriptomics

איכות גבוהה metatranscriptome צריכה להכיל רצפי מעטים יחסית RNA ריבוזומלי (rRNA) ומייצגת דגימה משוחדת של תמלילי הקהילה (mRNA). בשל זמן מחצית החיים קצרים וכמות מוגבלת של mRNA, זה קריטי, כי הפרוטוקול, כפי שהוצג כאן, ממזער טיפול מדגם כדי למקסם את המספר של תמלילים התאוששו.

בשנים האחרונות, במספר גישות לדלדול rRNA פותחו והותאמו בערכות זמינות מסחרי. אלה כוללים MICROB להעשיר, Ribo-אפס, ומדגם ספציפי h תוסףybridizations 53 המבוססים על הכלאת oligonucleotide, וmRNA בלבד הערכה המבוססת על RNA מיקוד הפעילות האנזימטית exonuclease מכיל monophosphate 5 '. בנוסף, מספר גישות למוספים לmRNA כגון ערכת II-החיידקים MessageAmp שמעדיף polyadenylates ומגביר RNA ליניארי זמינות גם. חלק מהשיטות הללו (למשל, mRNA בלבד, Xpress MICROB E וMessageAmp) משמש במקביל ליעילות אופטימלית. עם זאת, היעילות של כל הגישות הללו מוגבלות, במיוחד כשעובדים עם rRNA המושפל באופן חלקי, כפי שנצפה לעתים קרובות בסך RNA שחולץ מן דגימות CF. ההגברה RNA polyadenylation תלוי לא ניתן להשתמש בם כדי ליצור metatranscriptomes מורכב משני mRNA אוקריוטים ופרוקריוטים. בנוסף, פולי הזנב () הוסיף לרצפים רשאי מפחית את כמות נתוני רצף שימושיים. אזורים עם מתיחות homopolymer נוטים לקבל ציוני איכות נמוכות יותר, גausing מספר משמעותי של קורא ליסונן על ידי רצף ותוכנה שלאחר רצף-, ואורך הקריאה השימושי הממוצע לאחר זמירה מפולי זנבות () יקטנו באופן משמעותי 54.

התמודדות עם קהילות מורכבות של חיידקים CF ו- RNA המושפל באופן חלקי (איורים 4 א ו4C), המחקר הקודם שלנו הראה כי שיטת הכלאה-ידי לכידת ערכת זהב Ribo-Zero הייתה יותר יעילה בהסרת שני rRNA האדם וחיידקים בהשוואה לטיפולים משלבים שימוש ב ערכות אחרות 9 (לוח 3). נתונים כתוצאה מאפשר ניתוח מקביל של שני מארח אנושי ותמלילים של חיידקים. בהתאם לתפוקה והאיכות של RNA, כמו גם בחירה אולטימטיבית של פלטפורמת רצף, רב של תהליכים אלה כוללים את צעד סינתזת cDNA יכול להיות יעיל עם דור ספריית רצף. לדוגמא, RNA טופל Ribo-אפס יכול לשמש להכנת libra רצף metatranscriptomeריס באמצעות ערכת ScriptSeq RNA-Seq ספריית הכנה.

ניתוח metagenomic של הקהילות הקשורים לבעלי חיים מספק ייצוג מקיף של הישות התפקודית הכוללת הכוללת את המארח והקהילות הקשורים אליו. העבודה שהוצגה כאן היא להתאמה למגוון של דוגמאות הקשורים לבעלי חיים מורכבים, במיוחד אלה המכילים ריר סמיך, כמויות גבוהות של פסולת תא, DNA תאי, חלבון ומתחמי גליקופרוטאין, כמו גם תאי מארח בנוסף לחיידקים ויראליים והרצויים חלקיקים. למרות שחלקיקים נגיפיים וחיידקים עלולים ללכת לאיבוד בכל שלב, חלקיקי בידוד וטיהור חיוניים כדי למזער את כמות ה- DNA מארח. בעוד נתוני metagenomics מספק פוטנציאל המטבולי של הקהילות שנבדקו, metatranscriptomics להשלים זאת על ידי חושף את ביטוי ההפרש של פונקציות מקודדות 9. הערכה מקיפה של נתונים גנומיקה ותמלילים הניבה תוספות חדשותights לדינמיקה של אינטראקציה קהילתית ומקל על פיתוח טיפולים לשיפור 9,10,55.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (1 R01 GM095384-01) הוענק ליער Rohwer. אנו מודים Epicentre, חברת Illumina למתן גישה מוקדמת לערכות Ribo-אפס לאפידמיולוגיה. אנו מודים למארק Hatay לעיצוב והייצור של בעל צינור ultracentrifugation. אנו מודים אנדריאס האס ובנימין נואלס לקריאה ודיונים של כתב היד קריטיים, ולורן פול לסיוע לתהליך הצילום.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer Life Technologies 10296-028 TRIzol LS Reagent was used in this study
Silica beads; 0.1 to 0.15 mm Cole-Parmer YO-36270-62 Zirconia-silicate beads were used in this study
Dithiothreitol, molecular grade (dry powder) Promega V3155 Can be purchased from any other company
Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane Millipore SLHV033RS
DNase I enzyme  Calbiochem 260913
Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-13 Diameter: 25 mm
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman 344059 9/16 x 3 ½ in. (14 x 90 mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation
SW41 Ti Rotor Beckman 333790
SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
Phi29 DNA polymerase Monserate Biotech 4001 10 U/µl
Phi29 Random Hexamer Thermo Scientific S0181 Previously bought from Fidelity Systems
Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-34 Whatman Anodisc filter membranes were used in this study; diameter 25 mm
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S-11494
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNase-free DNase I  NEB M0303S Can be purchased from any other company
Glycogen, RNA grade FisherScientific FERR0551 Can be purchased from any other company
Oak Ridge high-speed centrifuge tubes FisherScientific 05-562-16B For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor
Total rRNA removal kit Epicentre MRZE724 ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation
Cesium chloride  FisherScientific BP1595-500
Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Suau, A., et al. Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut. Applied and Environmental Microbiology. 65 (11), 4799-4807 (1999).
  2. Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).
  3. Proctor, L. M. The human microbiome project in 2011 and beyond. Cell Hos., & Microbe. 10 (4), 287-291 (2011).
  4. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (8), 957-963 (2011).
  5. Pragman, A. A., Kim, H. B., Reilly, C. S., Wendt, C., Isaacson, R. E. The lung microbiome in moderate and severe chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 7 (10), e47305 (2012).
  6. Kerem, B., et al. Identification of the Cystic Fibrosis gene: Genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  7. Kleven, D., McCudden, C., Willis, M. Cystic Fibrosis: Newborn screening in America. Medical Laboratory Observer. 40 (7), 16-27 (2008).
  8. Fodor, A. A., et al. The adult cystic fibrosis airway microbiota is stable over time and infection type, and highly resilient to antibiotic treatment of exacerbations. PLoS ONE. 7 (9), e45001 (2012).
  9. Lim, Y. W., et al. Metagenomics and metatranscriptomics: Windows on CF-associated viral and microbial communities. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 12 (2), 154-164 (2012).
  10. Lim, Y. W., et al. Clinical insights from metagenomic analysis of sputum samples from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 52 (2), 425-437 (2014).
  11. Claesson, M. J., et al. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucleic Acids Research. 38 (22), e200 (2010).
  12. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23 (4), 722-723 (1995).
  13. Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of Cystic Fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (23), 9188-9192 (1990).
  14. Lethem, M., James, S., Marriott, C., Burke, J. The origin of DNA associated with mucus glycoproteins in Cystic Fibrosis sputum. European Respiratory Journal. 3 (1), 19-23 (1990).
  15. Childs, W. C., Gibbons, R. J. Use of percoll density gradients for studying the attachment of bacteria to oral epithelial cells. Journal of Dental Research. 67 (5), 826-830 (1988).
  16. Lee, J. -L., Levin, R. E. Use of ethidium bromide monoazide for quantification of viable and dead mixed bacterial flora from fish fillets by polymerase chain reaction. Journal of Microbiological Methods. 67 (3), 456-462 (2006).
  17. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23 (4), 722-723 (1995).
  18. Mokili, J. L., Rohwer, F., Dutilh, B. E. Metagenomics and future perspectives in virus discovery. Current Opinion in Virology. 2 (1), 63-77 (2012).
  19. Bibby, K. Improved bacteriophage genome data is necessary for integrating viral and bacterial ecology. Microbial Ecology. 67 (2), 242-244 (2014).
  20. Willner, D., et al. Metagenomic analysis of respiratory tract DNA viral communities in Cystic Fibrosis and non-Cystic Fibrosis individuals. PloS One. 4 (10), e7370 (2009).
  21. Willner, D., Furlan, M. Deciphering the role of phage in the cystic fibrosis airway. Virulence. 1 (4), 309-313 (2010).
  22. Willner, D., et al. Case studies of the spatial heterogeneity of DNA viruses in the cystic fibrosis lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (2), 127-131 (2012).
  23. Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012-e00011 (2011).
  24. He, S., et al. Metatranscriptomic array analysis of “Candidatus Accumulibacter phosphatis”-enriched enhanced biological phosphorus removal sludge. Environmental Microbiology. 12 (5), 1205-1217 (2010).
  25. Mokili, J. L., et al. Identification of a novel Human Papillomavirus by metagenomic analysis of samples from patients with febrile respiratory illness. PLOS ONE. 8 (3), e58404 (2013).
  26. Henig, N. R., Tonelli, M. R., Pier, M. V., Burns, J. L., Aitken, M. L. Sputum induction as a research tool for sampling the airways of subjects with Cystic Fibrosis. Thorax. 56 (4), 306-311 (2001).
  27. Rogers, G. B., et al. Use of 16S rRNA gene profiling by terminal restriction fragment length polymorphism analysis to compare bacterial communities in sputum and mouthwash samples from patients with Cystic Fibrosis. J. Clin. Microbiol. 44 (7), 2601-2604 (2006).
  28. Haas, A., et al. Unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology. Journal of Visualized Experiments. In press, Forthcoming.
  29. Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics. 27 (6), 863-864 (2011).
  30. Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PLOS ONE. 6 (3), e17288 (2011).
  31. Segata, N., et al. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods. 9 (8), 811-814 (2012).
  32. Meyer, F., et al. The metagenomics RAST server - a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes. BMC Bioinformatics. 9 (1), 386 (2008).
  33. Hara, N., et al. Prevention of virus-induced type 1 diabetes with antibiotic therapy. Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950). 189 (8), 3805-3814 (2012).
  34. Markle, J. G. M., et al. Sex differences in the gut microbiome drive hormone-dependent regulation of autoimmunity. Science (New York, N.Y.). 339 (6123), 1084-1088 (2013).
  35. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  36. Ewing, B., Hillier, L., Wendl, M. C., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Research. 8 (3), 175-185 (1998).
  37. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics (Oxford, England). 27 (16), 2194-2200 (2011).
  38. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  39. Pruesse, E., Peplies, J., Glöckner, F. O. SINA: accurate high-throughput multiple sequence alignment of ribosomal RNA genes. Bioinformatics (Oxford, England). 28 (14), 1823-1829 (2012).
  40. Robertson, C. E., et al. Explicet: graphical user interface software for metadata-driven management, analysis and visualization of microbiome data. Bioinformatics (Oxford, England). 29 (23), 3100-3101 (2013).
  41. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nat. Protocols. 4 (4), 470-483 (2009).
  42. Henn, M. R., et al. Analysis of high-throughput sequencing and annotation strategies for phage genomes. PLoS ONE. 5 (2), e9083 (2010).
  43. Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Towards quantitative metagenomics of wild viruses and other ultra-low concentration DNA samples: a rigorous assessment and optimization of the linker amplification method. Environmental Microbiology. 14 (9), 2526-2537 (2012).
  44. Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nat Meth. 7 (12), 943-944 (2010).
  45. Kim, K. -H., Bae, J. -W. Amplification methods bias metagenomic libraries of uncultured single-stranded and double-stranded DNA viruses. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7663-7668 (2011).
  46. Hurwitz, B. L., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Evaluation of methods to concentrate and purify ocean virus communities through comparative, replicated metagenomics. Environmental Microbiology. 15 (5), 1428-1440 (2013).
  47. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).
  48. Angly, F., et al. PHACCS, an online tool for estimating the structure and diversity of uncultured viral communities using metagenomic information. BMC Bioinformatics. 6 (1), 41 (2005).
  49. Angly, F. E., et al. The GAAS Metagenomic Tool and Its Estimations of Viral and Microbial Average Genome Size in Four Major Biomes. PLoS Comput Biol. 5 (12), (2009).
  50. Dutilh, B. E., et al. Reference-independent comparative metagenomics using cross-assembly: crAss. Bioinformatics (Oxford, England). 28 (24), 3225-3231 (2012).
  51. Fancello, L., Raoult, D., Desnues, C. Computational tools for viral metagenomics and their application in clinical research. Virology. 434 (2), 162-174 (2012).
  52. Allesen-Holm, M., et al. A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms. Molecular Microbiology. 59 (4), 1114-1128 (2006).
  53. Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4 (7), 896-907 (2010).
  54. Frias-Lopez, J., et al. Microbial community gene expression in ocean surface waters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (10), 3805-3810 (2008).
  55. Lim, Y. W., et al. Mechanistic model of Rothia mucilaginosa adaptation toward persistence in the CF lung, based on a genome reconstructed from metagenomic data. PLOS ONE. 8 (5), e64285 (2013).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 94 virome Microbiome metagenomics metatranscriptomics סיסטיק פיברוזיס רירית-פני השטח
טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M.,… More

Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. (94), e52117, doi:10.3791/52117 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter