Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Oprensning af Uren sekvensering Metagenomes og Metatranscriptomes fra komplekse Animal-associerede Prøver

Published: December 22, 2014 doi: 10.3791/52117
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 1
1Department of Biology, San Diego State University, 2DOE Joint Genome Institute, 3Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado, 4Department of Pediatrics, School of Medicine, University of Colorado

Summary

Brug af cystisk fibrose luftveje som et eksempel, manuskriptet præsenterer en omfattende workflow omfatter en kombination af metagenomisk og metatranscriptomic tilgange til at karakterisere mikrobielle og virale samfund i animalske-associerede prøver.

Abstract

Tilgængeligheden af ​​high-throughput sekventering har revolutioneret mange områder af biologi. For bedre at forstå vært-associerede virale og mikrobielle samfund, blev en omfattende workflow for DNA og RNA-ekstraktion udvikles. Arbejdsgangen samtidig genererer virale og mikrobielle metagenomes samt metatranscriptomes, fra en enkelt prøve for næste generation sekventering. Koblingen af ​​disse metoder giver et overblik over både de taksonomiske egenskaber og community kodet funktioner. De præsenterede fremgangsmåder anvender Cystisk fibrose (CF) spyt, en problematisk prøvetype, fordi det er usædvanligt tyktflydende og indeholder stor mængde af muciner, fri neutrofil DNA og andre ukendte forureninger. De her beskrevne protokoller målrette disse problemer og med held genoprette viral og mikrobiel DNA med minimal DNA-kontaminering menneske. Som supplement til de metagenomet studier blev en metatranscriptomics protokol optimeret til at genvinde både mikrobielog vært mRNA, som indeholder forholdsvis få ribosomalt RNA (rRNA) sekvenser. En oversigt over data egenskaber præsenteres for tjene som reference for vurderingen af ​​succes af metoderne. Yderligere CF spytprøver blev også indsamlet til (i) evaluere sammenhængen i de microbiome profiler på tværs af syv dage i træk inden for en enkelt patient, og (ii) sammenligne sammenhæng i metagenomisk tilgang til en 16S ribosomale RNA-gen-baserede sekventering. Resultaterne viste, at daglig udsving af mikrobielle profiler uden antibiotika forstyrrelse var minimal og taksonomi profiler af de fælles CF-associerede bakterier var meget ens mellem 16S rDNA biblioteker og metagenomes genereret fra den hypotonisk lyse (HL) -afledt DNA. Forskellene mellem 16S rDNA taksonomiske profiler genereret fra total DNA og HL-afledt DNA tyder på, at hypotonisk lysis og vasketrinnene fordel i ikke kun at fjerne humant-afledt DNA, men også mikrobiel afledt extracellular DNA, der kan forvanske de faktiske mikrobielle profiler.

Introduction

Virale og mikrobielle samfund er forbundet med den menneskelige krop er blevet undersøgt i udstrakt grad i det seneste årti gennem anvendelse af sekventering teknologier 1,2. Resultaterne har ført til anerkendelse af vigtigheden mikrober i menneskers sundhed og sygdom. Den større initiativ kom fra det menneskelige microbiome projekt, der beskriver bakterier (og nogle archaea) bosat på menneskers hud, og inden for orale hulrum, luftveje, urogenitale tarmkanalen og mavetarmkanal 3. Yderligere microbiome undersøgelser af raske luftvejene gennem bronchoalveolær lavage (BAL) 4,5 og nasopharyngeale podninger 4 har vist, at lungen kan tjene som en miljømæssig Prøveanordningen resulterer i forbigående mikrobiel kolonisering i luftvejene. Virkningen af ​​mikrobiel kolonisering i værdiforringede luftvejsoverflader kan imidlertid føre til alvorlige og kroniske lungeinfektioner, som dem, der ses i cystisk fibrose (CF) patienter.

t "> CF er en dødelig genetisk sygdom forårsaget af mutationen i cystisk fibrose transmembranregulator (CFTR) gen 6. Disse mutationer giver anledning til defekte CFTR-proteiner, som til gengæld påvirker transepithelial iontransport over den apikale overflade af epitelet. Sygdommen rammer flere organsystemer, men de fleste af dødelighed og sygelighed kan tilskrives CF lungesygdom 7. CF lunge giver et enestående økosystem for mikrobiel kolonisering. Defekten i ion transport forårsager slim at opbygge i CF luftvejene, skaber mikromiljøer bestående af aerob , mikroaerofile og anaerobe rum forankret ved en statisk næringsrigt slimhindeoverflade. Dette miljø letter kolonisering og proliferation af mikrober, herunder virale, bakterier og svampe. Akutte og kroniske pulmonale mikrobielle infektioner fører til konstante men ineffektive immunreaktioner, hvilket resulterer i omfattende luftveje remodeling, tab af pulmonal kapacitet, og i sidste ende Pulmonary fiasko.

Bakterielle samfund i CF lunge er blevet godt beskrevet ved hjælp af både kultur-afhængige og kultur-uafhængige metoder, der omfatter brug af 16S ribosomale RNA (rRNA) gen sekventering 8 og shotgun metagenomics 9,10. 16S rRNA-tilgang er i stand til at karakterisere en række mikrobielle arter og fange brede skift i fællesskab mangfoldighed. Det er dog begrænset i sin beslutning at definere de samfund (sammenfattet i Claesson et al. 2010 11) og forudsigelser metaboliske potentialer er begrænset til de generelle funktioner kendt for taxa identificeret. Derfor 16S rRNA-gen sekventering metoder er utilstrækkelige til den nødvendige taksonomiske og funktionelle analytiske nøjagtighed de forskellige mikrobielle samfund til stede i CF lungerne. Den metagenomisk tilgang beskrives her supplerer 16S rRNA tilgang, overvinder sine begrænsninger, og gør det muligt for en relativt effektiv mådeat analysere både de mikrobielle samfund taksonomi og genetiske indhold i CF lungerne.

Mikrobiel DNA isoleret fra animalske-associerede prøver ofte indeholder en stor mængde af værts-DNA. CF sputum eller lunge vævsprøver indeholder sædvanligvis en stor mængde af humant DNA frigivet af neutrofiler i immunresponset, ofte mere end 99% af det totale DNA fra 12 til 14. Selv om nogle intakte humane celler kan være til stede, de fleste af dette DNA er frie i opløsning eller adsorberet til overfladen af ​​mikrober. Desuden er tilstedeværelsen af ​​usædvanligt viskose slimpropper, cellerester og andre ukendte forureninger yderligere komplicere isolering af mikrobielle celler. Adskillige metoder blev testet for nedbrydende disse prøver af humant DNA, herunder Percoll-gradienter til separat menneske fra mikrobielle celler 15, behandling med DNase I, ethidiumbromid monoazide til selektivt nedbryde human DNA 16 og MolYsis kit, alle med begrænset succes. Til dato den mest effektive mikrobiel DNA oprensningsprocedure for CF sputum har været en modifikation af fremgangsmåden beskrevet af Breitenstein et al. (1995) 17. Denne fremgangsmåde, heri kaldet hypotonisk lysis (HL) metode anvender en kombination af β-mercaptoethanol at reducere mucin disulfidbindinger, hypotonisk lysis af eukaryote celler, og DNase I-behandling af opløseligt DNA 9. På trods af manglen på alternativer HL metode rejst nogle bekymringer på grund af (i) eventuelle bias som følge af uønsket lyse af mikrober og (ii) om de observerede udsving i fællesskab sammensætning 9,10 er en artefakt af variationer i forbindelse med prøven behandling. Ud over generering af shotgun metagenomes, behandle vi disse spørgsmål ved at sammenligne de 16S rRNA-genet profiler af det totale DNA og mikrobiel DNA ekstraheret fra HL anvendelse af det samme sæt af spytprøver indsamlet fra en enkelt patient over syv på hinanden følgende dage.

ent "> I forhold til mikrobielle samfund, karakterisering af virale samfund i forbindelse med dyr er begrænset 18,19 De virale samfund i CF luftveje er kun blevet karakteriseret minimalt 20 -.. 22 Den første metagenomisk undersøgelse karakteriserer DNA virale samfund i CF luftveje viste, at de fleste vira, der er forbundet med CF lunger er fager 20. Den metaboliske potentiale fag i CF og ikke-CF individer var signifikant forskellige. Specifikt fag samfund i CF individer gennemført gener afspejler bakterielle vært tilpasninger til fysiologi CF luftveje, og bakterielle virulens 20. Efterfølgende metagenomisk undersøgelser af virus i CF lungevæv demonstreret tydelig rumlig heterogenitet virale fællesskaber mellem anatomiske regioner 22. Desuden CF lungevæv nærede den laveste virale diversitet observeret hidtil i nogen økosystemet 22. De fleste vira identificerede var fagermed potentiale til at inficere CF patogener. Imidlertid blev eukaryote vira, såsom herpesvira, adenovira, og human papilloma virus (HPV) også påvist. I et tilfælde, hvor cyster i lungevævet blev observeret under dissektion, blev mere end 99% af et humant papillomavirus genom udvindes, selv om patienten aldrig blev diagnosticeret med en pulmonal papillomavirus eller carcinom. Dette indikerer, at den virale mangfoldighed foreliggende ikke kun afspejler graden af ​​vævsskade, men kan også afsløre og forklare en underliggende ukarakteriseret sygdom. De her beskrevne protokoller giver en enkel, men effektiv måde at isolere virus-lignende partikler (VLP) fra prøver, der består af store mængder af tykke slim, vært og mikrobielle celler, frit DNA, samt cellerester.

Som supplement metagenomics er metatranscriptomics bruges til at overvåge dynamikken i genekspression tværs af mikrobielle samfund og værten 9,23. I dette tilfælde både mikrobiel og Host mRNA skal fortrinsvis vælges. Da bakterielle mRNA'er ikke polyadenyleret, kan en oligo-dT-baserede mRNA pull-down metoden ikke udnyttes. Polyadenylering-afhængig RNA-amplifikation, kan ikke bruges i værten associeret prøver, hvis kendt, at prøverne indeholder store mængder af eukaryot mRNA. Mange dyr-associerede prøver, herunder CF spyt, indeholder en høj densitet af celler i tillæg til høje mængder af cellerester og nukleaser, der omfatter RNaser. Derfor er en anden udfordrende opgave er at forhindre omfattende RNA nedbrydning under metatranscriptome forarbejdning. I de fleste tilfælde totalt RNA ekstraheret fra CF spyt er delvist nedbrudt, hvilket begrænser efterfølgende anvendelser og anvendelighed afledt RNA. I de seneste år har adskillige tilgange til rRNA depletion blevet udviklet og tilpasset i kommercielt tilgængelige kits. Effekten af disse metoder er dog begrænset, især når der arbejdes med delvist nedbrudt rRNA 9,24. De her benyttede metoder tilladered for hentning af delvist nedbrudt total RNA egnet til effektiv nedstrøms total rRNA fjernelse. Direkte sammenligning af effektiviteten i rRNA fjernelse fra delvist nedbrudt total RNA sammenligner to forskellige kits blev illustreret ved Lim et al. (2012) 9.

Samlet målet med dette manuskript er at tilvejebringe et komplet sæt af protokoller (figur 1) til at generere virale og mikrobielle shotgun metagenomes og en metatranscriptome fra et enkelt dyr-associeret prøve, ved hjælp af induceret sputum prøve som et eksempel. Molekylær laboratorium workflow bør omfatte separate før og efter forstærkning områder for at minimere krydskontaminering. Metoderne er let at tilpasse til andre prøvetyper såsom væv 22, nasopharyngeal og svælg 25, bronchoalveolær lavage (BAL) og koral (upublicerede data). Hver prøve skal straks behandles ved afhentning især når mikrobielle metagenomics og mødteatranscriptomics undersøgelser ønskes. Hvis prøverne blev frosset, men det begrænser isolering af intakte mikrobielle celler til mikrobielle metagenomes som frysning potentielt forstyrre celle integritet. Men frysning ikke til hinder metatranscriptomics og viral isolation, men kvaliteten af ​​RNA og mængden af ​​virale partikler genvundne kan påvirkes gennem fryse-tø proces. Det er vigtigt at bemærke, at induceret sputum har tjent som den primære kilde til prøver i mange undersøgelser, der er forbundet med voksne CF-patienter og andre kroniske lungesygdomme 26,27 som BAL kan være for invasiv. I vores undersøgelser blev spytprøver opsamlet med en omhyggelig og ensartet prøveudtagningsmetode, dvs efter mundskyl og skylning af mundhulen ved anvendelse af steril saltvandsopløsning til at holde orale mikrober forurening inden spytprøverne til et minimum.

Protocol

BEMÆRK: Provokeret spytprøver blev indsamlet i overensstemmelse med University of California Institutional Review Board (HRPP 081.500) og San Diego State University Institutional Review Board (SDSU IRB # 2121), ved forskningskoordinator fra University of California, San Diego (UCSD ) voksne CF klinik.

1. Prøvetagning og forbehandling (Pre-treat Prøver inden for 30 minutter efter opsamling)

  1. Før prøvetagning, label fire 15 ml rør som: (i) viral metagenomet, (ii) mikrobiel metagenomet, (iii) metatranscriptome, og (iv) ekstra spyt. Gentag for hver prøve. Tilsæt 2 ml 0,1 mm silicaperler i røret mærket "Metatranscriptome" efterfulgt af 6 ml guanidinisothiocyanat-baserede RNA lysepuffer (GITC-lysis buffer).
  2. Under prøvetagning, brug steril saltvandsopløsning (60 ml) som et mundskyllemiddel for at minimere forurening med orale mikrober. Saml spytprøver over en 30 min periode efterinhalation af 4 ml 7% hypertonisk saltvand via en forstøver. Proces prøver straks, som beskrevet nedenfor.
  3. Prøven fortyndes til et samlet volumen på 8 ml.
    1. Skøn prøvevolumen ved vejning tom sputum cup før og efter prøvetagning.
    2. Hvis rumfanget af prøven er mindre end 8 ml, tilsættes passende mængde på 0,02 um-filtreret 1x PBS til at generere en samlet prøvemængde på mindst 8 ml.
    3. Umiddelbart homogenisere prøven med en 3 ml sprøjte, indtil ingen synlige klumper forbliver inden for spyt
    4. Brug den samme sprøjte, udarbejder 2 ml spyt og gå straks til trin 1.4.
  4. Bevarelse Total RNA fra sputumprøve
    1. Injicer 2 ml sputum prøve fra trin 1.3.4 i "metatranscriptome" rør indeholdende silicaperler og GITC-lysisbuffer.
    2. Luk låget og forsegler røret sikkert med Parafilm at undgå lækage.
    3. Homogeniser spyt straks ved middel hastighed i 10 kmn. Afhængigt af hvirvelomrøreren rådighed, anbringes glasset vandret og fastgør med tape, hvis nødvendigt.
    4. Hold røret ved 4 ° C eller i et is boksen og transport til laboratoriet, hvis nødvendigt.
  5. Brug den samme sprøjte, portion 2 ml spyt hver i rørene mærket "viral metagenomet" og "mikrobiel metagenomet" og overføre de resterende sputum fra spyt kop ind i røret mærket "ekstra spyt".
  6. Opbevar alle rør ved 4 ° C eller is boksen og transport til laboratoriet, hvis nødvendigt.

2. Generering Viral metagenomet

  1. Fremstilling af buffere og løsninger
    1. Forbered 50 mM dithiothreitol (DTT) på forhånd og opbevares ved 4 ° C. Dette er stabilt i 2 uger.
    2. Forbered Saline Magnesium (SM) puffer (250 ml): 1 M NaCl, 10 mM MgSO4, 50 mM Tris-HCI; justere pH til 7,4. Filtersteriliser (0,02 um porestørrelse) og opbevares ved stuetemperatur. Forbered DNase I enzymet til 100 U / pl (i vand af molekylærbiologisk kvalitet) fra lyofiliserede bovine pancreas DNase I ifølge aktiviteten defineret ved Dornase enhed / mg tørvægt.
    3. Forbered 10x DNase I buffer (50 ml): 100 mM MgCl2, 20 mM CaCl2; justere pH til 6,5. Filtersteriliser (0,02 um porestørrelse) og opbevares ved stuetemperatur.
    4. Forbered 4% paraformaldehyd.
    5. Forbered 200x TE Buffer: 2 M Tris-HCI (pH 8,5), 0,2 M EDTA. Filtersteriliser (0,02 um porestørrelse) og opbevares ved stuetemperatur.
    6. Forbered 10 ml 10% natriumdodecylsulfat (SDS) under anvendelse af vand af molekylærbiologisk kvalitet.
    7. Forbered 50 ml CTAB / NaCI (10% CTAB. 700 mM NaCl) ved anvendelse af vand af molekylærbiologisk kvalitet. Opløs CTAB natten over. Hvis bundfald fortsætter, opvarme opløsningen ved 65 ° C. Løsning er meget tyktflydende i stuetemperatur.
      BEMÆRK: filtrering af buffere anvender 0,02 um filter tillader fjernelse af viral-lignende partikler i opløsningen, men ikkefri nukleinsyre forurening.
  2. Prøve Forbehandling
    1. Forbered passende mængde frisk 6,5 mM dithiothreitol (DTT).
    2. Fortynd homogenatet ved tilsætning 0,02 um-filtreret SM puffer til at generere et samlet volumen på 6 ml.
    3. For at hjælpe i slim opløsning tilsættes lige volumen (6 ml) på 6,5 mM dithiothreitol (DTT) til prøven, vortex kraftigt at blandes og inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
    4. Vortex den behandlede prøve kraftigt og centrifugering ved 10 ° C, 3.056 x g i 15-20 min.
    5. Opsaml supernatanten til et nyt 15 ml rør.
    6. Gentag trin 2.2.3 og 2.2.5 for den næste prøve.
    7. Overførsel og filtrere supernatanten med et 0,45 um filter monteret på en sprøjte ind i en ny 15 ml rør.
      BEMÆRK: Hvis filteret træsko, hente prøverne fra sprøjten og udelade filtreringen.
    8. Læs 100 pi delprøve af 0,45 um-filtreret prøve udføre chloroform og DNase I-behandling (se SEktion 2.3.12-2.3.15) og tilsæt lige så stort volumen 4% paraformaldehyd at fastsætte prøven til epifluorescens-mikroskopi (figur 2A).
    9. For en "catch-all" viruspartikler berigelse tilgang (se Diskussion), gå til trin 2.3.12 at udelade viruspartikler udvælgelse baseret på cæsiumchloridgradient ultracentrifugering. Dette kan dog resultere i chloroform-resistent bakteriel forurening og større mængde host-DNA i den virale lysat.
  3. Viral-lignende partikler (VLP'er) berigelse og rensning
    1. Forbered individuel cæsiumchlorid (CsCI) opløsninger ved at opløse den passende mængde af CsCI med ufiltreret SM buffer til den ønskede densitet (1,7 g / ml, 1,5 g / ml, 1,35 g / ml og 1,2 g / ml). Filtreres hver opløsning gennem et 0,02 um filter før brug.
    2. Opsætning CsCI-gradient som vist i figur 2B.
    3. Load 1 ml 1,7 g / ml i hvert rør, lasten 1 ml af 1,5 g / ml i hvert rør, lasten 1 ml af 1,35 g/ ml i hvert rør, load 1,2 g / ml i hvert rør (ekstraudstyr), og endelig lægge 6-8 ml prøve til den respektive rør. Mark individuelle lag til at betegne placeringen af ​​hver fraktion.
    4. Balance hvert modstående par af rør på 1 mg.
    5. Indlæse forsigtigt hvert rør i spin spand. Spin alle spande, selv om de er tomme. Læg spin spand på rotoren.
    6. Der centrifugeres ved 82.844 xg ved 4 ° C i 2 timer.
    7. Efter centrifugering fjernes forsigtigt rørene fra indehaveren uden at forstyrre de densitetsgradienter.
    8. Anvendelse af en 3 ml sprøjte med en 18 G nål, gennembore røret lige under 1,5 g / ml densitet lag (figur 2, rød pil), og træk ~ 1,5 ml ind i sprøjten.
    9. Saml den øvre del ved langsomt at fjerne kanylen og tillader resterende fraktion i røret at dryppe ind i en ny 15 ml rør gennem punkturen. Mærk dette som "øvre affaldsfraktion".
    10. Opsaml 1,5 g / ml fraction (indeholdende VLP'er) fra sprøjten ved at skubbe indholdet i to nye mikrofugerør.
    11. Gentag trin 2.3.8-2.3.10 for alle prøver.
    12. Tilsæt 0,2 rumfang chloroform i den virale koncentrat, omrystes kraftigt, inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter, centrifugering ved maksimal hastighed i 5 minutter, og den vandige fase opsamles.
    13. Tilføj 10x DNase buffer og DNase I (slutkoncentration = 2,5 U / pl) i chloroform-behandlede virale koncentrat, og inkuberes ved 37 ° C i 1,5-2 timer.
    14. Inaktivere DNase aktivitet ved 65 ° C i 15 min.
    15. Fjern 15 ul af chloroform og DNase-behandlede virale fraktion til et nyt rør, og der tilsættes 15 pi 4% paraformaldehyd at fastsætte prøven til epifluorescens mikroskopi.
  4. DNA ekstraktion
    1. Pool virale koncentrater fra hver prøve i et rengjort og autoklaveret 50 ml Oak Ridge højhastighedstog centrifugerør.
    2. Tilføj følgende: 0,1 volumen 200x TE-buffer, 10 pi 0,5 M EDTA per ml srigelig, 1 volumen formamid og 10 pi glykogen. Bland godt og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter.
    3. Ved hjælp af nye mængder, tilsættes 2 volumener stuetemperatur 100% ethanol. Bland godt og inkuber ved 4 ° C i mindst 30 minutter.
    4. Pellet DNA ved at dreje røret ved 17.226 xg i 20 min ved 4 ° C ved anvendelse af en SS-34 rotor.
    5. Supernatanten omhyggeligt ved hjælp af en serologisk pipette. Vask pellet to gange med iskold 70% ethanol.
    6. Fjern så meget væske som muligt og tillader pelleten lufttørre ved stuetemperatur i 15 min.
    7. Resuspender DNA-pelleten i 567 pi 1x TE-buffer (pH 8,0).
      BEMÆRK: Lad mindst 15 min til fuldstændig resuspension ved stuetemperatur. Opbevar resuspenderede DNA natten over ved 4 ° C indtil yderligere forarbejdning.
    8. Overføre hele 567 pi resuspenderet DNA-opløsning ind i en ny 1,5 ml mikrofugerør. Tilsæt 30 pi forvarmet 10% SDS og 3 pi proteinase K (20 _6 g / ml), blandes og inkuberes i 1 time ved 56 ° C. Pre-varm CTAB / NaCI ved 65 ° C.
    9. Tilsæt 100 pi af 5 M NaCl og blandes. Tilsættes 80 pi forvarmet CTAB / NaCI-opløsning, vortex, og inkuberes i 10 minutter ved 65 ° C.
    10. Tilføj lige så stort volumen chloroform, vortex at blande, og centrifugering ved 16.100 xg i 5 min.
    11. Supernatanten overføres til et nyt 1,5 ml mikrofugerør. Tilføj et lige volumen af ​​phenol / chloroform, vortex at blande, og centrifugering ved 16.100 xg i 5 min.
    12. Supernatanten overføres til et nyt 1,5 ml mikrofugerør. Tilføj et lige volumen af ​​chloroform, vortex at blande, og centrifugering ved 16.100 xg i 5 min.
    13. Supernatanten overføres til et nyt 1,5 ml mikrofugerør. Tilføj lige så stort volumen isopropanol til supernatantfraktionen, blandes og inkuberes ved -20 ° C i mindst 30 minutter.
    14. Pelletere DNA, centrifugering ved 16.100 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Pipette off supernatanten omhyggeligt og vaskes pellet to gange med iskold 70% ethanol. Udfør en kort centrifugering og fjerne resterende ethanol fra røret. Lufttørre pellet i 15 min.
    15. Resuspender DNA-pelleten med 50 pi elueringspuffer (5 mM Tris, pH 8,5). Pellet rehydrere i mindst 5 min i stuetemperatur.
    16. Kvantificer DNA ved hjælp af en høj følsomhed fluorescens-baseret assay.
  5. Forstærkning ved hjælp Phi29 Polymerase (valgfri)
    1. Forbered 2x annealing buffer: 80 mM Tris-HCI (pH 8,0), 20 mM MgCI2.
    2. Fortynd Phi29 DNA-polymerase til 5 U / pl.
    3. Pre-mix prøvepuffer bestående af 50 pi tilfældig hexamer-primer (100 uM), 125 pi 2x annealing buffer, og 25 pi vand. Alikvot og opbevares ved -20 ° C.
    4. Pre-mix reaktionsbuffer bestående af 100 pi Phi29 10x buffer, 40 pi 10 mM dNTP'er og 560 pi vand. Alikvot og opbevares ved -20 ° C.
    5. Tilsæt 1 pi template-DNA i 4 pi prøvepuffer.
    6. Inkuber the blanding ved 95 ° C i 3 minutter og afkøles på is.
    7. Tilføj 14 pi reaktionsbuffer i blandingen fra 2.4.4, blandes ved pipettering op og ned.
    8. Tilsæt 1 pi Phi29 DNA-polymerase, blandes ved pipettering op og ned og inkuberes ved 30 ° C i 18 timer efterfulgt af 65 ° C i 10 min.
    9. Ryd op reaktionerne anvendelse af genomisk DNA kolonner eller phenol / chloroform og ethanol nedbør.
  6. Epifluorescensmikroskopi (Se Haas et al. 2014 28 til filtrering systemopsætning)
    BEMÆRK: Efter isolering og oprensning epifluorescensmikroskopi med nukleinsyre farvestoffer kan anvendes til at bekræfte tilstedeværelsen og renheden af viruspartikler i prøver (figur 2A og 2C). Frit DNA i prøven kan give anledning til høj baggrundsfluorescens. Derfor skal prøven DNase I-behandlet før fiksering og farvning for mikrofotografier.
    1. Forbered mount opløsning (0,1% ascorbinsyre, 50% glycerol). Tilsæt 100 pi 10% ascorbinsyre til 4,9 ml 1X phosphatpufret saltopløsning (PBS) og blandes grundigt. Der tilsættes 5 ml 100% glycerol til blandingen, bland grundigt og mærke røret som "mount".
    2. Filterholderen under anvendelse af en 0,02 um aluminiumoxid matrix engangssprøjte filter, alikvot i mikrocentrifugerør, og opbevares ved -20 ° C.
    3. Alikvot 100 pi prøve i en ny mikrofugerør og tilføje lige så stort volumen 4% paraformaldehyd at fastsætte VLP'er. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i mindst 10 min.
    4. Der fyldes op til 1 ml ved tilsætning af 800 pi 0,02 um-filtreret vand. Tilsæt 1 pi SYBR Gold pletten ind i røret og inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
    5. Indstil filtreringssystem ved at tænde vakuumpumpen mellem -9 og -10 psi (-62,1 og -68,9 kPa).
    6. Vask piedestal med vand og placere en 0,02 um aluminiumoxid matrix filter med ringformede polypropylen support ring i filteret piedestal.
    7. Placer en filter tårn oven af ​​filteret piedestal med filteret og sikker med en klemme.
    8. Pipette indholdet fra 1,5 ml mikrofugerøret i filteret tårn, og lad et par minutter for prøve at filtrere igennem.
    9. Label og pipette 10 pi mount reagens i en mikroskopisk dias.
    10. Lad vakuum på, mens du fjerner filteret tårn og klemme.
    11. Fjern forsigtigt filteret fra filter piedestal og duppes bunden af ​​filteret med en Kimwipe, derefter placere filteret direkte på toppen af ​​bjerget på den mikroskopiske slide.
    12. Pipette anden 10 pi mount reagenset på filteret og placere et dækglas over filteret.

3. Generering Mikrobiel metagenomet

  1. Fremstilling af buffere og opløsninger
    1. Forbered 50 ml 1x DNase buffer: 50 mM NaAc, 10 mM MgCI2, 2 mM CaCl2; justere pH til 6,5. Filtersteriliser (0,22 um) og opbevaresved stuetemperatur.
    2. Forbered DNase I enzym til 1000 U / pl (i vand af molekylærbiologisk kvalitet) fra lyofiliserede bovine pancreas DNase I ifølge aktiviteten defineret ved Dornase enhed / mg tørvægt.
    3. Forbered 100 ml SE buffer: 75 mM NaCl, 25 mM EDTA; justere pH til 7,5. Filtersteriliser (0,22 um) og opbevares ved stuetemperatur.
  2. Prøve Forbehandling inden DNA-ekstraktion
    1. Fortynd homogenatet ved tilsætning af 5 volumener 0,22 um-filtreret 1x PBS. For eksempel tilsættes 10 ml 1x PBS i 2 ml prøve.
    2. Tilføj β-mercaptoethanol til 2% (v / v) slutkoncentration. Rock blandingen (i den kemiske hætte) ved stuetemperatur i 2 timer.
    3. Spin prøven ved 10 ° C og 3.056 x g i 15 min, og kassér supernatanten.
    4. Pellet resuspenderes i 10 ml vand af molekylærbiologisk kvalitet (eller 0,22 um filtreret vand) og inkuberes ved stuetemperatur i 15 min.
    5. Gentag trin 3.2.3 og 3.2.4 én gang.
    6. Spin ved 10 ° C og 3.056 x g i 15 min, og kassér supernatanten.
    7. Resuspender pellet i 5 ml 1x DNase buffer, og der tilsættes 15 pi DNase I (1.000 U / pl) per ml prøve.
    8. Der inkuberes ved 37 ° C med gentagne blanding i 2 timer.
    9. Inaktivere DNase aktivitet ved 65 ° C i 15 min.
    10. Spin ved 10 ° C og 3.056 x g i 15 min, og kassér supernatanten. Pellet resuspenderes i 10 ml SE buffer.
    11. Gentag trin 3.2.10.
    12. Spin ved 10 ° C og 3.056 x g i 15 min, og kassér supernatanten.
    13. Pellet resuspenderes i 2 ml SE buffer, og overføre til to mikrocentrifugerør.
    14. Pelletere cellerne i mikrofugerør. Spin rørene ved 16.100 xg ved stuetemperatur i 15 min.
    15. Fjern supernatanten og udtrække DNA fra de pelleterede celler under anvendelse af et genomisk DNA-ekstraktionskit, Gram-positive variation protokol.

4. Generering Metatranscriptome

  1. Prøve Pre-Behandling
    1. Udfør mekanisk lysering af celler ved bead beating i GITC-lysepuffer umiddelbart efter prøvetagning og homogenisering. Se trin 1.4.
    2. Spin blandingen ved 4 ° C og 600 x g i 5 min for at pelletere silicaperler.
    3. Supernatanten overføres til et nyt rør.
    4. Tilsæt 200 pi chloroform for hver 750 pi GITC-lysepuffer anvendes, rystes kraftigt med hånden i 15 sekunder, inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter og centrifugering ved 4 ° C og 3.056 x g i 15 min. I løbet af denne 15 min tur, forberede trin 4.2.
    5. Efter 15 min centrifugering (en klar adskillelse af vandige fase former fase-interfase-økologiske), den vandige fase ekstraheres (uden at forstyrre interfasen) i nybyggeri RNase-fri røret (rørene).
      BEMÆRK: Den vandige fase indeholder RNA. Hold rørene på is indtil det næste trin.
  2. Udfør total RNA-ekstraktion og oprensning under anvendelse af kommercielt tilgængelige kolonne-baserede RNA rensning kits eller Conventional isopropanol-baseret RNA udfældning.
    1. Silicasøjle-baserede RNA Oprensning
      1. Mål det totale volumen af ​​den vandige fraktion opnået.
      2. Tilføj passende volumen af ​​RNA-bindende buffer til at prøve og bland godt.
      3. Juster blanding til passende bindende betingelse i henhold til producentens protokol. Bland godt og gøre en kort centrifugering.
      4. Læg blandingen i RNA-kolonnen. For en stor volumen prøve, bruger flere lastning og indlæse hver kolonne op til 4x. Ellers overveje at bruge flere kolonner for hver prøve.
      5. Vask kolonnen passende ifølge producentens protokol.
      6. Elueres RNA med mindst 30 pi RNase-frit vand. Dobbelt-eluering vil lidt øge udbyttet af RNA. Dette vil dog fortynde RNA koncentration.
      7. Mål RNA-koncentrationen og gå direkte til DNase I behandling. Brug Bioanalyzer at kontrollere kvaliteten af ​​RNA (anbefales).
      8. RNA Nedbør
        1. Tilføj et lige volumen af isopropanol (fx 500 pi isopropanol i 500 pi vandige fraktion) og 2 pi af 10 pg / pl RNase-fri glycogen til prøven.
        2. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 10 min.
        3. Centrifugering ved 12.000 xg og 4 ° C i 15 min.
        4. Fjern forsigtigt supernatanten, tilsættes 1 ml RNase-fri 75% ethanol. Spin blandingen ved 7.500 xg og 4 ° C i 5 minutter for at sikre, at pillen er intakt.
        5. Fjern forsigtigt ethanol.
        6. Gentag trin 4.2.2.4 og 4.2.2.5 gang.
        7. Lufttørre pellet i 10 min.
        8. Rehydrere pellet i 50 pi RNase-frit vand, inkuberes ved 55 ° C i 5 minutter og fortsætte direkte til DNase-behandling. Brug Bioanalyzer at kontrollere kvaliteten af ​​RNA (anbefales).
        9. Store RNA i portioner ved -20 ° C eller -80 ° C til langtidsopbevaring.

Representative Results

Virale Metagenomes

CF sputum er usædvanligt tyktflydende og indeholder en stor mængde af mucin og frit DNA (figur 2A); den densitetsgradientultracentrifugering letter fjernelse af værtsafledt DNA (figur 2B). Resultaterne fra en tidligere undersøgelse 9 viser otte viromes genereret fra den præsenterede arbejdsgang er opsummeret her (tabel 1). Syv prøver (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A, og CF5-B, tabel 1) blev behandlet som beskrevet i afsnit 2. De genererede viromes indeholdt lidt (0,02 % -3,7%) humant afledte sekvenser med kun én undtagelse (70%). CF4-A blev udeladt fra densitetsgradientultracentrifugering trin (CF4-A) og virome genereret fra denne specifikke prøve indeholdt> 97% human-afledte sekvenser (tabel 1). Figur 2 viser et eksempel på epifluorescensmikroskopi billede af en typisk CF sputum prøven før (figur 2A) og efter (figur 2C) densitetsgradientultracentrifugering. Klare virale-lignende partikler (VLP'er) blev observeret i micrographs uden store partikler efter densitetsgradient separation. Efter VLP'er DNA-ekstraktion, er bakteriel forurening ofte testet under anvendelse af 16S rDNA amplifikation forud for sekventering af VLP'er DNA.

Mikrobiel Metagenomes

Syv sputumprøver præsenteres her blev indsamlet fra en enkelt CF patient over syv dage i træk. Patienten startede den oral antibiotika (ciprofloxacin og doxycyclin) på dag 3 efter spyt blev indsamlet. Mængden af ​​hver sputum prøve indsamlet fra denne patient var 15 ml i hele de 7 dage; derfor blev PBS ikke tilsat til prøven. Målet med denne prøveudtagning begivenhed var at evaluere de protokoller præsenteres i denne arbejdsgang ved (i) vurdering daglige udsving i mikrobielle samfund struktur, og (ii) sammenligneden mikrobielle samfunds struktur og opløsning mellem metagenomics og 16S rDNA sekventering. Derfor blev total DNA og HL-DNA ekstraheret fra hver prøve.

HL-DNA-koncentration af hver sputumprøve efter DNA ekstraktion er præsenteret i tabel 2. Det totale udbytte af HL-DNA varierede fra 210 ng til> 5 ug. Illumina sekventering biblioteker blev genereret med i alt udgangsmaterialet med 1 ng for hver prøve (figur 3). De kendetegn for metagenomet data er præsenteret i tabel 2. Alle undtagen én bibliotek gav mere end 1 million sekvenser og mere end 85% af høj kvalitet sekvenser blev bibeholdt på data forbehandling ved hjælp af PRINSEQ 29 softwaren. Alle datasæt blev først forbehandles for at fjerne dubletter og sekvenser af lav kvalitet (minimum kvalitet score på 25), efterfulgt af yderligere screening og fjernelse af humant afledte sekvenser ved anvendelse DeconSeq 30. Mængden af ​​menneskelig-deafart sekvens forurening er meget afhængig af prøven egenskaber. Her er den totale mængde af humant afledte sekvenser varierede fra 14 til 46% (tabel 2). De forbehandlede sekvenser blev derefter kommenteret under anvendelse af Metaphlan 31 pipeline samt MG-RAST 32 server.

Ud over metagenomes blev 16S rDNA amplicon biblioteker genereret fra både det samlede DNA og HL-DNA via primere rettet mod ca. 300 bp af den variable region V1-V2 i 16S rRNA-genet 33,34. PCR-produkter fra de enkelte prøver blev normaliseret og puljet til sekventering ved hjælp af Illumina 500-cycle parret ende sekventering udført på MiSeq platformen. Parret-end 16S rDNA amplicon sekvenser blev ordnet efter prøven via stregkoder ved hjælp af en python script og den parrede læser blev samlet ved hjælp phrap 35,36. Samles sekvens ender blev trimmet til den gennemsnitlige kvalitet point er ≥20 med en 5 nt vindue. Potentielle kimærer varn fjernes med Uchime 37 imod en kimære-fri delmængde af SILVA 38 referencesekvenserne. Taxanomy fik den høje kvalitet læser med SINA 39 (version 1.2.11) ved hjælp af de 418.497 bakterielle sekvenser fra SILVA 38 database. Sekvenser med identiske taksonomiske opgaver blev grupperet til at producere operationelle Taxonomiske Units (Otus). Denne proces genereret 1655278 sekvenser i 16 prøver (gennemsnitsstørrelse: 103.455 sekvenser / prøve, min: 72.603, max: 127113). Medianen Goods dækning score, et mål for fuldstændigheden af ​​sekventering, var ≥ 99,9%. Den software-pakke Explicet 40 (v2.9.4, www.explicet.org) blev anvendt til analyse og figur generation. Alpha-diversitet (intra-prøve) og beta-diversitet (inter-prøve) blev beregnet i Explicet ved rarefaction punkt på 72.603 sekvenser med 100 bootstrap re-prøveudtagninger.

Det første spørgsmål rettet af denne undersøgelse var, om hypotonisk lysis preferentiallieret vælger for (dvs. fortrinsvis bevarer eller re- duktion) bestemte grupper af mikrober. Efter den første hypotonisk lyse, blev resuspenderede pelleterede celler subsampled fra de to første prøver (CF1-1A * og CF1-2A *) til at sammenligne med de samme prøver efter den anden hypotonisk lysis (CF1-1and CF1-2). Alle prøver blev behandlet ens, dvs. behandlet med DNase I forud for DNA-ekstraktion, efterfulgt af DNA-ekstraktion og sekventering pipeline. Som vist i figur 4, de mikrobielle profiler af delprøver er meget lig prøverne efter to hypotonisk lyse behandlinger. Derudover anden hypotonisk lysis forøger fraktionen af ikke-humane sekvenser med 6-17% inden for de metagenomes (tabel 2).

For at teste for forskelle i mikrobiel sammensætning mellem metagenomic- og 16S rDNA-baserede profilering, og for ændringer før og efter hypotonisk lyse, der kan forklare forskellene tidligere set mellem vores stutterierne og andre blev bakterielle 16S rDNA sekventering biblioteker genereret fra både det samlede DNA og HL-afledt DNA (figur 4B). På slægten niveau, taksonomi profiler af de fælles CF-associerede bakterier såsom Pseudomonas, Stenotrophomonas, Prevotella, Veillonella og Streptococcus var meget ens mellem 16S rDNA biblioteker og metagenomes genereret fra HL-afledte DNA. Men Rothia opdagelse i 16S rDNA bibliotekerne ikke var så rigelige som de metagenomisk biblioteker. Når man sammenligner 16S rDNA taksonomiske profiler genereret fra total DNA og HL-afledt DNA blev Pseudomonas differentielt repræsenteret i den samlede DNA i forhold til HL-afledte DNA start fra dag 3.

Metatranscriptomes

Typisk det totale RNA ekstraheret fra CF spyt er delvist nedbrudt og størrelsen varierer fra 25-4,000 bps (figurerne 5A og et al. 2012 9. Fraktionen af rRNA inden for de ikke-udtømte metatranscriptomes spænder fra 27 til 83%, og den relative overflod af rRNA varierede på tværs af prøver (tabel 3; data udtrukket fra Lim et al. 9). Imidlertid udtømning med Ribo-Zero kit faldt rRNA'er relative overflod af rRNA til 1-5% med undtagelse af prøve CF1-F. Variationen i effektiviteten af rRNA fjernelse kunne afspejle kvaliteten af ekstraheret RNA, eller forskelle i det mikrobielle samfund til stede og dermed adgangen til rRNA'er for sonder hybridisering 9. Elektroferogrammerne for en vellykket (figur 5B) og mislykket (figur 5D) rRNA fjernelse procedure ved hjælp af Ribo-Zero rRNA afmonteringssæt forskellige, hvor rRNA toppe er synlige i den tabende fjernelse.

Størrelsesområdet af cDNA-biblioteker GEnereres afspejler ofte størrelsesområdet af udgangsmaterialet RNA-prøven. CDNA-bibliotekerne præsenteres her blev dannet med en hel transkriptom forstærkning kit (WTA2) ved rRNA udtømning efterfulgt af Roche-454 sekventering bibliotek forberedelse 9. CDNA'et genererede indeholde fragmenter spænder fra 50-4,000 bps (figur 5E og 5F), og er meget konsekvent på tværs prøver (Lim et al. 2012) 9. Tilgængeligheden af ​​anden platform-specifikke RNA-Seq klargøring bibliotek kits øjeblikket give flere alternative muligheder for en at kombinere cDNA syntese og forberedelse sekventering bibliotek i optimale betingelser. En anbefalet mulighed til dato er den ScriptSeq Complete Guld Kit kombinerer rRNA fjernelse reagenser anbefales ovenfor og RNA-Seq forberedelse bibliotek kit.

Figur 1
Figur 1: Workflow for prepredelsen af ​​host-associerede prøver, såsom sputum prøve, for virome, microbiome og metatranscriptome sekventering.

Figur 2
Figur 2: Cæsiumchlorid densitetsgradienter ultracentrifugering lette fjernelsen af ekstracellulært DNA og store partikler (A), og giver mulighed for optimal isolering af viral-lignende partikler fra CF spyt. En milliliter af hver gradient lag oven på hinanden, før indlæsning af forbehandlede prøve (B). Efter partikler isolering og oprensning, epifluorescens mikroskopi med nukleinsyre farvestoffer, såsom SYBR Gold bruges til at verificere tilstedeværelsen og renheden af ​​viruspartikler i prøver. Klare virale partikler (C hvid pil) blev observeret efter densitetsgradient separation af CF spyt prøve.


Figur 3:. Eksempel på størrelsesfordelingen af Nextera XT biblioteker genereret fra 1 ng HL-DNA, der resulterede i CF sputum microbiomes Bibliotek normalisering, samle, og lastning beløb blev udført som beskrevet i producentens protokol uden nogen forstyrrelser.

Figur 4
Figur 4: Taxonomisk analyse af de mikrobielle samfund i ni prøver indsamlet langs fra et CF-patient (A) Mikrobiel profiler baseret på metagenomisk biblioteker genereret fra hypotonisk lysis metode-baserede DNA.. Opgaven arter var baseret på Metaphlan pipeline følgende data forbehandling at fjerne dubletter og sekvenser med lav kvalitet og human sekvenshomologi. For at vise, at to-steps hypotonisk lysis ikke fortrinsvis vælger for særlige grupper af mikrober, delprøver (*) efter den første hypotonisk lyse indgik. (B) Mikrobiel profiler baseret på V1V2 regionen i 16S rRNA-genet sekventering fra total DNA (T) og hypotonisk lysis metode -baseret DNA (HL). Disse data er ikke tidligere blevet udgivet.

Figur 5
Figur 5: Eksempler på Agilent 2100 Bioanalyzer elektroferogrammer af RNA (AD) og cDNA (EF), der genereres for metatranscriptomic biblioteker, ved hjælp af RNA-pico og højfølsomme dsDNA chips hhv. (A) og (C) viser eksempler på elektroferogrammer før rRNA rensningsprocedurer. Elektroferogrammerne for en vellykket (B) og mislykket (D) rRNA fjernelse procedure ved hjælp af total rRNA afmonteringssæt afvige lidt, ent som rRNA-toppe er synlige i den tabende fjernelse. Størrelsen vifte af cDNA (EF), der genereres ved hjælp af hel-transkriptom forstærkning kit (Sigma-Aldrich) svarer til størrelsen rækkevidde start rRNA-udtømte RNA, og meget konsekvent på tværs af de to forskellige prøver. Klik her for at se en større version af denne figur.

CF1-D CF1-E CF1-F CF4-A CF4-B CF4-C CF5-A CF5-B
Samlet antal læser 224.859 87.891 106.189 93.301 140.020 1.558 272.552 217.438
Forbehandlet læser en 109.389 73.624 67.070 82.011 68.617 1.137 215.808 158.432
49% 84% 63% 88% 49% 73% 79% 73%
Antal baser 47239573 33351525 28922479 27667695 29386841 243.986 95205805 69581811
Mean læse længde 432 453 431 337 428 215 441 439
Host sekvenser b 240 526 28 79.774 13 797 585 5859
0,21% 0,71% 0,04% 97,27% 0,02% 70.10% 0,27% 3,70%
Virale hits c 7214 23.550 4.070 737 4642 22 6466 5981
6,59% 31.99% 6,07% 0,90% 6,77% 1,93% 3,00% 3,78%
Ikke-tildelt Læser d 103.888 60.490 32.780 1.935 68.440 311 105.612 119.551
94,97% 82,16% 48.87% 2,36% 99,74% 27.35% 48,94% 75,46%
a Læser efter data pre-processing af PRINSEQ 29.
b menneskelige læser identificeret ved DeconSeq 30 plus læser med en bedste BLASTN hit (NCBI nukleotid database) til phylum Chordata.
c TBLASTX rammer mod in-house virusgenom database. Procentdelen blev beregnet ved hjælp af samlede antal forbehandlet læser.
d Læser uden BLASTN ramt mod NCBI nukleotid database. Procentdelen blev beregnet ved hjælp af samlede antal forbehandlet læser. Nogle læser uden BLASTN ramt mod NCBI nukleotid database blev identificeret som viral på proteinniveau i TBLASTX analyse.

Tabel 1:. Bibliotek karakteristika otte viromes genereret fra spytprøver ved hjælp præsenteret arbejdsproces Denne tabel udvundet fra Lim <em> et al. (2012) 9. Syv prøver (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A, og CF5-B) blev behandlet som beskrevet i afsnit 2, og genererede viromes der indeholdt lidt (0,02% - 3,7 %) human-afledte sekvenser med én undtagelse (70%). CF4-A blev udeladt fra densitetsgradientultracentrifugering trin (CF4-A) og genererede virome som indeholdt> 97% human-afledte sekvenser.

Prøve Koncentration Totalt udbytte Total No. Læser Total Nej Læser (forarbejdet b) Ikke-humane sekvenser
(Ng / pl) (Ng) (Raw a) (%)
CF1-1A * 2.3 1098454 937.688 691.541
74%
CF1-1 13 1.300 2212756 1958910 1574520
80%
CF1-2A * 2.1 210 672.878 588.106 407.530
69%
CF1-2 5.2 520 1944012 1697010 1455174
86%
CF1-3 28.8 2.880 1048304 896.756 560.852
63%
CF1-4 24.1 2.410 1154922 984.702 621.098
63%
CF1-5 33.6 3360 1029622 888.630 481.548
54%
CF1-6 43.2 4320 1434016 1256504 725.858
58%
CF1-7 57,8 5780 1000174 872.036 565.376
65%
* 1 ml prøve blev subsampled fra CF1 -1 Og CF1-2 efter den første hypotonisk lysis (trin 3.1.5), før den anden hypotonisk lysis procedure. Cellerne blev spundet ned som beskrevet i 3.1.7 og fortsætte gennem den resterende protokol uden ændringer.
en Uforarbejdet Illumina læser fra en 2 x 300 bp MiSeq sekventering løb.
B Læser blev vurderet, trimmet, og fjernes baseret på kvalitet og længde som beskrevet i diskussionen.

Tabel 2:. Karakteristik af microbiomes genereret fra spytprøver ved hjælp præsenteret workflow DNA-koncentration af hver prøve i 100 pi elueringsbuffer (5 mM Tris / HCl, pH 8,5), og hvilke egenskaber sekvensdata Den præsenteres. I alt 1 ng blev anvendt til at generere individuelle bibliotek under anvendelse af Nextera XT biblioteket forberedelse kit.

0 "FO: keep-together.within-side =" altid "> Prøve CF1-D CF1-F CF4-B CF4-C Behandling Ingen Ribo-Zero Ingen Ribo-Zero Ingen Ribo-Zero Ingen Ribo-Zero Forbehandlet læser 2.088 1.991 40.876 25.238 19.728 32.737 31.791 36.172 Mean læse længde 275 245 262 270 233 259 240 267 Total rRNA læser 1,737 91 29.499 17.267 5285 291 16.371 1.761 83,20% 4,60% 72.20% 68,40% 26.80% 0,90% 51.50% 4,90% Mikrobiel rRNA 1.414 32 19.978 12.035 23 227 6916 1.076 67.70% 1,60% 48.90% 47.70% 0,10% 0,70% 21.80% 3,00% Eukaryota rRNA 323 59 9520 5232 5262 64 9455 683 15.50% 3,00% 23.30% 20.70% 26.70% 0,20% 29.70% 1,90% % RRNA fjernet * 0% 95% 0% 5% 0% 97% 0% 91% Ikke-rRNA læser 351 (16,8%) 1.900 (95,4%) 11.377 (27,8%) 7971 (31,6%) 14.443 (73,2%) 32.446 (99,1%) 15.420 (48,5%) 34.411 (95,1%) Total NR hits 102 (4,9%) 691 (34,7%) 3327 (8,1%) 2.857 (11,3%) 4.938 (25,0%) 10.751 (32,8%) 5905 (18,6%) 15.766 (43,6%) Eukaryot 74 407 2.790 2.524 4614 10.227 4553 8274 Bakteriel 26 283 520 312 287 471 1.326 7442 Ikke-tildelt læser 249 (11,9%) 1.209 (60,7%) 8.050 (19,7%) 5114 (20,3%) 9505 (48,2%) 21.695 (66,3%) 9515 (29,9%) 18.645 (51,5%) * Mængden af ​​rRNA fjernet udtrykt som en procentdel af den tilstedeværende mængde i det ikke-forarmet portion.

Tabel 3:. Library karakteristika for de metatranscriptomes med og uden rRNA udtømning data hentes fra Lim et al (2012) 9, som har yderligere sammenligning af andre rRNA fjernelse kits og virkningen af cDNA forstøvning før forberedelse sekventering bibliotek..

Discussion

Viral Metagenomics

Virale partikler er koncentreret under anvendelse af polyethylenglycol (PEG) udfældning eller små mængder koncentratorer. I nogle tilfælde kan koncentrationen ikke være nødvendig, men før filtrering eller centrifugering ved lav hastighed trin anvendes til at fjerne eukaryote og mikrobielle celler. Virale lysater vil blive yderligere beriget og oprenset ved anvendelse af densitetsgradientultracentrifugering 9,41 eller mindre størrelse filtre (fx 0,45 um) til fjernelse af eukaryote og store mikrobielle celler 25. Densitetsgradientultracentrifugering udføres typisk med tætte men inerte opløsninger, såsom saccharose eller caesiumchlorid at isolere og koncentrere viruspartikler 41. Fysisk adskillelse er baseret på størrelsen og aerometermassefylde af viruspartikler. Derfor korrekt valg af porestørrelse og stringent fremstilling af gradienter er af afgørende betydning at isolere specifikke virale samfund, som succes fysisk genopretning afVLP'er fastsætte Fællesskabets isoleret 41 (dvs. viruspartikler, som ikke passerer gennem filteret eller falder inden for udvinding tæthed vil ikke blive detekteret i metagenomet). Efter viral isolation og koncentration, kan der være kontaminerende non-viral genomisk materiale til stede i prøven, både i form af frie nukleinsyrer og mikrobiel og eukaryote celler. Derfor er det kritisk at kontrollere renheden af viruspartikler i prøver (1A og 1B). En chloroform behandling er almindeligt anvendt til at lysere de resterende celler efterfulgt af nuklease behandling for at nedbryde frie nucleinsyrer før nukleinsyre ekstraktion.

En advarsel til den præsenterede arbejdsgang var brugen af ​​densitetsgradient separation for at isolere viruspartikler, som det kan udelukke omsluttede virale partikler, der kan være for kraftig til at indtaste CsCI-gradient. En alternativ "catch-all" metode er at udelade densitetsgradienten separation og isolere fællesskabet DNA fra 0,45 um - filtrater behandlet med chloroform og DNase I. Denne fremgangsmåde er også hensigtsmæssigt at rumme små prøvevolumener såsom dem fra podninger eller blodplasma. Dette kan dog resultere i chloroform-resistent bakteriel forurening og større mængde DNase-resistente ekstracellulært DNA.

Aktuelle sekventering protokoller kræver 1 ng til 1 ug nukleinsyrer til forberedelse sekventering bibliotek, hvor højere DNA renter giver et større udvalg af sekventering indstillinger. DNA-koncentrationen af ​​genererede viromes Den ofte spænder fra under detektionsgrænsen til mere end 200 ng / pl. Mængden af ​​virale nukleinsyrer genvundne kan være utilstrækkelige til forberedelse direkte sekventering bibliotek. I sådanne tilfælde nukleinsyreamplifikation er afgørende. Linker forstærkning shotgun biblioteker (LASLs) 2,42,43 og hele genomet forstærkning baseret på forstærkning flere forskydning (MDA) er de tometoder mest almindeligt anvendes til at generere tilstrækkelig DNA til sekventering. MDA fremgangsmåder, såsom dem baseret på Phi29 DNA-polymerase er kendt for at lide af amplifikationsprodukter afvigelser, og kan fortrinsvis forstærke ssDNA og cirkulært DNA, hvilket resulterer i ikke-kvantitativ taksonomiske og funktionel karakterisering 44,45. En optimeret version af LASLs fremgangsmåde har vist sig at indføre kun minimale afvigelser, fremmer højere følsomhed (for små mængder af udgangsmateriale) og kan nemt tilpasses til forskellige sekventering platforme 43. Imidlertid fremgangsmåde har mange trin, kræver specialudstyr for at minimere DNA-tab, og er begrænset til dsDNA templates. I vores laboratorium, er denne fremgangsmåde med succes blevet tilpasset til at forstærke påviselig og målbart mængde DNA ekstraheret fra bronchoalveolær lavage-, coral- og havvand-afledte VLP'er (upublicerede og Hurwitz et al. 46).

Udvikling dataanalyse rørledninger har CLAssically været en af ​​de mest udfordrende aspekter af virale metagenomics analyse på grund af den meget forskelligartede og stort set ukendt karakter virale samfund. Mens der er en anslået 10 8 virale genotyper i biosfæren, til dato aktuelle virale databaser indeholder ~ 4.000 virusgenomer, hvilket er omkring 1 / 100.000 af denne omtrentlige samlede viral mangfoldighed. Derfor lighed-baserede søgninger (såsom BLAST 47) for taksonomiske og funktionelle opgave i virale metagenomes besidder iboende udfordringer. Mange sekvenser undlader at have væsentlige ligheder med genomer i databasen, og derfor er klassificeret som ukendt. Selvom homologi-baserede søgninger er de vigtigste applikationer til at tildele taksonomi og funktion til sekvens data, har alternative metoder baseret på database-uafhængig analyse udviklet 48- 50. Fancello et al. 51 giver en fuldstændig gennemgang af beregningsværktøjer og algoritmer, der anvendes i Viral metagenomics.

Mikrobiel Metagenomics

Typisk er den totale mængde af DNA ekstraheret fra hypotonisk lyse behandlet mikrobielle samfund (HL-DNA) fra 20 ng til 5 ug. Udbyttet er meget afhængig af patientens sundhedstilstand og mængden af spyt prøve indsamlet, hvilket forklarer variationerne set i det totale udbytte af HL-DNA ekstraheret i denne undersøgelse (tabel 2). De kritiske trin at generere gode kvalitet sekvensdata stole på kvaliteten af sekventering biblioteker genereret. Figur 2 viser en typisk Størrelsesområdet for sekventering biblioteker genereret fra CF sputum-afledte mikrobiel DNA under anvendelse af en enzymatisk baseret DNA fragmentation procedure. Den optimale bibliotek størrelse er afhængig af valget af sekventering platform og anvendelse, og derfor kan opsplitningen procedure optimeres, om nødvendigt gennem alternative fremgangsmåder, såsom lydbehandling og forstøvning. Ud overde præsenterede repræsentative resultater, er den succes, præsenterede metode på CF-spyt indsamlet fra flere patienter på tværs af flere tidspunkter også illustreret i Lim et al. (2012) 9 og Lim et al. (2014) 10.

Tidligere undersøgelser 9,10 tyder på, at hver patient huser en unik samling af mikrobielle samfund, der skifter over tid, hvilket afspejler de vedvarende de store aktører i samfundet, mens udsving er sandsynligvis på grund af forstyrrelser såsom antibiotiske behandlinger. Hvorvidt disse udsving opstår dagligt selv uden ydre forstyrrelser eller på grund af proceduren prøvetagning og prøve behandling, er stadig tale om. Baseret på HL-DNA metagenomisk og 16S rDNA amplicon analyse viser 7-dages langsgående prøvetagning, at den daglige udsving af mikrobielle profiler uden antibiotisk perturbation (dag 1, 2 og 3) blev minimal (figur 3A og 3B). Efter introduktion af orale antibiotika umiddelbart efter Dag 3 stikprøver, ændringer i samfundet profil blev klart på dag 4. Mens antibiotika ciprofloxacin rettet mod et bredt spektrum af kendte bakterielle patogener som P. aeruginosa, Staphylococcus aureus og Streptococcus pneumonia, behandlingen steg den relative forekomst af P. aeruginosa mens faldende Streptococcus spp. og P. melaninogenica. Efter 6 dage, samfundet langsomt genvundet til den oprindelige start samfund struktur. Resultaterne antyder, at der er større sandsynlighed udsving i mikrobielle profiler inden for en enkelt patient på grund af EF forstyrrelser i luftvejene.

I betragtning af sammenhængen mellem de mikrobielle profiler af 16S rDNA biblioteker og metagenomes fra HL-afledt DNA, vi udelukkede bias hidrører fra 16S rRNA primere anvendt i denne undersøgelse. En mulig forklaring på forskellene set på tværs af 16S rDNA taksonomiskeAL-profiler genereret fra total DNA og HL-afledt DNA (figur 3B) kan være tilstedeværelsen af store mængder af Pseudomonas spp. ekstracellulært DNA efter antibiotisk behandling. Dette understøttes af resultaterne, at disse forskelle var tydeligst på dag 7, tre dage efter antibiotika behandling, som er rettet mod Pseudomonas spp. i tillæg til andre. Ciprofloxacin er almindeligt anvendt som førstevalg til patienter med CF og kronisk P. aeruginosa infektion, selv om dens spektrum af aktivitet omfatter de fleste CF-patogener. Vi antager, at den antibiotiske behandling udrydder modtagelige samfund herunder Streptococcus spp. og dermed skabe en niche fyldt med resistente P. aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa kan få modstand ved at øge sine biofilm samfund og ekstracellulært DNA har vist sig at være den vigtigste strukturelle støtte for biofilm arkitektur 52. Selv som than community struktur genvundet, ekstracellulært DNA kan være forblevet på CF spyt. Derfor tyder disse data på, at hypotonisk lysis og vasketrinnene præsenteres i denne arbejdsgang potentielt fordel i ikke kun at fjerne humant-afledt DNA, men også mikrobiel afledt ekstracellulært DNA, som kan forvanske de faktiske mikrobielle profiler.

Metatranscriptomics

En høj kvalitet metatranscriptome bør indeholde relativt få ribosomale RNA (rRNA) sekvenser og udgør en saglig prøvetagning af community udskrifter (mRNA). På grund af den korte halveringstid og begrænset mængde af mRNA, er det afgørende, at protokollen, som præsenteres her, minimerer prøvehåndtering at maksimere antallet af udskrifter inddrevet.

I de seneste år har adskillige tilgange til rRNA depletion blevet udviklet og tilpasset i kommercielt tilgængelige kits. Disse omfatter Microb Enrich, Ribo-Zero, og prøve-specifikke subtraktiv hybridizations 53 der er baseret på oligonukleotidhybridisering og mRNA-ONLY kit, der er baseret på exonuclease enzymatisk aktivitet rettet mod RNA indeholdende en 5'-monophosphat. Desuden har flere metoder til mRNA berigelser som MessageAmp II-Bakterier Kit, som fortrinsvis polyadenylates og forstærker lineær RNA er også tilgængelige. Nogle af disse metoder (fx mRNA-ONLY, Microb E Xpress og MessageAmp) anvendes samtidig for optimal effektivitet. Men effekten af ​​alle disse tiltag er begrænset, især når der arbejdes med delvist nedbrudt rRNA, som ofte observeres i total RNA udvundet fra CF prøver. Polyadenylering-afhængig RNA-amplifikation, kan ikke anvendes til at generere metatranscriptomes bestående af både eukaryote og prokaryote mRNA. Desuden poly (A) hale tilsat til sekvenser reducerer mængden af ​​nyttige sekvensdata. Regioner med homopolymere strækninger vil være tilbøjelige til at have lavere kvalitet scoringer, causing et betydeligt antal læser skal filtreres ud ved sekventering og post-sekventering software, og den gennemsnitlige nyttig læsning længde efter trimning off poly vil (A) haler markant 54 reduceres.

Beskæftiger sig med komplekse CF mikrobielle samfund og delvist nedbrudt RNA (figur 4A og 4C), vores tidligere undersøgelse viste, at hybridisering-capture metode ved Ribo-Zero Gold kit var mere effektiv til at fjerne både menneskers og mikrobiel rRNA i forhold til de kombinerer behandlinger ved hjælp af andre kits 9 (tabel 3). De resulterende data muliggør samtidig analyse af både menneskelig vært og mikrobielle udskrifter. Afhængigt af udbyttet og kvaliteten af ​​RNA samt endelige valg af sekventering platform, kan mange af disse processer, herunder cDNA syntese trin strømlines med sekventering bibliotek generation. For eksempel kan Ribo-Zero behandlet RNA anvendes til at fremstille metatranscriptome sekventering libraRies hjælp ScriptSeq RNA-Seq Bibliotek forberedelse kit.

Metagenomisk analyse af animalske-associerede samfund giver en omfattende repræsentation af den samlede funktionelle enhed, der omfatter værten og associerede samfund. Arbejdsgangen præsenteres her kan tilpasses til en bred vifte af komplekse animalske-associeret prøver, især dem, der indeholder tykke slim, store mængder af cellerester, ekstracellulært DNA, protein og glycoprotein komplekser, såvel som værtsceller i tillæg til den ønskede virale og mikrobielle partikler. Selvom virale og mikrobielle partikler kan gå tabt på hvert trin, partikler isolering og oprensning er afgørende for at minimere mængden af ​​værts-DNA. Mens metagenomics data giver metaboliske potentialer de undersøgte samfund metatranscriptomics supplere dette ved at afsløre den forskellige udtryk for kodede funktioner 9. En samlet vurdering af genomforskning og udskrifter data har givet nye insflyvninger til dynamikken i lokalsamfundet interaktioner og fremmer udviklingen af forbedrede behandlingsformer 9,10,55.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health (1 R01 GM095384-01) udstedt til Forest Rohwer. Vi takker Epicentre, et Illumina selskab for at give tidlig adgang til Ribo-Zero Epidemiologi kits. Vi takker Mark Hatay til design og produktion af indehaveren af ​​ultracentrifugering røret. Vi takker Andreas Haas og Benjamin Knowles til kritiske læsninger og diskussioner af manuskriptet, og Lauren Paul for at bistå optagelserne processen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer Life Technologies 10296-028 TRIzol LS Reagent was used in this study
Silica beads; 0.1 to 0.15 mm Cole-Parmer YO-36270-62 Zirconia-silicate beads were used in this study
Dithiothreitol, molecular grade (dry powder) Promega V3155 Can be purchased from any other company
Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane Millipore SLHV033RS
DNase I enzyme  Calbiochem 260913
Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-13 Diameter: 25 mm
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman 344059 9/16 x 3 ½ in. (14 x 90 mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation
SW41 Ti Rotor Beckman 333790
SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
Phi29 DNA polymerase Monserate Biotech 4001 10 U/µl
Phi29 Random Hexamer Thermo Scientific S0181 Previously bought from Fidelity Systems
Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-34 Whatman Anodisc filter membranes were used in this study; diameter 25 mm
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S-11494
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNase-free DNase I  NEB M0303S Can be purchased from any other company
Glycogen, RNA grade FisherScientific FERR0551 Can be purchased from any other company
Oak Ridge high-speed centrifuge tubes FisherScientific 05-562-16B For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor
Total rRNA removal kit Epicentre MRZE724 ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation
Cesium chloride  FisherScientific BP1595-500
Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Suau, A., et al. Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut. Applied and Environmental Microbiology. 65 (11), 4799-4807 (1999).
  2. Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).
  3. Proctor, L. M. The human microbiome project in 2011 and beyond. Cell Hos., & Microbe. 10 (4), 287-291 (2011).
  4. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (8), 957-963 (2011).
  5. Pragman, A. A., Kim, H. B., Reilly, C. S., Wendt, C., Isaacson, R. E. The lung microbiome in moderate and severe chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 7 (10), e47305 (2012).
  6. Kerem, B., et al. Identification of the Cystic Fibrosis gene: Genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  7. Kleven, D., McCudden, C., Willis, M. Cystic Fibrosis: Newborn screening in America. Medical Laboratory Observer. 40 (7), 16-27 (2008).
  8. Fodor, A. A., et al. The adult cystic fibrosis airway microbiota is stable over time and infection type, and highly resilient to antibiotic treatment of exacerbations. PLoS ONE. 7 (9), e45001 (2012).
  9. Lim, Y. W., et al. Metagenomics and metatranscriptomics: Windows on CF-associated viral and microbial communities. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 12 (2), 154-164 (2012).
  10. Lim, Y. W., et al. Clinical insights from metagenomic analysis of sputum samples from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 52 (2), 425-437 (2014).
  11. Claesson, M. J., et al. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucleic Acids Research. 38 (22), e200 (2010).
  12. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23 (4), 722-723 (1995).
  13. Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of Cystic Fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (23), 9188-9192 (1990).
  14. Lethem, M., James, S., Marriott, C., Burke, J. The origin of DNA associated with mucus glycoproteins in Cystic Fibrosis sputum. European Respiratory Journal. 3 (1), 19-23 (1990).
  15. Childs, W. C., Gibbons, R. J. Use of percoll density gradients for studying the attachment of bacteria to oral epithelial cells. Journal of Dental Research. 67 (5), 826-830 (1988).
  16. Lee, J. -L., Levin, R. E. Use of ethidium bromide monoazide for quantification of viable and dead mixed bacterial flora from fish fillets by polymerase chain reaction. Journal of Microbiological Methods. 67 (3), 456-462 (2006).
  17. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23 (4), 722-723 (1995).
  18. Mokili, J. L., Rohwer, F., Dutilh, B. E. Metagenomics and future perspectives in virus discovery. Current Opinion in Virology. 2 (1), 63-77 (2012).
  19. Bibby, K. Improved bacteriophage genome data is necessary for integrating viral and bacterial ecology. Microbial Ecology. 67 (2), 242-244 (2014).
  20. Willner, D., et al. Metagenomic analysis of respiratory tract DNA viral communities in Cystic Fibrosis and non-Cystic Fibrosis individuals. PloS One. 4 (10), e7370 (2009).
  21. Willner, D., Furlan, M. Deciphering the role of phage in the cystic fibrosis airway. Virulence. 1 (4), 309-313 (2010).
  22. Willner, D., et al. Case studies of the spatial heterogeneity of DNA viruses in the cystic fibrosis lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (2), 127-131 (2012).
  23. Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012-e00011 (2011).
  24. He, S., et al. Metatranscriptomic array analysis of “Candidatus Accumulibacter phosphatis”-enriched enhanced biological phosphorus removal sludge. Environmental Microbiology. 12 (5), 1205-1217 (2010).
  25. Mokili, J. L., et al. Identification of a novel Human Papillomavirus by metagenomic analysis of samples from patients with febrile respiratory illness. PLOS ONE. 8 (3), e58404 (2013).
  26. Henig, N. R., Tonelli, M. R., Pier, M. V., Burns, J. L., Aitken, M. L. Sputum induction as a research tool for sampling the airways of subjects with Cystic Fibrosis. Thorax. 56 (4), 306-311 (2001).
  27. Rogers, G. B., et al. Use of 16S rRNA gene profiling by terminal restriction fragment length polymorphism analysis to compare bacterial communities in sputum and mouthwash samples from patients with Cystic Fibrosis. J. Clin. Microbiol. 44 (7), 2601-2604 (2006).
  28. Haas, A., et al. Unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology. Journal of Visualized Experiments. In press, Forthcoming.
  29. Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics. 27 (6), 863-864 (2011).
  30. Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PLOS ONE. 6 (3), e17288 (2011).
  31. Segata, N., et al. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods. 9 (8), 811-814 (2012).
  32. Meyer, F., et al. The metagenomics RAST server - a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes. BMC Bioinformatics. 9 (1), 386 (2008).
  33. Hara, N., et al. Prevention of virus-induced type 1 diabetes with antibiotic therapy. Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950). 189 (8), 3805-3814 (2012).
  34. Markle, J. G. M., et al. Sex differences in the gut microbiome drive hormone-dependent regulation of autoimmunity. Science (New York, N.Y.). 339 (6123), 1084-1088 (2013).
  35. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  36. Ewing, B., Hillier, L., Wendl, M. C., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Research. 8 (3), 175-185 (1998).
  37. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics (Oxford, England). 27 (16), 2194-2200 (2011).
  38. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  39. Pruesse, E., Peplies, J., Glöckner, F. O. SINA: accurate high-throughput multiple sequence alignment of ribosomal RNA genes. Bioinformatics (Oxford, England). 28 (14), 1823-1829 (2012).
  40. Robertson, C. E., et al. Explicet: graphical user interface software for metadata-driven management, analysis and visualization of microbiome data. Bioinformatics (Oxford, England). 29 (23), 3100-3101 (2013).
  41. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nat. Protocols. 4 (4), 470-483 (2009).
  42. Henn, M. R., et al. Analysis of high-throughput sequencing and annotation strategies for phage genomes. PLoS ONE. 5 (2), e9083 (2010).
  43. Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Towards quantitative metagenomics of wild viruses and other ultra-low concentration DNA samples: a rigorous assessment and optimization of the linker amplification method. Environmental Microbiology. 14 (9), 2526-2537 (2012).
  44. Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nat Meth. 7 (12), 943-944 (2010).
  45. Kim, K. -H., Bae, J. -W. Amplification methods bias metagenomic libraries of uncultured single-stranded and double-stranded DNA viruses. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7663-7668 (2011).
  46. Hurwitz, B. L., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Evaluation of methods to concentrate and purify ocean virus communities through comparative, replicated metagenomics. Environmental Microbiology. 15 (5), 1428-1440 (2013).
  47. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).
  48. Angly, F., et al. PHACCS, an online tool for estimating the structure and diversity of uncultured viral communities using metagenomic information. BMC Bioinformatics. 6 (1), 41 (2005).
  49. Angly, F. E., et al. The GAAS Metagenomic Tool and Its Estimations of Viral and Microbial Average Genome Size in Four Major Biomes. PLoS Comput Biol. 5 (12), (2009).
  50. Dutilh, B. E., et al. Reference-independent comparative metagenomics using cross-assembly: crAss. Bioinformatics (Oxford, England). 28 (24), 3225-3231 (2012).
  51. Fancello, L., Raoult, D., Desnues, C. Computational tools for viral metagenomics and their application in clinical research. Virology. 434 (2), 162-174 (2012).
  52. Allesen-Holm, M., et al. A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms. Molecular Microbiology. 59 (4), 1114-1128 (2006).
  53. Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4 (7), 896-907 (2010).
  54. Frias-Lopez, J., et al. Microbial community gene expression in ocean surface waters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (10), 3805-3810 (2008).
  55. Lim, Y. W., et al. Mechanistic model of Rothia mucilaginosa adaptation toward persistence in the CF lung, based on a genome reconstructed from metagenomic data. PLOS ONE. 8 (5), e64285 (2013).

Tags

Molekylærbiologi virome microbiome metagenomics metatranscriptomics cystisk fibrose mucosal-overflade
Oprensning af Uren sekvensering Metagenomes og Metatranscriptomes fra komplekse Animal-associerede Prøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M.,… More

Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. (94), e52117, doi:10.3791/52117 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter