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Biology

अशुद्ध सफ़ाई: अनुक्रमण Metagenomes और Metatranscriptomes जटिल जानवर जुड़े नमूनों से

Published: December 22, 2014 doi: 10.3791/52117
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 1
1Department of Biology, San Diego State University, 2DOE Joint Genome Institute, 3Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado, 4Department of Pediatrics, School of Medicine, University of Colorado

Summary

एक उदाहरण के रूप में सिस्टिक फाइब्रोसिस वायु-मार्ग का उपयोग करना, पांडुलिपि पशु-जुड़े नमूनों में सूक्ष्म और वायरल समुदायों को चिह्नित करने के लिए metagenomic और metatranscriptomic दृष्टिकोण का एक संयोजन शामिल एक व्यापक कार्यप्रवाह प्रस्तुत करता है।

Abstract

उच्च throughput अनुक्रमण की पहुंच जीव विज्ञान के कई क्षेत्रों में क्रांति ला दी है। बेहतर मेजबान जुड़े वायरल और सूक्ष्म समुदायों को समझने के लिए, डीएनए और आरएनए निकासी के लिए एक व्यापक कार्यप्रवाह विकसित किया गया था। कार्यप्रवाह समवर्ती अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए एक भी नमूना से वायरल और माइक्रोबियल metagenomes, साथ ही metatranscriptomes, उत्पन्न करता है। इन तरीकों से युग्मन वर्गीकरण विशेषताओं और समुदाय इनकोडिंग कार्यों दोनों के एक सिंहावलोकन प्रदान करता है। यह असाधारण चिपचिपा है और mucins की उच्च राशि, नि: शुल्क न्युट्रोफिल डीएनए, और अन्य अज्ञात संदूषकों क्योंकि इसमें प्रस्तुत तरीकों, सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) थूक, एक समस्याग्रस्त नमूना प्रकार का उपयोग करें। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल इन समस्याओं को निशाना बनाने और सफलतापूर्वक न्यूनतम मानव डीएनए संदूषण के साथ वायरल और माइक्रोबियल डीएनए की वसूली। Metagenomics पढ़ाई के पूरक हैं, एक metatranscriptomics प्रोटोकॉल दोनों माइक्रोबियल ठीक करने के लिए अनुकूलित किया गया थाअपेक्षाकृत कुछ ribosomal शाही सेना (rRNA) दृश्यों में शामिल है कि और मेजबान mRNA के। डेटा विशेषताओं का अवलोकन विधियों की सफलता का आकलन करने के लिए एक संदर्भ के रूप में सेवा करने के लिए प्रस्तुत किया है। अतिरिक्त CF थूक के नमूने भी (मैं) एक ही मरीज के भीतर लगातार सात दिनों के पार microbiome प्रोफाइल के संगति का मूल्यांकन, और (ii) एक 16S ribosomal शाही सेना जीन के आधार पर क्रमबद्ध करने के लिए metagenomic दृष्टिकोण की स्थिरता तुलना करने के लिए एकत्र किए गए थे। परिणाम एंटीबायोटिक गड़बड़ी के बिना माइक्रोबियल प्रोफाइल के दैनिक उतार-चढ़ाव कम से कम था और आम CF-जुड़े बैक्टीरिया का वर्गीकरण प्रोफाइल के hypotonic सेल (एच) व्युत्पन्न डीएनए से उत्पन्न -16 rDNA पुस्तकालयों और metagenomes के बीच अत्यधिक इसी तरह के थे कि पता चला है। Hypotonic lysis और धोने कदम केवल मानव व्युत्पन्न डीएनए को दूर नहीं में लाभ का सुझाव है कि हालांकि, 16S rDNA वर्गीकरण प्रोफाइल के बीच मतभेद कुल डीएनए और एच एल व्युत्पन्न डीएनए से उत्पन्न, लेकिन यह भी extracellul माइक्रोबियल व्युत्पन्नवास्तविक माइक्रोबियल प्रोफाइल को गलत ढंग से पेश हो सकता है कि गिरफ्तारी के डीएनए।

Introduction

मानव शरीर के साथ जुड़े वायरल और सूक्ष्म समुदायों अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों 1,2 के आवेदन के माध्यम से पिछले एक दशक में बड़े पैमाने पर जांच की गई है। परिणामों मानव स्वास्थ्य और रोग में महत्व रोगाणुओं की मान्यता के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। बड़ी पहल मानव त्वचा पर रहने वाले बैक्टीरिया का वर्णन करता है कि मानव microbiome परियोजना (और कुछ आर्किया) से आया है, और मौखिक गुहा, एयरवेज, मूत्रजननांगी पथ, और जठरांत्र संबंधी मार्ग तीन के भीतर। ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना (बाल) 4,5 और nasopharyngeal swabs के 4 के माध्यम से स्वस्थ मानव एयरवेज के आगे microbiome पढ़ाई फेफड़ों के एक पर्यावरण नमूना डिवाइस, वायुमार्ग में क्षणिक माइक्रोबियल उपनिवेशन में परिणाम के रूप में सेवा कर सकते हैं कि पता चला है। हालांकि, बिगड़ा airway के सतहों में माइक्रोबियल उपनिवेशवाद के प्रभाव ऐसे सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) रोगियों में देखा उन के रूप में गंभीर और पुरानी फेफड़ों में संक्रमण, करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

टी "> सीएफ सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane नियामक (CFTR) में उत्परिवर्तन जीन 6 की वजह से एक घातक आनुवांशिक बीमारी है। ये परिवर्तन बदले में उपकला के शिखर सतह भर में transepithelial आयन परिवहन प्रभावित करने वाले दोषपूर्ण CFTR प्रोटीन को जन्म दे। रोग को प्रभावित करता है कई अंग प्रणालियों, लेकिन मृत्यु दर और रुग्णता के बहुमत सीएफ फेफड़ों के रोग 7 के कारण है। सीएफ फेफड़ों माइक्रोबियल उपनिवेशन के लिए एक अद्वितीय पारिस्थितिकी तंत्र प्रदान करता है। आयन परिवहन में दोष एरोबिक से मिलकर microenvironments बनाने, सीएफ एयरवेज में बनाने के लिए बलगम का कारण बनता है एक स्थिर पोषक तत्वों से भरपूर mucosal सतह द्वारा लंगर microaerophilic, और anaerobic डिब्बों। इस माहौल वायरल, बैक्टीरिया, और कवक सहित बसाना और रोगाणुओं के प्रसार, सुविधा। तीव्र और जीर्ण फेफड़े माइक्रोबियल संक्रमण है, जिसके परिणामस्वरूप निरंतर लेकिन अप्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए नेतृत्व व्यापक airway के remodeling, फेफड़े क्षमता की हानि, और अंततः pulmoआम विफलता।

सीएफ फेफड़ों के साथ जुड़े बैक्टीरियल समुदायों में अच्छी तरह से 16S ribosomal शाही सेना (rRNA) जीन अनुक्रमण 8 और बन्दूक metagenomics 9,10 का उपयोग शामिल है जो दोनों संस्कृति-निर्भर और संस्कृति स्वतंत्र दृष्टिकोण, का उपयोग करते हुए वर्णित किया गया है। -16 RRNA आधारित दृष्टिकोण माइक्रोबियल प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला की विशेषताएँ और सामुदायिक विविधता में व्यापक बदलाव के कब्जा करने के लिए सक्षम है। हालांकि, यह समुदायों को परिभाषित करने में अपने संकल्प में सीमित है (। Claesson एट अल 2010 में 11 संक्षेप) और चयापचय क्षमता की भविष्यवाणियों पहचान taxa के लिए जाना जाता है उन सामान्य कार्यों के लिए सीमित कर रहे हैं। इसलिए, -16 rRNA जीन अनुक्रमण विधियों सीएफ फेफड़ों में मौजूद विविध माइक्रोबियल समुदायों के आवश्यक वर्गीकरण और कार्यात्मक विश्लेषणात्मक सटीकता के लिए अपर्याप्त हैं। यहाँ वर्णित metagenomic दृष्टिकोण अपनी सीमाओं पर काबू पा, -16 rRNA आधारित दृष्टिकोण का पूरक है, और एक अपेक्षाकृत प्रभावी तरीके से सक्षम बनाता हैमाइक्रोबियल समुदाय वर्गीकरण और CF फेफड़ों में आनुवंशिक सामग्री दोनों का विश्लेषण करने के लिए।

पशु-जुड़े नमूनों से पृथक माइक्रोबियल डीएनए अक्सर मेजबान डीएनए की एक बड़ी राशि शामिल है। 14 - सीएफ थूक या फेफड़े के ऊतकों के नमूनों आमतौर पर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में न्यूट्रोफिल द्वारा जारी मानव डीएनए की एक बड़ी राशि, कुल डीएनए 12 की अक्सर 99% से अधिक होते हैं। कुछ बरकरार मानव कोशिकाओं में उपस्थित हो सकता है, इस डीएनए के सबसे समाधान में मुफ्त या रोगाणुओं की सतह पर adsorbed है। इसके अलावा, असाधारण चिपचिपा बलगम प्लग, सेलुलर मलबे, और अन्य अज्ञात contaminants की उपस्थिति आगे माइक्रोबियल कोशिकाओं के अलगाव को मुश्किल। कई तरीकों चुनिंदा मानव डीएनए 16, और MolYsis किट, सीमित सफलता के साथ सभी नीचा करने के लिए ethidium ब्रोमाइड monoazide माइक्रोबियल कोशिकाओं 15 से अलग मानव, DNase मैं के साथ इलाज करने के लिए Percoll ढ़ाल सहित मानव डीएनए के इन नमूनों, घट के लिए परीक्षण किया गया। सीएफ थूक के लिए सबसे प्रभावी माइक्रोबियल डीएनए शोधन प्रक्रिया तारीख करने के लिए Breitenstein एट अल द्वारा वर्णित प्रक्रिया के एक संशोधन किया गया है। (1995) 17। इस के साथ साथ hypotonic सेल (एच) पद्धति के रूप में जाना जाता है यह दृष्टिकोण, mucin डाइसल्फ़ाइड बांड, यूकेरियोटिक कोशिकाओं के hypotonic सेल, और घुलनशील डीएनए 9 की DNase मैं उपचार को कम करने के लिए β-mercaptoethanol के एक संयोजन का उपयोग करता है। विकल्प की कमी के बावजूद एच एल विधि (i) के लिए कुछ चिंताएं अवांछित रोगाणुओं की सेल और से उत्पन्न संभव पूर्वाग्रहों उठाया (द्वितीय) समुदाय रचना 9,10 में मनाया उतार चढ़ाव नमूना प्रसंस्करण के साथ जुड़े रूपों का एक artifact कर रहे हैं। बन्दूक metagenomes की पीढ़ी के अलावा, हम कुल डीएनए और लगातार सात दिनों में एक भी मरीज से एकत्र थूक के नमूने का एक ही सेट का उपयोग एच एल विधि से निकाला माइक्रोबियल डीएनए के -16 rRNA जीन प्रोफाइल के तुलना करके इन मुद्दों का समाधान।

माइक्रोबियल समुदायों की तुलना में ईएनटी ">, जानवरों के साथ जुड़े वायरल समुदायों के लक्षण वर्णन सीमित 18,19 है सीएफ एयरवेज में वायरल समुदायों केवल न्यूनतम 20 विशेषता किया गया है -।। 22 सीएफ एयरवेज में वायरल समुदायों के डीएनए निस्र्पक पहले metagenomic अध्ययन सीएफ फेफड़ों के साथ जुड़े सबसे वायरस फगेस 20 कर रहे हैं कि पता चला है। सीएफ और गैर-सीएफ व्यक्तियों में फेज की चयापचय क्षमता का काफी अलग था। विशेष रूप से, सीएफ व्यक्तियों में फेज समुदायों सीएफ एयरवेज के शरीर क्रिया विज्ञान के लिए जीवाणु मेजबान रूपांतरों को प्रतिबिंबित करता जीन किया जाता है, और CF फेफड़े के ऊतकों में वायरस के बैक्टीरियल विषैलापन 20। इसके बाद metagenomic पढ़ाई संरचनात्मक क्षेत्रों में 22 के बीच वायरल समुदायों के अलग स्थानिक विविधता का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, सीएफ फेफड़े के ऊतकों किसी भी पारिस्थितिकी तंत्र के 22 में तारीख करने के लिए मनाया सबसे कम वायरल विविधता harbored। पहचाना अधिकांश वायरस फगेस थेक्षमता के साथ सीएफ रोगज़नक़ों को संक्रमित करने के लिए। हालांकि, इस तरह herpesviruses, एडिनोवायरस, और मानव पैपिलोमा वायरस (एचपीवी) के रूप में यूकेरियोटिक वायरस भी पता चला रहे थे। फेफड़े के ऊतकों में अल्सर विच्छेदन के दौरान मनाया गया, जहां एक घटना में, एक मानव पेपिलोमा वायरस जीनोम के 99% से अधिक मरीज को एक फेफड़े पेपिलोमा या कार्सिनोमा निदान के साथ कभी नहीं किया गया था, भले ही बरामद किया गया था। इस वायरल विविधता मौजूद ऊतकों को नुकसान की गंभीरता को दर्शाता है, लेकिन यह भी बेनकाब और एक अंतर्निहित uncharacterized रोग समझा जा सकता है कि न केवल इंगित करता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल मोटी बलगम, मेजबान और माइक्रोबियल कोशिकाओं, मुक्त डीएनए, साथ ही सेल मलबे की बड़ी मात्रा से मिलकर बनता है कि नमूनों से वायरल की तरह कणों (VLPs) को अलग करने के लिए एक सरल, अभी तक शक्तिशाली तरीका प्रदान करते हैं।

Metagenomics पूरक, metatranscriptomics माइक्रोबियल समुदाय और मेजबान 9,23 भर में जीन अभिव्यक्ति में गतिशीलता पर नजर रखने के लिए किया जाता है। इस मामले में, दोनों माइक्रोबियल और अस्पतालटी mRNA के अधिमान्यतया चुने जाने की जरूरत है। बैक्टीरियल mRNAs polyadenylated नहीं कर रहे हैं, एक oligo-डीटी आधारित mRNA के पुल से नीचे विधि का शोषण नहीं किया जा सकता। नमूने यूकेरियोटिक mRNA की बड़ी मात्रा में शामिल करने के लिए जाना जाता है अगर polyadenylation निर्भर आरएनए प्रवर्धन मेजबान जुड़े नमूनों में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। सीएफ थूक सहित कई पशु-जुड़े नमूने, RNases शामिल है कि उच्च सेलुलर मलबे की मात्रा और न्युक्लिअसिज़ के अलावा कोशिकाओं के एक उच्च घनत्व होते हैं। इसलिए, एक और चुनौती भरा काम metatranscriptome प्रसंस्करण के दौरान व्यापक आरएनए गिरावट को रोकने के लिए है। ज्यादातर मामलों में, सीएफ थूक से निकाले कुल शाही सेना निकाली गई शाही सेना के बहाव के अनुप्रयोगों और उपयोगिता सीमित, आंशिक रूप से अपमानित है। हाल के वर्षों में, rRNA कमी के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किया गया है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट में रूपांतरित किया। इन तरीकों की प्रभावकारिता हालांकि विशेष रूप से आंशिक रूप से अपमानित rRNA 9,24 के साथ काम करते हैं, तो सीमित है। यहां नियोजित तरीके की अनुमति देते हैंकुशल बहाव के कुल rRNA हटाने के लिए उपयुक्त आंशिक रूप से अपमानित कुल शाही सेना की बहाली के लिए एड। दो अलग-अलग किट की तुलना आंशिक रूप से अपमानित कुल शाही सेना से rRNA हटाने में दक्षता का प्रत्यक्ष तुलना लिम एट अल द्वारा सचित्र था। (2012) 9।

कुल मिलाकर, इस पांडुलिपि के लक्ष्य के लिए एक उदाहरण के रूप में प्रेरित थूक का नमूना का उपयोग करते हुए, एक भी पशु-जुड़े नमूना से, प्रोटोकॉल का एक पूरा सेट वायरल और माइक्रोबियल बन्दूक metagenomes उत्पन्न करने के लिए (चित्रा 1), और एक metatranscriptome प्रदान करना है। आण्विक प्रयोगशाला कार्यप्रवाह पार संदूषण को कम से कम करने के लिए अलग से पहले और बाद प्रवर्धन क्षेत्रों को शामिल करना चाहिए। विधियों ऐसे ऊतक 22, nasopharyngeal और मुखग्रसनीय swabs के 25, ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना (बाल) और मूंगा (अप्रकाशित डेटा) के रूप में अन्य प्रकार नमूना करने के लिए आसानी से निभा रहे हैं। प्रत्येक नमूना संग्रह पर तुरंत कार्रवाई की है, खासकर जब माइक्रोबियल metagenomics और मुलाकात की जानी चाहिएatranscriptomics पढ़ाई वांछित हैं। नमूने जमे हुए थे, तो यह संभावित सेल अखंडता को बाधित ठंड के रूप में माइक्रोबियल metagenomes के लिए बरकरार माइक्रोबियल कोशिकाओं के अलगाव की सीमा। हालांकि, ठंड metatranscriptomics और वायरल अलगाव, लेकिन फ्रीज पिघलना प्रक्रिया के माध्यम से प्रभावित किया जा सकता बरामद वायरल कणों की शाही सेना की गुणवत्ता और मात्रा को रोकता नहीं है। ऐसा लगता है कि प्रेरित थूक बाल भी आक्रामक हो सकता है के रूप में वयस्क सीएफ रोगियों और अन्य पुरानी फेफड़े के रोगों 26,27 के साथ जुड़े कई अध्ययनों में नमूने के प्राथमिक स्रोत के रूप में कार्य किया है नोट करना महत्वपूर्ण है। हमारे अध्ययन में, थूक के नमूने माउथवॉश और एक न्यूनतम करने के थूक के नमूने के भीतर मौखिक रोगाणुओं संदूषण रखने के लिए बाँझ खारा समाधान का उपयोग मौखिक गुहा के rinsing के बाद एक सावधान और लगातार नमूने विधि, यानी, के साथ एकत्र किए गए थे।

Protocol

नोट: प्रेरित थूक के नमूने कैलिफोर्निया, सैन डिएगो विश्वविद्यालय के अनुसंधान समन्वयक (UCSD द्वारा, कैलिफोर्निया संस्थागत समीक्षा बोर्ड के विश्वविद्यालय (HRPP 081,500) और सैन डिएगो स्टेट यूनिवर्सिटी संस्थागत समीक्षा बोर्ड (2121 SDSU आईआरबी #) के अनुसार एकत्र किए गए थे ) वयस्क सीएफ क्लिनिक।

1. नमूना संग्रह और पूर्व उपचार (संग्रह के बाद 30 मिनट के भीतर पूर्व इलाज के नमूने)

  1. पहले नमूने को संग्रह, लेबल चार 15 मिलीलीटर ट्यूब के रूप में है: (i) वायरल metagenome (ii) माइक्रोबियल metagenome (iii) metatranscriptome, और (iv) अतिरिक्त थूक। प्रत्येक नमूने के लिए दोहराएँ। Guanidine आइसोथियोसाइनेट आधारित शाही सेना lysis बफर (GITC-lysis बफर) के 6 मिलीलीटर द्वारा पीछा "Metatranscriptome" लेबल ट्यूब में 0.1 मिमी सिलिका मोती के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. नमूना संग्रह के दौरान मौखिक रोगाणुओं द्वारा संक्रमण कम करने के लिए एक मुँह कुल्ला के रूप में बाँझ खारा समाधान (60 मिलीग्राम) का उपयोग करें। के बाद एक 30 मिनट के समय अवधि में थूक के नमूने लेनेएक छिटकानेवाला के माध्यम से 7% अतिपरासारी खारा के 4 मिलीलीटर की साँस लेना। प्रक्रिया के नमूने तुरंत नीचे के रूप में वर्णित है।
  3. 8 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए नमूना पतला।
    1. पहले और नमूना संग्रह के बाद खाली थूक कप वजन द्वारा नमूना मात्रा का अनुमान है।
    2. नमूने की मात्रा कम से कम 8 मिलीग्राम है, तो कम से कम 8 मिलीलीटर की कुल नमूना मात्रा उत्पन्न करने के लिए 0.02 माइक्रोन फ़िल्टर 1x पीबीएस की उचित मात्रा में जोड़ने।
    3. नहीं दिखाई clumps के थूक के भीतर रहते हैं जब तक तुरंत एक 3 मिलीलीटर सिरिंज के साथ नमूना homogenize
    4. थूक के 2 मिलीलीटर आकर्षित और 1.4 कदम करने के लिए तुरंत आगे बढ़ना है, एक ही सिरिंज का उपयोग करना।
  4. थूक के नमूने से कुल शाही सेना के संरक्षण
    1. सिलिका माला और GITC-lysis बफर युक्त "metatranscriptome" ट्यूब में कदम 1.3.4 से 2 मिलीलीटर थूक का नमूना इंजेक्षन।
    2. ढक्कन बंद करें और रिसाव से बचने के लिए Parafilm के साथ सुरक्षित रूप से ट्यूब सील।
    3. 10 मील के लिए मध्यम गति से तुरंत थूक homogenizeएन। उपलब्ध vortexer पर निर्भर करता है, क्षैतिज ट्यूब जगह है और यदि आवश्यक हो तो टेप के साथ सुरक्षित है।
    4. यदि आवश्यक हो तो प्रयोगशाला के लिए एक आइस बॉक्स और परिवहन 4 डिग्री सेल्सियस पर या में ट्यूब रखें।
  5. एक ही सिरिंज, विभाज्य "वायरल metagenome" और "माइक्रोबियल metagenome" और "अतिरिक्त थूक" लेबल ट्यूब में थूक कप से शेष थूक हस्तांतरण लेबल किया ट्यूबों में थूक के 2 मिलीलीटर प्रत्येक का उपयोग करना।
  6. यदि आवश्यक हो तो प्रयोगशाला में 4 डिग्री सेल्सियस या आइस बॉक्स और परिवहन पर सभी ट्यूबों स्टोर।

2. जनरेटिंग वायरल Metagenome

  1. बफ़र और समाधान की तैयारी
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर अग्रिम और दुकान में 50 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) तैयार करें। यह दो सप्ताह के लिए स्थिर है।
    2. खारा मैग्नीशियम (एस) बफर (250 मिलीलीटर) तैयार: 1 एम NaCl, 10 मिमी MgSO 4, 50 मिमी Tris-एचसीएल; 7.4 पीएच को समायोजित करें। कमरे के तापमान पर बाँझ फ़िल्टर (0.02 माइक्रोन रोमकूप आकार) और दुकान। मैं Dornase यूनिट / मिलीग्राम सूखी वजन द्वारा परिभाषित गतिविधि के अनुसार lyophilized गोजातीय अग्न्याशय DNase से (आणविक ग्रेड पानी में) मैं 100 यू / μl एंजाइम DNase तैयार करें।
    3. मैं बफर 10x DNase (50 मिलीलीटर) तैयार: 100 मिमी 2 MgCl, 20 मिमी 2 CaCl; 6.5 पीएच को समायोजित करें। कमरे के तापमान पर बाँझ फ़िल्टर (0.02 माइक्रोन रोमकूप आकार) और दुकान।
    4. 4% paraformaldehyde के तैयार करें।
    5. 200x ते बफर तैयार: 2 एम Tris-एचसीएल (पीएच 8.5), 0.2 एम EDTA। कमरे के तापमान पर बाँझ फ़िल्टर (0.02 माइक्रोन रोमकूप आकार) और दुकान।
    6. आणविक ग्रेड पानी का उपयोग 10% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के 10 एमएल तैयार करें।
    7. आणविक ग्रेड पानी का उपयोग 50 मिलीलीटर CTAB / सोडियम क्लोराइड (10% CTAB। 700 मिमी NaCl) तैयार करें। CTAB रातोंरात भंग। अवक्षेप जारी रहती है तो 65 डिग्री सेल्सियस पर समाधान गर्मी। समाधान कमरे के तापमान में अत्यधिक चिपचिपा है।
      नोट: 0.02 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग buffers की निस्पंदन समाधान के भीतर वायरल की तरह कणों को हटाने की अनुमति देता है, लेकिन नहींमुक्त न्यूक्लिक एसिड संदूषण।
  2. नमूना पूर्व उपचार
    1. ताजा 6.5 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) की उचित मात्रा में तैयार करते हैं।
    2. 6 मिलीलीटर की कुल मात्रा उत्पन्न करने के लिए 0.02 माइक्रोन फ़िल्टर एसएम बफर जोड़कर homogenate पतला।
    3. नमूने के लिए 6.5 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) के बराबर मात्रा (6 मिलीग्राम) जोड़ने के लिए, बलगम विघटन करने में सहायता करने के लिए, भंवर सख्ती मिश्रण और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    4. भंवर 10 डिग्री सेल्सियस पर इलाज सख्ती नमूना और स्पिन, 15-20 मिनट के लिए 3056 XG।
    5. एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला लीजिए।
    6. दोहराएँ चरण 2.2.3 और अगले नमूना के लिए 2.2.5।
    7. स्थानांतरण और एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब में एक सिरिंज पर घुड़सवार एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के साथ सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर।
      नोट: फिल्टर मोज़री, सिरिंज से नमूने पुनः प्राप्त करने और निस्पंदन कदम न आना है।
    8. (देखें, 0.45 माइक्रोन फ़िल्टर नमूना के 100 μl subsample लो क्लोरोफॉर्म और DNase मैं उपचार के लिए प्रदर्शन एसईction के 2.3.12-2.3.15) और) epifluorescence माइक्रोस्कोपी (2A चित्रा के लिए नमूना ठीक करने के लिए 4% paraformaldehyde के बराबर मात्रा में जोड़ें।
    9. एक "पकड़ सभी" वायरल कणों संवर्धन दृष्टिकोण के लिए (चर्चा देखें), सीज़ियम क्लोराइड ढाल ultracentrifugation के आधार पर वायरल कणों चयन न आना 2.3.12 चरण पर जाएँ। हालांकि, इस क्लोरोफॉर्म प्रतिरोधी जीवाणु संक्रमण और वायरल lysate में मेजबान डीएनए के उच्च राशि में हो सकता है।
  3. वायरल कणों की तरह (VLPs) संवर्धन और शोधन
    1. वांछित घनत्व को गैर फ़िल्टर्ड एसएम बफर के साथ CSCL की उचित मात्रा में भंग करके व्यक्ति सीज़ियम क्लोराइड (CSCL) समाधान तैयार (1.7 ग्राम / मिलीलीटर 1.5 ग्राम / मिलीलीटर, 1.35 ग्राम / मिलीलीटर, और 1.2 ग्राम / मिलीलीटर)। का उपयोग करने से पहले एक 0.02 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से प्रत्येक समाधान फ़िल्टर।
    2. चित्रा 2B में दिखाया गया है CSCL ढाल सेट करें।
    3. लोड 1.7 के 1 मिलीलीटर ग्राम / मिलीलीटर प्रत्येक ट्यूब, भार 1.5 से 1 मिलीलीटर में ग्राम / मिलीलीटर प्रत्येक ट्यूब, लोड 1 मिलीलीटर की 1.35 छ मेंप्रत्येक ट्यूब में / एमएल, (वैकल्पिक) प्रत्येक ट्यूब में भार 1.2 ग्राम / मिलीलीटर, और अंत में संबंधित ट्यूब में 6-8 मिलीलीटर नमूना लोड। मार्क व्यक्तिगत परतों प्रत्येक अंश के स्थान को निरूपित करने के लिए।
    4. 1 मिलीग्राम के भीतर करने के लिए ट्यूबों में से प्रत्येक के विरोध जोड़ी संतुलन।
    5. ध्यान से स्पिन बाल्टी में प्रत्येक ट्यूब लोड। वे खाली हैं, भले ही सभी बाल्टी स्पिन। रोटर पर स्पिन बाल्टी लोड करें।
    6. 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 82,844 XG पर अपकेंद्रित्र।
    7. Centrifugation के बाद, ध्यान से घनत्व ढ़ाल बाधा पहुँचा के बिना धारक से ट्यूबों निकालें।
    8. एक 18 जी सुई के साथ एक 3 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, सिर्फ 1.5 ग्राम / मिलीलीटर घनत्व परत के नीचे (चित्रा 2, लाल तीर) ट्यूब पियर्स और सिरिंज में 1.5 ~ मिलीलीटर खींच।
    9. धीरे धीरे सुई को हटाने और ट्यूब में शेष अंश पंचर के माध्यम से एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब में ड्रिप करने की अनुमति देकर ऊपरी अंश लीजिए। "ऊपरी अंश बेकार" के रूप में इस लेबल।
    10. 1.5 ग्राम / मिलीलीटर fractio लीजिएएन के दो नए microfuge ट्यूबों में सामग्री बाहर खदेड़ना से सिरिंज से (VLPs युक्त)।
    11. सभी नमूनों के लिए दोहराएँ चरण 2.3.8-2.3.10।
    12. वायरल ध्यान में क्लोरोफॉर्म के 0.2 मात्रा में जोड़ें सख्ती से हिला, 5 मिनट के लिए अधिकतम गति पर 10 मिनट, स्पिन के लिए आरटी पर सेते हैं, और जलीय चरण इकट्ठा।
    13. क्लोरोफॉर्म इलाज वायरल ध्यान में 10x DNase बफर और DNase मैं (अंतिम एकाग्रता = 2.5 यू / μl) जोड़ें, और 1.5-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    14. 15 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर DNase गतिविधि निष्क्रिय।
    15. एक नया ट्यूब में chloroform- और DNase मैं इलाज वायरल अंश के 15 μl निकालें, और epifluorescence माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना ठीक करने के लिए 15 μl 4% paraformaldehyde जोड़ें।
  4. डीएनए निष्कर्षण
    1. एक साफ और autoclaved 50 मिलीलीटर ओक रिज उच्च गति अपकेंद्रित्र ट्यूब में प्रत्येक नमूने से पूल वायरल केंद्रित है।
    2. एस के प्रति मिलीलीटर, 10 μl 0.5 एम EDTA 0.1 मात्रा 200x ते बफर: निम्न जोड़ेंपर्याप्त, formamide की एक मात्रा, और 10 μl ग्लाइकोजन। अच्छी तरह मिक्स और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    3. नए संस्करणों का उपयोग करना, कमरे के तापमान 100% इथेनॉल के दो संस्करणों में जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और कम से कम 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    4. एक एस एस -34 रोटर का उपयोग कर 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 17,226 XG पर ट्यूब कताई द्वारा गोली डीएनए।
    5. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करके ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें। बर्फ ठंड 70% इथेनॉल के साथ दो बार गोली धो लें।
    6. जितना संभव हो उतना तरल निकालें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हवा शुष्क करने के लिए गोली अनुमति देते हैं।
    7. 1x ते बफर (8.0 पीएच) के 567 μl में डीएनए गोली Resuspend।
      नोट: कमरे के तापमान पर पूरी मेजबान के लिए कम से कम 15 मिनट की अनुमति दें। आगे की प्रक्रिया जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात resuspended डीएनए स्टोर।
    8. एक नया 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में resuspended डीएनए समाधान के पूरे 567 μl स्थानांतरण। 20 _ (पूर्व गर्म 10% एसडीएस के 30 μl और proteinase कश्मीर के 3 μl जोड़ें6; जी / एमएल), मिश्रण अच्छी तरह से और 56 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। 65 डिग्री सेल्सियस पर CTAB / NaCl पूर्व गर्म।
    9. 5 एम NaCl के 100 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। पूर्व गर्म CTAB / NaCl समाधान, भंवर के 80 μl जोड़ें, और 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    10. 5 मिनट के लिए 16,100 XG पर क्लोरोफॉर्म, मिश्रण करने के भंवर, और स्पिन के बराबर मात्रा में जोड़ें।
    11. एक नया 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। 5 मिनट के लिए 16,100 XG पर फिनोल / क्लोरोफॉर्म, मिश्रण करने के भंवर, और स्पिन के एक बराबर मात्रा में शामिल करें।
    12. एक नया 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। 5 मिनट के लिए 16,100 XG पर क्लोरोफॉर्म, मिश्रण करने के भंवर, और स्पिन के एक बराबर मात्रा में शामिल करें।
    13. एक नया 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। सतह पर तैरनेवाला अंश को isopropanol के बराबर मात्रा में जोड़ें मिश्रण है, और कम से कम 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    14. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 16,100 XG पर डीएनए, स्पिन गोली। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला बंद पिपेट और बर्फ ठंड 70% इथेनॉल के साथ दो बार गोली धोने। एक छोटी स्पिन प्रदर्शन और ट्यूब से शेष इथेनॉल को हटा दें। एयर 15 मिनट के लिए गोली सूखी।
    15. क्षालन बफर (5 मिमी Tris, पीएच 8.5) के 50 μl के साथ डीएनए गोली Resuspend। गोली कमरे के तापमान में कम से कम 5 मिनट के लिए rehydrate करने की अनुमति दें।
    16. एक उच्च संवेदनशीलता प्रतिदीप्ति आधारित परख का उपयोग डीएनए यों।
  5. Phi29 पोलीमरेज़ का उपयोग कर प्रवर्धन (वैकल्पिक)
    1. 80 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच 8.0), 20 मिमी 2 MgCl: 2x annealing के बफर तैयार करें।
    2. 5 यू / μl को Phi29 डीएनए पोलीमरेज़ पतला।
    3. 50 μl यादृच्छिक hexamer प्राइमर (100 माइक्रोन), 125 μl 2x annealing के बफर, और 25 μl पानी के शामिल पूर्व मिश्रण नमूना बफर,। -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य और दुकान।
    4. पूर्व मिश्रण प्रतिक्रिया 100 μl Phi29 10x बफर के शामिल बफर, 40 μl 10 मिमी dNTPs, और 560 μl पानी। -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य और दुकान।
    5. 4 μl नमूना बफर में 1 μl टेम्पलेट डीएनए जोड़ें।
    6. वें सेतेई 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण और बर्फ पर शांत।
    7. , 2.4.4 से मिश्रण में प्रतिक्रिया बफर के 14 μl जोड़ें ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण।
    8. , Phi29 डीएनए पोलीमरेज़ की एक μl जोड़ें और नीचे से ऊपर pipetting द्वारा मिश्रण है, और 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस के द्वारा पीछा किया 18 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    9. जीनोमिक डीएनए कॉलम या फिनोल / क्लोरोफॉर्म और इथेनॉल precipitations का उपयोग कर प्रतिक्रियाओं को साफ़ करें।
  6. Epifluorescence माइक्रोस्कोपी (हास एट अल को देखें। 2014 28 छानने का काम प्रणाली की स्थापना के लिए)
    नोट: न्यूक्लिक एसिड रंगों के साथ अलगाव और शुद्धि, epifluorescence माइक्रोस्कोपी के बाद नमूनों में वायरल कणों की उपस्थिति और शुद्धता (आंकड़े 2A और -2) को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। नमूने में नि: शुल्क डीएनए उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को जन्म दे सकते हैं। इसलिए, नमूना DNase micrographs के लिए निर्धारण और धुंधला करने से पहले मैं-व्यवहार किया जाना चाहिए।
    1. माउंट समाधान तैयार (0.1% एस्कॉर्बिक एसिड, 50% ग्लिसरॉल)। 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 4.9 मिलीलीटर के लिए 10% एस्कॉर्बिक एसिड के 100 μl जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से। मिश्रण करने के लिए 100% ग्लिसरॉल के 5 मिलीलीटर जोड़ें मिश्रण अच्छी तरह से और "माउंट" के रूप में ट्यूब लेबल।
    2. फ़िल्टर -20 डिग्री सेल्सियस पर एक 0.02 माइक्रोन एल्यूमिना मैट्रिक्स डिस्पोजेबल सिरिंज फिल्टर, microfuge ट्यूबों में विभाज्य, और दुकान का उपयोग कर माउंट।
    3. विभाज्य 100 एक नया microfuge ट्यूब में नमूने के μl और VLPs तय करने के लिए 4% paraformaldehyde के बराबर मात्रा में जोड़ें। कम से कम 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण सेते हैं।
    4. 0.02 माइक्रोन फ़िल्टर पानी के 800 μl जोड़कर एक मिलीलीटर मात्रा अप करें। ट्यूब में SYBR गोल्ड दाग की एक μl जोड़ें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    5. -9 और -10 साई (-62.1 और -68.9 kPa) के बीच वैक्यूम पंप पर बदल कर निस्पंदन प्रणाली स्थापित।
    6. पानी के साथ कुरसी धो लें और फिल्टर कुरसी में कुंडलाकार polypropylene के समर्थन की अंगूठी के साथ एक 0.02 माइक्रोन एल्यूमिना मैट्रिक्स फिल्टर जगह।
    7. एक क्लैंप के साथ फिल्टर और सुरक्षित के साथ फिल्टर पीठ के शीर्ष पर एक फिल्टर टॉवर रखें।
    8. नमूना के माध्यम से फिल्टर करने के लिए कुछ मिनट फिल्टर टावर में 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब से सामग्री पिपेट, और अनुमति देते हैं।
    9. एक सूक्ष्म स्लाइड में माउंट अभिकर्मक के लेबल और पिपेट 10 μl।
    10. फिल्टर टॉवर और दबाना निकालते समय पर निर्वात छोड़ दें।
    11. ध्यान से फिल्टर कुरसी से फिल्टर को हटाने और एक Kimwipe के साथ फिल्टर के नीचे दाग है, तो सूक्ष्म स्लाइड पर माउंट के शीर्ष पर सीधे फिल्टर जगह है।
    12. फिल्टर पर माउंट अभिकर्मक की एक और 10 μl पिपेट और फिल्टर पर एक coverslip जगह।

3. उत्पन्न माइक्रोबियल Metagenome

  1. Buffers और समाधान की तैयारी
    1. 1x DNase बफर के 50 मिलीलीटर की तैयारी: 50 मिमी एनएएसी, 10 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी 2 CaCl; 6.5 पीएच को समायोजित करें। बाँझ फ़िल्टर (0.22) और दुकानकमरे के तापमान पर।
    2. मैं Dornase यूनिट / मिलीग्राम सूखी वजन द्वारा परिभाषित गतिविधि के अनुसार lyophilized गोजातीय अग्न्याशय DNase से (आणविक ग्रेड पानी में) मैं 1000 यू / μl एंजाइम DNase तैयार करें।
    3. एसई बफर के 100 मिलीलीटर की तैयारी: 75 मिमी NaCl, 25 मिमी EDTA; 7.5 पीएच को समायोजित करें। कमरे के तापमान पर बाँझ फ़िल्टर (0.22) और दुकान।
  2. डीएनए निष्कर्षण के लिए नमूना पूर्व उपचार प्रायर
    1. 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर 1x पीबीएस के 5 संस्करणों जोड़कर homogenate पतला। उदाहरण के लिए, नमूना के 2 मिलीलीटर में 1x पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. 2% (वी / वी) अंतिम एकाग्रता β-mercaptoethanol जोड़ें। 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर (रासायनिक हुड में) मिश्रण रॉक।
    3. 10 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्पिन और 15 मिनट के लिए 3056 XG, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    4. आणविक ग्रेड पानी की 10 मिलीलीटर (या 0.22 फ़िल्टर्ड पानी) में गोली Resuspend, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    5. दोहराएँ एक बार 3.2.3 और 3.2.4 कदम।
    6. SPI10 डिग्री सेल्सियस पर एन और 15 मिनट के लिए 3056 XG, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    7. 5 एमएल 1x DNase बफर में गोली Resuspend और नमूना के एमएल प्रति 15 μl DNase मैं (1000 यू / μl) जोड़ें।
    8. 2 घंटे के लिए मिश्रण को दोहराया के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    9. 15 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर DNase गतिविधि निष्क्रिय।
    10. 10 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन और 15 मिनट के लिए 3056 XG, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 10 मिलीलीटर एसई बफर में गोली resuspend।
    11. दोहराएँ चरण 3.2.10।
    12. 10 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन और 15 मिनट के लिए 3056 XG, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    13. 2 मिलीलीटर एसई बफर में गोली Resuspend, और दो microfuge ट्यूबों के लिए स्थानांतरण।
    14. Microfuge ट्यूबों में गोली कोशिकाओं। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 16,100 XG पर ट्यूब स्पिन।
    15. सतह पर तैरनेवाला निकालें और एक जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट, ग्राम पॉजिटिव बदलाव के प्रोटोकॉल का उपयोग pelleted कोशिकाओं से डीएनए निकाल सकते हैं।

4. उत्पन्न Metatranscriptome

  1. नमूना प्री-चिकित्सा
    1. तुरंत नमूना संग्रह और homogenization के बाद GITC-lysis बफर में मनका पिटाई से कोशिकाओं के यांत्रिक सेल प्रदर्शन करते हैं। कदम 1.4 देखें।
    2. सिलिका मोती गोली 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण और 600 XG स्पिन।
    3. एक नया ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
    4. कमरे में 10 मिनट के लिए तापमान, और स्पिन 4 डिग्री सेल्सियस पर और 15 मिनट के लिए 3056 XG पर सेते हैं, का इस्तेमाल किया GITC-lysis बफर के हर 750 μl के लिए क्लोरोफॉर्म के 200 μl जोड़ें 15 सेकंड के लिए हाथ से सख्ती से हिला। इस 15 मिनट के स्पिन के दौरान, 4.2 कदम के लिए तैयार करते हैं।
    5. 15 मिनट के स्पिन (जलीय चरण-interphase-जैविक चरण रूपों की एक स्पष्ट विभाजन) के बाद, नए RNase मुक्त ट्यूब (ओं) में (interphase में बाधा पहुँचा के बिना) जलीय चरण निकाल सकते हैं।
      नोट: जलीय चरण शाही सेना में शामिल है। अगले कदम के लिए जब तक बर्फ पर ट्यूबों रखें।
  2. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्तंभ आधारित शाही सेना शुद्धि किट या conve का उपयोग कर कुल शाही सेना निकासी और शुद्धि सम्पन्नntional isopropanol आधारित शाही सेना वर्षा।
    1. सिलिका कॉलम आधारित शाही सेना शुद्धीकरण
      1. प्राप्त जलीय अंश की कुल मात्रा को मापने।
      2. नमूना और मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए शाही सेना बाध्यकारी बफर का उचित मात्रा में जोड़ें।
      3. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार बाध्यकारी शर्त उचित मिश्रण को समायोजित करें। अच्छी तरह मिक्स और एक छोटी स्पिन करते हैं।
      4. आरएनए स्तंभ में मिश्रण लोड करें। एक बड़ी मात्रा में नमूने के लिए, कई लोड हो रहा उपयोग और 4x करने के लिए प्रत्येक स्तंभ लोड। अन्यथा, प्रत्येक नमूने के लिए एकाधिक स्तंभों का उपयोग पर विचार करें।
      5. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार उचित स्तंभ धो लें।
      6. RNase मुक्त पानी के कम से कम 30 μl के साथ शाही सेना elute। डबल-क्षालन थोड़ा शाही सेना की उपज में वृद्धि होगी। हालांकि, इस शाही सेना एकाग्रता कमजोर होगी।
      7. शाही सेना एकाग्रता उपाय और DNase मैं उपचार के लिए सीधे आगे बढ़ना। शाही सेना की गुणवत्ता की जांच करने के लिए Bioanalyzer उपयोग करें (अनुशंसित)।
      8. शाही सेना वर्षा
        1. Isopropanol के एक बराबर मात्रा में जोड़ें (जैसे, जलीय अंश के 500 μl में isopropanol के 500 μl) और नमूना करने के लिए 10 माइक्रोग्राम प्रति / μl RNase मुक्त ग्लाइकोजन के 2 μl।
        2. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण सेते हैं।
        3. 12,000 XG पर स्पिन और 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
        4. ध्यान से, सतह पर तैरनेवाला हटाने RNase मुक्त 75% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें। गोली बरकरार है सुनिश्चित करने के लिए 7500 XG और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण स्पिन।
        5. ध्यान से इथेनॉल को हटा दें।
        6. दोहराएँ एक बार 4.2.2.4 और 4.2.2.5 कदम।
        7. एयर 10 मिनट के लिए गोली सूखी।
        8. RNase मुक्त पानी के 50 μl में गोली rehydrate, 5 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और DNase उपचार के लिए सीधे आगे बढ़ना। शाही सेना की गुणवत्ता की जांच करने के लिए Bioanalyzer उपयोग करें (अनुशंसित)।
        9. -20 डिग्री सेल्सियस, या लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में स्टोर आरएनए।

Representative Results

वायरल Metagenomes

सीएफ थूक असाधारण चिपचिपा है और mucin और मुक्त डीएनए (2A चित्रा) के एक उच्च मात्रा में होता है; घनत्व ढाल ultracentrifugation मेजबान व्युत्पन्न डीएनए (चित्रा 2 बी) के उन्मूलन की सुविधा। प्रस्तुत कार्यप्रवाह से उत्पन्न आठ viromes दिखा नौ पिछले एक अध्ययन के परिणामों से यहाँ (तालिका 1) संक्षेप हैं। सात नमूने (CF1-डी, CF1-ई, CF1-एफ, CF4-बी, CF4-सी, CF5-ए, और CF5-बी, 1 टेबल) 2. उत्पन्न viromes थोड़ा निहित खंड में वर्णित के रूप में (0.02 प्रोसेस किया गया % -3.7%) केवल एक अपवाद (70%) के साथ मानव व्युत्पन्न दृश्यों। CF4-ए घनत्व ढाल ultracentrifugation कदम (CF4-ए) और> 97% मानव व्युत्पन्न दृश्यों (1 टेबल)। चित्रा 2 निहित इस विशिष्ट नमूना से उत्पन्न virome से छोड़ा गया था एक ठेठ की epifluorescence माइक्रोस्कोपी छवि का एक उदाहरण से पता चलता है सीएफ sputuएम नमूना (2A चित्रा) से पहले और (चित्रा -2) घनत्व ढाल ultracentrifugation के बाद। साफ़ वायरल की तरह कणों (VLPs) घनत्व ढाल जुदाई निम्नलिखित बड़े कण बिना micrographs में मनाया गया। VLPs डीएनए निष्कर्षण के बाद, जीवाणु संक्रमण अक्सर VLPs डीएनए के अनुक्रमण के लिए पहले 16S rDNA प्रवर्धन का उपयोग कर परीक्षण किया है।

माइक्रोबियल Metagenomes

यहाँ प्रस्तुत सात थूक के नमूने लगातार सात दिनों के पार एक एकल सीएफ रोगी से एकत्र किए गए थे। थूक एकत्र किया गया था के बाद रोगी को 3 दिन मौखिक एंटीबायोटिक (सिप्रोफ्लोक्सासिं और डॉक्सीसाइक्लिन) पर शुरू कर दिया। इस मरीज से एकत्र प्रत्येक थूक नमूने की मात्रा 7 दिन भर में 15 मिलीलीटर था; इसलिए, पीबीएस नमूना को नहीं जोड़ा गया है। इस नमूने घटना के लक्ष्य माइक्रोबियल समुदाय संरचना की दैनिक उतार-चढ़ाव का मूल्यांकन (i) के द्वारा इस कार्यप्रवाह में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था, और (ii) की तुलनाmetagenomics और 16S rDNA अनुक्रमण के बीच माइक्रोबियल समुदाय संरचना और संकल्प। इसलिए, कुल डीएनए और एच एल-डीएनए प्रत्येक नमूने से निकाले गए थे।

डीएनए निष्कर्षण निम्नलिखित प्रत्येक थूक का नमूना एच एल-डीएनए एकाग्रता तालिका 2 में प्रस्तुत किया है। एच एल-डीएनए की कुल उपज> 5 माइक्रोग्राम प्रति के लिए एनजी 210 से लेकर। Illumina अनुक्रमण पुस्तकालयों 1 की कुल प्रारंभिक सामग्री प्रत्येक नमूने (चित्रा 3) के लिए एनजी के साथ उत्पन्न किया गया। metagenomics डेटा की विशेषताओं तालिका 2। सभी में प्रस्तुत कर रहे हैं, लेकिन एक पुस्तकालय 1 लाख से अधिक दृश्यों और 85% से अधिक उच्च गुणवत्ता वाले दृश्यों PRINSEQ 29 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा preprocessing पर बनाए रखा गया झुकेंगे। सभी डेटासेट पहले आगे स्क्रीनिंग और DeconSeq 30 का उपयोग करते हुए मानव व्युत्पन्न दृश्यों को हटाने के बाद डुप्लिकेट और कम गुणवत्ता (25 के न्यूनतम गुणवत्ता स्कोर) के दृश्यों, को दूर करने के preprocessed थे। मानव-डे की राशिrived अनुक्रम संदूषण नमूना संपत्तियों पर अत्यधिक निर्भर है। इधर, मानव व्युत्पन्न दृश्यों की कुल राशि 14-46% (तालिका 2) से लेकर। preprocessed दृश्यों तो Metaphlan 31 पाइप लाइन के रूप में अच्छी तरह से एमजी-RAST 32 सर्वर का उपयोग एनोटेट कर रहे थे।

Metagenomes के अलावा, 16S rDNA amplicon के पुस्तकालयों -16 rRNA जीन 33,34 में V1-V2 के चर क्षेत्र के लगभग 300 बीपी को लक्षित प्राइमरों के माध्यम से कुल डीएनए और एच एल-डीएनए दोनों से उत्पन्न किया गया। व्यक्ति के नमूनों से पीसीआर उत्पादों सामान्यीकृत थे और MiSeq मंच पर प्रदर्शन Illumina 500-चक्र बनती अंत अनुक्रमण का उपयोग कर अनुक्रमण के लिए जमा। बनती अंत -16 rDNA amplicon के दृश्यों एक अजगर स्क्रिप्ट का उपयोग कर बारकोड के माध्यम से नमूना द्वारा हल किया गया और बनती phrap 35,36 का उपयोग कर इकट्ठा कर रहे थे पढ़ता है। इकट्ठे अनुक्रम सिरों औसत गुणवत्ता स्कोर ≥20 एक 5 NT विंडो का उपयोग किया गया था, जब तक छंटनी किए गए थे। संभावित काइमेरा थेएन सिल्वा 38 संदर्भ दृश्यों की एक कल्पना से मुक्त सबसेट के खिलाफ Uchime 37 का उपयोग कर हटाया। उच्च गुणवत्ता सिल्वा 38 डेटाबेस से 418,497 बैक्टीरियल दृश्यों का उपयोग सिना 39 (संस्करण 1.2.11) के साथ पढ़ता को Taxanomy सौंपा गया था। समान वर्गीकरण कार्य के साथ दृश्यों आपरेशनल वर्गीकरण इकाइयों (OTUs) का उत्पादन करने के लिए क्लस्टर थे। यह प्रक्रिया 16 नमूने (:;: 72,603; अधिकतम: 127,113 मिनट 103,455 दृश्यों / नमूना औसत आकार) के लिए 1,655,278 दृश्यों उत्पन्न। मंझला गुड्स कवरेज स्कोर, अनुक्रमण की पूर्णता का एक उपाय, ≥ 99.9% थी। सॉफ्टवेयर पैकेज Explicet 40 (v2.9.4, www.explicet.org) विश्लेषण और आंकड़ा पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया गया था। अल्फा-विविधता (इंट्रा-नमूना) और बीटा-विविधता (अंतर नमूना) 100 बूटस्ट्रैप फिर से samplings के साथ 72,603 ​​दृश्यों की विरल करना बिंदु पर Explicet में गणना की गई।

इस अध्ययन के द्वारा लक्षित पहला सवाल hypotonic सेल preferenti था कि क्या(यानी, अधिमान्यतया बरकरार रखती है या lyses) रोगाणुओं की विशेष समूहों के लिए सहयोगी का चयन करता है। पहले hypotonic सेल के बाद, फिर से निलंबित कर दिया pelleted कोशिकाओं दूसरा hypotonic सेल (CF1-1and CF1-2) के बाद एक ही नमूनों के साथ तुलना करने के लिए पहले दो नमूने (CF1-1A * और CF1-2A *) से subsampled थे। सभी नमूनों के डीएनए निष्कर्षण और अनुक्रमण पाइप लाइन के द्वारा पीछा किया, उतना ही है, यानी, मैं पहले डीएनए निष्कर्षण के लिए DNase के साथ इलाज इलाज किया गया। चित्रा 4 में दिखाया गया है, subsamples की माइक्रोबियल प्रोफाइल के दो hypotonic सेल उपचार के बाद नमूनों को अत्यधिक समान हैं। इसके अलावा, दूसरी hypotonic सेल metagenomes (तालिका 2) के भीतर 6-17% द्वारा गैर मानव दृश्यों के अंश बढ़ जाती है।

Metagenomic- और 16S rDNA आधारित रूपरेखा के बीच माइक्रोबियल संरचना में मतभेद के लिए परीक्षण, और पहले हमारे संवर्धन के बीच देखा मतभेदों की व्याख्या हो सकती है कि पहले और hypotonic सेल के बाद बदलाव के लिए करने के लिएएँ और दूसरों को, बैक्टीरियल 16S rDNA अनुक्रमण पुस्तकालयों कुल डीएनए और एच एल व्युत्पन्न डीएनए (4B चित्रा) दोनों से उत्पन्न किया गया। जीनस स्तर पर, ऐसे स्यूडोमोनास, Stenotrophomonas, Prevotella, Veillonella, और स्ट्रेप्टोकोकस के रूप में आम CF-जुड़े बैक्टीरिया का वर्गीकरण प्रोफाइल के एच एल व्युत्पन्न डीएनए से उत्पन्न -16 rDNA पुस्तकालयों और metagenomes के बीच अत्यधिक समान थे। हालांकि, 16S rDNA पुस्तकालयों में Rothia पता लगाने metagenomic पुस्तकालयों के साथ के रूप में के रूप में प्रचुर मात्रा में नहीं था। कुल डीएनए और एच एल व्युत्पन्न डीएनए से उत्पन्न -16 rDNA वर्गीकरण प्रोफाइलों की तुलना, स्यूडोमोनास विभिन्न 3 दिन से एच एल व्युत्पन्न डीएनए शुरू की तुलना में कुल डीएनए में प्रतिनिधित्व किया था।

Metatranscriptomes

आमतौर पर, सीएफ थूक से निकाले कुल शाही सेना आंशिक रूप से अपमानित है और आकार 25-4,000 बीपीएस (आंकड़े 5A से पर्वतमाला और एट अल। 2012 9 में प्रकाशित हुआ था। गैर समाप्त हो metatranscriptomes भीतर rRNA के अंश का 27-83% से पर्वतमाला, और rRNA के रिश्तेदार बहुतायत नमूने भर में विविध (3 टेबल;। लिम एट अल 9 से निकाले डेटा)। हालांकि, Ribo-जीरो किट के साथ कमी नमूना CF1-एफ के अपवाद के साथ 1-5% के लिए rRNA के rRNAs रिश्तेदार बहुतायत कमी हुई। rRNA हटाने की प्रभावशीलता में भिन्नता जांच संकरण 9 के लिए rRNAs के निकाले शाही सेना की गुणवत्ता, या मतभेद माइक्रोबियल समुदाय वर्तमान में है और इसलिए एक्सेसिबिलिटी प्रतिबिंबित सकता है। Ribo-जीरो rRNA हटाने किट का उपयोग कर एक सफल (चित्रा 5 ब) और असफल (चित्रा 5D) rRNA हटाने की प्रक्रिया के electropherograms जिस पर rRNA चोटियों असफल हटाने में दिखाई दे रहे हैं, भिन्न होते हैं।

सीडीएनए का आकार सीमा जीई पुस्तकालयोंnerated अक्सर शुरू कर शाही सेना के नमूने का आकार सीमा को दर्शाता है। यहाँ प्रस्तुत सीडीएनए पुस्तकालयों रॉश-454 अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी 9 द्वारा पीछा rRNA कमी पर एक पूरे transcriptome प्रवर्धन किट (WTA2) के साथ उत्पन्न किया गया। सीडीएनए (लिम एट अल। 2012) 50-4,000 बीपीएस (आंकड़े 5E और 5F) से लेकर टुकड़े होते हैं और उत्पन्न नमूने भर में अत्यधिक संगत है 9। अन्य मंच विशेष आरएनए Seq पुस्तकालय तैयारी किट की उपलब्धता वर्तमान में एक इष्टतम स्थितियों में सीडीएनए संश्लेषण और अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी गठबंधन करने के लिए और अधिक विकल्प विकल्प प्रदान करते हैं। तिथि करने के लिए एक सिफारिश विकल्प ऊपर की सिफारिश rRNA हटाने अभिकर्मकों और आरएनए Seq पुस्तकालय तैयारी किट संयोजन ScriptSeq पूरा गोल्ड किट है।

चित्रा 1
चित्रा 1: प्रस्तुत करने के लिए कार्यप्रवाहvirome, microbiome, और metatranscriptome अनुक्रमण के लिए इस तरह के थूक का नमूना के रूप में मेजबान जुड़े नमूने, के aration।

चित्रा 2
चित्रा 2: सीज़ियम क्लोराइड घनत्व ढ़ाल ultracentrifugation कोशिकी डीएनए और बड़े कण (ए) के उन्मूलन की सुविधा है, और CF थूक से वायरल की तरह कणों का इष्टतम अलगाव के लिए अनुमति देते हैं। प्रत्येक ढाल से एक मिली लीटर पूर्व इलाज नमूना (बी) लोड करने के लिए एक-दूसरे से पहले के शीर्ष पर स्तरित है। निम्नलिखित कणों अलगाव और शुद्धि, ऐसे SYBR गोल्ड के रूप में न्यूक्लिक एसिड रंगों के साथ epifluorescence माइक्रोस्कोपी नमूनों में वायरल कणों की उपस्थिति और शुद्धता को सत्यापित करने के लिए किया जाता है। साफ़ वायरल कणों की तरह (सी; सफेद तीर) सीएफ थूक का नमूना घनत्व ढाल जुदाई निम्नलिखित मनाया गया।


चित्रा 3:। किसी भी विचलन के बिना निर्माता प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में सीएफ थूक microbiomes में हुई है कि एच एल-डीएनए के एक एनजी से उत्पन्न Nextera एक्सटी पुस्तकालयों के आकार के वितरण का उदाहरण पूलिंग लाइब्रेरी सामान्य बनाने, और लदान राशि से किया गया था।

चित्रा 4
चित्रा 4: एक सीएफ रोगी से अनुलंबीय एकत्र नौ नमूनों में सूक्ष्म समुदायों के वर्गीकरण विश्लेषण hypotonic सेल पद्धति के आधार पर डीएनए से उत्पन्न metagenomic पुस्तकालयों के आधार पर (ए) माइक्रोबियल प्रोफाइल।। प्रजातियों असाइनमेंट कम गुणवत्ता और मानव अनुक्रम अनुरूपता साथ डुप्लिकेट और दृश्यों को हटाने कि Metaphlan पाइपलाइन निम्न डेटा preprocessing पर आधारित था। कि दो-ST दिखाने के लिएhypotonic सेल को प्राथमिकता नहीं किया था पहला hypotonic सेल शामिल थे के बाद रोगाणुओं, subsamples (*) की विशेष समूहों के लिए चुनता है EPS। (बी) माइक्रोबियल प्रोफाइल के कुल डीएनए (टी) और hypotonic सेल विधि से -16 rRNA जीन अनुक्रमण के V1V2 क्षेत्र के आधार पर -में स्थित डीएनए (एच)। इन आंकड़ों से पहले प्रकाशित नहीं किया गया है।

चित्रा 5
चित्रा 5: शाही सेना (ई) और सीडीएनए (एफई) की है Agilent 2100 Bioanalyzer electropherograms के उदाहरण क्रमशः आरएनए पिको और उच्च संवेदनशीलता dsDNA चिप्स का उपयोग कर, metatranscriptomic पुस्तकालयों के लिए उत्पन्न। (ए) और (सी) rRNA हटाने की प्रक्रिया से पहले electropherograms के उदाहरण दिखाते हैं। कुल rRNA हटाने किट का उपयोग कर एक सफल (बी) के electropherograms और असफल (डी) rRNA हटाने की प्रक्रिया, एक थोड़ा भिन्न होते हैंचोटियों rRNA जो टी असफल हटाने में दिखाई दे रहे हैं। सीडीएनए के आकार रेंज (एफई) पूरे transcriptome प्रवर्धन किट (सिग्मा Aldrich) शुरू करने rRNA समाप्त शाही सेना के आकार की सीमा के समान है, और दो ​​अलग अलग नमूने भर में अत्यधिक संगत है, का उपयोग कर उत्पन्न। एक देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का बड़ा संस्करण।

CF1-डी CF1-ई CF1-एफ CF4-ए CF4-बी CF4-सी CF5-ए CF5-बी
की कुल संख्या में पुस्तकें 224,859 87,891 106,189 93,301 140,020 1558 272,552 217,438
Preprocessed पढ़ता एक 109,389 73,624 67,070 82,011 68,617 1137 215,808 158,432
49% 84% 63% 88% 49% 73% 79% 73%
ठिकानों की संख्या 47,239,573 33,351,525 28,922,479 27,667,695 29,386,841 243,986 95,205,805 69,581,811
पढ़ें लंबाई मीन 432 453 431 337 428 215 441 439
होस्ट दृश्यों बी 240 526 28 79,774 13 797 585 5859
0.21% 0.71% 0.04% 97.27% 0.02% 70.10% 0.27% 3.70%
वायरल हिट ग 7214 23,550 4070 737 4642 22 6466 5981
6.59% 31.99% 6.07% 0.90% 6.77% 1.93% 3.00% 3.78%
अनअसाइन्ड डी पुस्तकें 103,888 60,490 32,780 1935 68,440 311 105,612 119,551
94.97% 82.16% 48.87% 2.36% 99.74% 27.35% 48.94% 75.46%
एक डेटा पूर्व-प्रक्रिया के बाद पुस्तकेंPRINSEQ 29 से ssing।
बी मानव DeconSeq 30 से पहचान प्लस जाति कोर्डेटा के लिए एक सबसे अच्छा BLASTn हिट (एन सी बी आई न्यूक्लियोटाइड डेटाबेस) के साथ पढ़ता पढ़ता है।
सी tBLASTx घर में वायरल जीनोम डाटाबेस के खिलाफ हिट। प्रतिशत पढ़ता preprocessed की कुल संख्या का उपयोग कर की गणना की गई।
डी एन सी बी आई न्यूक्लियोटाइड डेटाबेस के खिलाफ मारा कोई BLASTn साथ पढ़ता है। प्रतिशत पढ़ता preprocessed की कुल संख्या का उपयोग कर की गणना की गई। एन सी बी आई न्यूक्लियोटाइड डेटाबेस के खिलाफ मारा कोई BLASTn tBLASTx विश्लेषण में प्रोटीन के स्तर पर वायरल के रूप में पहचान की गई है के साथ कुछ पढ़ता है।

तालिका 1:। प्रस्तुत कार्यप्रवाह का उपयोग कर थूक के नमूने से उत्पन्न आठ viromes के पुस्तकालय विशेषताओं यह तालिका लिम <से निकाला जाता हैउन्हें> एट अल। (2012) 9। थोड़ा (0.02% निहित है कि viromes धारा 2 में वर्णित है और उत्पन्न के रूप में सात नमूने (CF1-डी, CF1-ई, CF1-एफ, CF4-बी, CF4-सी, CF5-ए, और CF5-बी) प्रोसेस किया गया - 3.7 %) एक अपवाद (70%) के साथ दृश्यों मानव व्युत्पन्न। CF4-ए> 97% मानव व्युत्पन्न दृश्यों कि निहित घनत्व ढाल ultracentrifugation कदम (CF4-ए) और उत्पन्न virome से छोड़ा गया था।

नमूना कंसंट्रेशन कुल उपज कुल सं पुस्तकें कुल सं पुस्तकें (प्रसंस्कृत ख) गैर-मानव दृश्यों
(एनजी / μl) (एनजी) (रॉ एक) (%)
CF1-1A * 2.3 1,098,454 937,688 691,541
74%
CF1-1 13 1300 2,212,756 1,958,910 1,574,520
80%
CF1-2A * 2.1 210 672,878 588,106 407,530
69%
CF1-2 5.2 520 1,944,012 1,697,010 1,455,174
86%
CF1-3 28.8 2880 1,048,304 896,756 560,852
63%
CF1-4 24.1 2410 1,154,922 984,702 621,098
63%
CF1-5 33.6 3360 1,029,622 888,630 481,548
54%
CF1-6 43.2 4320 1,434,016 1,256,504 725,858
58%
CF1-7 57.8 5780 1,000,174 872,036 565,376
65%
* नमूना के 1 मिलीलीटर CF1 से subsampled किया गया था दूसरा hypotonic सेल प्रक्रिया से पहले पहले hypotonic सेल कदम (चरण 3.1.5) निम्न -1 और CF1-2। किसी भी संशोधन के बिना शेष प्रोटोकॉल के माध्यम से 3.1.7 में वर्णित है और आगे बढ़ने के रूप में कोशिकाओं नीचे काता थे।
एक Unprocessed Illumina एक 2 x 300 बीपी MiSeq अनुक्रमण रन से पढ़ता है।
बी, मूल्यांकन कर छंटनी की है, और चर्चा में वर्णित के रूप में गुणवत्ता और लंबाई के आधार पर हटा दिया गया पढ़ता है।

तालिका 2:। प्रस्तुत कार्यप्रवाह का उपयोग कर थूक के नमूने से उत्पन्न microbiomes के लक्षण 100 μl क्षालन बफर (5 मिमी Tris / एचसीएल, पीएच 8.5) और अनुक्रम डेटा की विशेषताओं में प्रत्येक नमूने के डीएनए एकाग्रता प्रस्तुत कर रहे हैं। एक एनजी की कुल Nextera एक्सटी पुस्तकालय तैयारी किट का उपयोग व्यक्तिगत पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

0 "के लिए: रख-together.within पृष्ठ =" हमेशा "> नमूना CF1-डी CF1-एफ CF4-बी CF4-सी इलाज कोई नहीं Ribo-जीरो कोई नहीं Ribo-जीरो कोई नहीं Ribo-जीरो कोई नहीं Ribo-जीरो Preprocessed पढ़ता 2088 1991 40,876 25,238 19,728 32,737 31,791 36,172 पढ़ें लंबाई मीन 275 245 262 270 233 259 240 267 कुल rRNA पढ़ता 1737 91 29,499 17,267 5285 291 16,371 1761 83.20% 4.60% 72.20% 68.40% 26.80% 0.90% 51.50% 4.90% माइक्रोबियल rRNA 1414 32 19,978 12,035 23 227 6916 1076 67.70% 1.60% 48.90% 47.70% 0.10% 0.70% 21.80% 3.00% Eukaryota rRNA 323 59 9520 5232 5262 64 9455 683 15.50% 3.00% 23.30% 20.70% 26.70% 0.20% 29.70% 1.90% % RRNA हटाया * 0% 95% 0% 5% 0% 97% 0% 91% गैर-rRNA पढ़ता 351 (16.8%) 1900 (95.4%) 11,377 (27.8%) 7971 (31.6%) 14,443 (73.2%) 32,446 (99.1%) 15,420 (48.5%) 34,411 (95.1%) कुल एन.आर. हिट 102 (4.9%) 691 (34.7%) 3327 (8.1%) 2857 (11.3%) 4938 (25.0%) 10,751 (32.8%) 5905 (18.6%) 15,766 (43.6%) यूकेरियोटिक 74 407 2790 2524 4614 10,227 4553 8274 बैक्टीरियल 26 283 520 312 287 471 1326 7442 अनअसाइन्ड पढ़ता 249 (11.9%) 1209 (60.7%) 8050 (19.7%) 5114 (20.3%) 9505 (48.2%) 21,695 (66.3%) 9515 (29.9%) 18,645 (51.5%) * RRNA की राशि गैर समाप्त हो विभाज्य में मौजूद राशि का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त हटा दिया।

तालिका 3:। के साथ और rRNA कमी के बिना metatranscriptomes के पुस्तकालय विशेषताओं डेटा लिम एट अल से निकाला जाता है (2012) 9, अतिरिक्त अन्य rRNA हटाने किट की तुलना और पूर्व अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी के लिए सीडीएनए nebulization के का असर है जो।।

Discussion

वायरल metagenomics

वायरल कणों पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) वर्षा या छोटी मात्रा संकेंद्रक का उपयोग कर केंद्रित कर रहे हैं। कुछ मामलों में, एकाग्रता की जरूरत नहीं किया जा सकता है, लेकिन पूर्व छानने का काम या कम गति centrifugation कदम यूकेरियोटिक और माइक्रोबियल कोशिकाओं को हटाने के लिए किया जाता है। वायरल lysates आगे समृद्ध और घनत्व ढाल ultracentrifugation 9,41 या छोटे आकार फिल्टर (जैसे, 0.45 माइक्रोन) यूकेरियोटिक और बड़े माइक्रोबियल कोशिकाओं 25 हटाने के लिए। का उपयोग कर शुद्ध किया जाएगा घनत्व ढाल ultracentrifugation आम तौर पर इस तरह की अलग और वायरल कणों 41 ध्यान केंद्रित करने की सूक्रोज या सीज़ियम क्लोराइड के रूप में घने लेकिन अक्रिय समाधान के साथ किया जाता है। भौतिक जुदाई आकार और वायरल कणों की प्रसन्नचित्त घनत्व पर आधारित है। इसलिए, फिल्टर छेद के आकार का उचित विकल्प और ढ़ाल के कठोर तैयारी के भौतिक वसूली की सफलता के रूप में, विशिष्ट वायरल समुदायों को अलग-थलग करने के लिए आवश्यक हैंVLPs 41 (निष्कर्षण घनत्व के भीतर फिल्टर या गिरने के माध्यम से पारित नहीं है कि यानी, वायरल कणों metagenome में पता नहीं होगा) पृथक समुदाय को निर्धारित करता है। वायरल अलगाव और एकाग्रता के बाद, मुक्त न्यूक्लिक एसिड और माइक्रोबियल और कोशिकाओं के रूप में दोनों नमूने में गैर वायरल जीनोमिक सामग्री मौजूद दूषित हो सकता है। इसलिए, यह नमूनों में वायरल कणों की पवित्रता (आंकड़े 1 ए और 1 बी) को सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक क्लोरोफॉर्म उपचार आमतौर पर पूर्व न्यूक्लिक एसिड निकासी के लिए स्वतंत्र न्यूक्लिक एसिड नीचा करने के लिए nuclease उपचार के बाद शेष कोशिकाओं, lyse करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

प्रस्तुत कार्यप्रवाह के लिए एक चेतावनी है कि यह CSCL ढाल दर्ज करने के लिए भी प्रसन्नचित्त हो सकता है कि छा वायरल कणों बाहर कर सकते हैं के रूप में वायरल कणों को अलग करने के घनत्व ढाल जुदाई का उपयोग किया गया था। एक वैकल्पिक "पकड़ सभी" विधि घनत्व ढाल separ न आना हैसमझना 0.45 माइक्रोन से समुदाय डीएनए अलग और - क्लोरोफॉर्म और DNase मैं इस दृष्टिकोण के साथ इलाज किया filtrates ऐसे swabs या रक्त प्लाज्मा से उन के रूप में छोटा सा नमूना संस्करणों को समायोजित करने के लिए भी उपयुक्त है। हालांकि, इस क्लोरोफॉर्म प्रतिरोधी जीवाणु संक्रमण और DNase मैं प्रतिरोधी कोशिकी डीएनए के उच्च राशि में हो सकता है।

उच्च डीएनए पैदावार अनुक्रमण विकल्प की एक व्यापक विकल्प प्रदान करते हैं जिससे वर्तमान अनुक्रमण प्रोटोकॉल एक एनजी अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी के लिए न्यूक्लिक एसिड की माइक्रोग्राम प्रति एक करने की आवश्यकता है। उत्पन्न viromes के डीएनए एकाग्रता अक्सर 200 से अधिक एनजी / μl के लिए सीमा का पता लगाने के नीचे से चलता है। बरामद वायरल न्यूक्लिक एसिड की मात्रा प्रत्यक्ष अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी के लिए अपर्याप्त हो सकती है। ऐसे मामलों में, न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन आवश्यक है। Linker प्रवर्धन बन्दूक पुस्तकालयों (LASLs) 2,42,43 और कई विस्थापन प्रवर्धन (एमडीए) के आधार पर पूरे जीनोम प्रवर्धन दो हैंविधियों सबसे सामान्यतः अनुक्रमण के लिए पर्याप्त डीएनए उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है। ऐसे Phi29 डीएनए पोलीमरेज़ के आधार पर उन के रूप में एमडीए के तरीकों प्रवर्धन पूर्वाग्रहों से ग्रस्त करने के लिए जाना जाता है, और अधिमान्यतया गैर मात्रात्मक वर्गीकरण और कार्यात्मक लक्षण वर्णन 44,45, जिसके परिणामस्वरूप ssDNA और परिपत्र डीएनए बढ़ाना हो सकता है। LASLs दृष्टिकोण के एक अनुकूलित संस्करण, केवल न्यूनतम पूर्वाग्रहों को पेश करने के लिए दिखाया (सामग्री शुरू की छोटी मात्रा के लिए) उच्च संवेदनशीलता को बढ़ावा देता है, और आसानी से अलग अनुक्रमण प्लेटफार्मों 43 के लिए अनुकूलित किया गया है। हालांकि, दृष्टिकोण, कई कदम है डीएनए नुकसान को कम करने के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, और dsDNA टेम्पलेट्स के लिए सीमित है। हमारी प्रयोगशाला में, इस दृष्टिकोण को सफलतापूर्वक ब्रोन्कोएल्वियोलर lavage-, coral- और समुद्र के पानी व्युत्पन्न VLPs (अप्रकाशित और हुर्वित्ज़ एट अल। 46) से निकाले डीएनए का पता लगाने योग्य और undetectable राशि बढ़ाना करने के लिए अनुकूलित किया गया है।

डेटा विश्लेषण पाइपलाइनों का विकास सीएलए हैssically कारण वायरल समुदायों के अत्यधिक विविध और बड़े पैमाने पर अज्ञात प्रकृति के वायरल metagenomics विश्लेषण के सबसे चुनौतीपूर्ण पहलुओं में से एक रहा। तारीख वर्तमान वायरल डेटाबेस के लिए जीवमंडल में एक अनुमान के अनुसार 10 8 वायरल जीनोटाइप, जबकि वहाँ इस अनुमानित कुल वायरल विविधता के बारे में 1/100000 है जो ~ 4000 वायरल जीनोम, होते हैं। इसलिए, वायरल metagenomes में वर्गीकरण और कार्यात्मक काम के लिए (जैसे कि बम विस्फोट 47) के रूप में समानता आधारित खोजों निहित चुनौतियों के पास है। कई दृश्यों डेटाबेस में जीनोम के लिए महत्वपूर्ण समानताएं हैं विफल करने के लिए, और इसलिए, अज्ञात के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। अनुरूपता आधारित खोजों वर्गीकरण बताए के लिए सबसे महत्वपूर्ण आवेदन कर रहे हैं और डेटा दृश्य के लिए कार्य करते हैं, भले ही डेटाबेस स्वतंत्र विश्लेषण के आधार पर वैकल्पिक तरीकों 48- 50 विकसित किया गया है। Fancello एट अल। 51 वीरा में इस्तेमाल किया कम्प्यूटेशनल उपकरण और एल्गोरिदम की एक पूरी समीक्षा प्रदानएल metagenomics।

माइक्रोबियल metagenomics

आमतौर पर, hypotonic सेल इलाज माइक्रोबियल समुदायों (एच एल-डीएनए) से निकाले डीएनए की कुल राशि 20 एनजी से 5 माइक्रोग्राम प्रति को लेकर। उपज रोगी के स्वास्थ्य की स्थिति और इस अध्ययन (तालिका 2) में निकाली एच एल-डीएनए की कुल पैदावार में देखा विविधताओं जो बताते एकत्र थूक का नमूना की राशि है, पर अत्यधिक निर्भर है। महत्वपूर्ण कदम। अच्छी गुणवत्ता के अनुक्रम डेटा उत्पन्न अनुक्रमण पुस्तकालयों की गुणवत्ता पर भरोसा उत्पन्न दो एक enzymatic आधारित डीएनए विखंडन प्रक्रिया का उपयोग कर सीएफ थूक व्युत्पन्न माइक्रोबियल डीएनए से उत्पन्न अनुक्रमण पुस्तकालयों के लिए एक विशिष्ट आकार सीमा से पता चलता है करने के लिए। इष्टतम पुस्तकालय आकार अनुक्रमण मंच और आवेदन की पसंद पर निर्भर है, और यदि आवश्यक हो तो इसलिए, विखंडन प्रक्रिया ऐसे sonication के और nebulization के रूप में वैकल्पिक तरीकों के माध्यम से, अनुकूलित किया जा सकता है। निम्न के अलावाप्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम, कई समय अंक भर में कई रोगियों से एकत्र सीएफ थूक पर प्रस्तुत विधि की सफलता भी (2012) 9। लिम एट अल में सचित्र है और लिम एट अल। (2014) 10।

पिछले अध्ययनों 9,10 हर मरीज ​​के उतार-चढ़ाव की वजह से इस तरह की एंटीबायोटिक उपचार के रूप में perturbations की संभावना है, जबकि जिससे समुदाय के भीतर प्रमुख खिलाड़ियों के हठ को दर्शाती है, समय के साथ बदलाव कि माइक्रोबियल समुदाय का एक अनूठा सेट बंदरगाहों का सुझाव है कि। इन उतार-चढ़ाव भी बाहरी perturbations के बिना या के कारण नमूना प्रक्रिया और नमूना प्रसंस्करण के लिए दैनिक घटित चाहे, सवाल में अब भी है। एच एल-डीएनए metagenomic और 16S rDNA amplicon के विश्लेषण के आधार पर, 7 दिन अनुदैर्ध्य नमूना से पता चलता है कि एंटीबायोटिक गड़बड़ी के बिना माइक्रोबियल प्रोफाइल के दैनिक उतार-चढ़ाव (दिवस 1, 2, और 3) किया गया था कम से कम (आंकड़े 3 ए और 3 बी)। पहचान होने परएंटीबायोटिक सिप्रोफ्लोक्सासिन ऐसे पी के रूप में जाना बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के एक व्यापक स्पेक्ट्रम को लक्षित करता है जबकि मौखिक एंटीबायोटिक दवाओं के लिए duction तुरंत दिन 3 नमूने के बाद, समुदाय प्रोफ़ाइल में परिवर्तन दिवस 4. पर स्पष्ट हो गया aeruginosa, स्ताफ्य्लोकोच्चुस, और स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया, उपचार पी के रिश्तेदार बहुतायत में वृद्धि हुई aeruginosa स्ट्रैपटोकोकस एसपीपी कटौती करते हुए। और पी melaninogenica। 6 दिन तक, समुदाय धीरे धीरे प्रारंभिक प्रारंभिक समुदाय संरचना को बरामद किया। परिणाम एक भी मरीज के भीतर माइक्रोबियल प्रोफाइल के उतार-चढ़ाव की वजह से वायुमार्ग में समुदाय perturbations के अधिक होने की संभावना है कि सलाह देते हैं।

एच एल व्युत्पन्न डीएनए से 16S rDNA पुस्तकालयों और metagenomes की माइक्रोबियल प्रोफाइल के बीच स्थिरता को देखते हुए हम इस अध्ययन में इस्तेमाल -16 rRNA प्राइमरों से होने वाले पूर्वाग्रहों से इंकार। -16 RDNA वर्गीकरण भर में देखा मतभेद के लिए एक संभावित व्याख्याकुल डीएनए और एच एल व्युत्पन्न डीएनए (3B चित्रा) से उत्पन्न अल प्रोफाइल के स्यूडोमोनास एसपीपी की उच्च मात्रा की मौजूदगी हो सकती है। एंटीबायोटिक उपचार के बाद कोशिकी डीएनए। यह इन मतभेदों को 7 दिन में सबसे अधिक स्पष्ट किया गया है कि निष्कर्षों द्वारा समर्थित है, तीन दिन स्यूडोमोनास एसपीपी जो लक्ष्य एंटीबायोटिक दवाओं के उपचार के बाद। दूसरों के अलावा। सिप्रोफ्लोक्सासिन सामान्यतः सीएफ और जीर्ण पी के साथ रोगियों में पहली लाइन उपचार के रूप में प्रयोग किया जाता है गतिविधि के अपने स्पेक्ट्रम सबसे CF-जुड़े रोगज़नक़ों शामिल हैं, भले ही aeruginosa संक्रमण। हम एंटीबायोटिक उपचार स्ट्रैपटोकोकस एसपीपी सहित अतिसंवेदनशील समुदायों eradicates धारणा है कि। और इसलिए प्रतिरोधी पी द्वारा भरा एक जगह बनाने aeruginosa। Pseudomonas aeruginosa अपने biofilm समुदायों में वृद्धि के माध्यम से प्रतिरोध फायदा मिल सकता है और बाह्य डीएनए इसके biofilm वास्तुकला 52 के मुख्य संरचनात्मक समर्थन होना दिखाया गया है। यहां तक ​​कि टी के रूप मेंवह समुदाय संरचना कोशिकी डीएनए सीएफ थूक में बने रहे हो सकता है, बरामद किया। इसलिए, इन आंकड़ों hypotonic lysis और संभवतः केवल मानव व्युत्पन्न डीएनए को दूर नहीं में लाभ इस कार्यप्रवाह में प्रस्तुत धोने कदम है, लेकिन यह भी माइक्रोबियल व्युत्पन्न कोशिकी डीएनए वास्तविक माइक्रोबियल प्रोफाइल को गलत ढंग से पेश कर सकता है कि सुझाव है कि।

Metatranscriptomics

एक उच्च गुणवत्ता metatranscriptome अपेक्षाकृत कुछ ribosomal शाही सेना (rRNA) दृश्यों होते हैं और समुदाय के टेप (mRNA) के एक निष्पक्ष नमूने का प्रतिनिधित्व करना चाहिए। कारण mRNA की कम आधा जीवन और सीमित मात्रा में करने के लिए, यह प्रोटोकॉल, यहाँ प्रस्तुत के रूप में बरामद टेप की संख्या को अधिकतम करने के लिए नमूना हैंडलिंग कि कम से कम महत्वपूर्ण है।

हाल के वर्षों में, rRNA कमी के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किया गया है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट में रूपांतरित किया। ये MICROB समृद्ध, Ribo-शून्य, और नमूना विशिष्ट व्यकलित ज शामिलybridizations oligonucleotide संकरण, और एक 5 'मोनोफास्फेट युक्त exonuclease enzymatic गतिविधि को लक्षित शाही सेना पर आधारित है कि mRNA केवल किट के आधार पर कर रहे हैं कि 53। इसके अलावा, इस तरह के अधिमान्यतया रैखिक आरएनए polyadenylates और amplifies कि MessageAmp द्वितीय जीवाणु किट के रूप में mRNA के संवर्धन के लिए कई दृष्टिकोण भी उपलब्ध हैं। इन तरीकों (जैसे, mRNA के केवल, MICROB ई Xpress और MessageAmp) में से कुछ इष्टतम दक्षता के लिए समवर्ती उपयोग किया जाता है। हालांकि, इन तरीकों में से सभी की प्रभावकारिता, आंशिक रूप से अपमानित rRNA के साथ काम कर के रूप में अक्सर CF के नमूने से निकाले कुल शाही सेना में मनाया है, खासकर जब सीमित हैं। Polyadenylation निर्भर आरएनए प्रवर्धन दोनों यूकेरियोटिक और प्रोकार्योटिक mRNA की मिलकर metatranscriptomes उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, पाली (ए) पूंछ उपयोगी अनुक्रम डेटा की मात्रा को कम कर देता मई दृश्यों के लिए कहा। Homopolymer हिस्सों के साथ क्षेत्रों कम गुणवत्ता स्कोर है करने के लिए करते हैं जाएगा, गकी एक महत्वपूर्ण संख्या ausing पाली बंद trimming के बाद अनुक्रमण और बाद अनुक्रमण सॉफ्टवेयर, और औसत उपयोगी पढ़ें लंबाई से बाहर फ़िल्टर करने पढ़ता (ए) पूंछ काफी 54 से कम हो जाएगा।

जटिल सीएफ माइक्रोबियल समुदायों और आंशिक रूप से अपमानित शाही सेना (आंकड़े -4 ए और 4C) के साथ लेनदेन, हमारे पिछले अध्ययन Ribo-जीरो गोल्ड किट द्वारा संकरण कब्जा विधि का उपयोग गठबंधन उपचार की तुलना में मानव और माइक्रोबियल rRNA दोनों को दूर करने में अधिक प्रभावी था कि पता चला अन्य किट 9 (3 टेबल)। परिणामी डेटा मानव मेजबान और माइक्रोबियल टेप दोनों की समवर्ती विश्लेषण की अनुमति देता है। उपज और शाही सेना की गुणवत्ता, साथ ही अनुक्रमण मंच की अंतिम विकल्प पर निर्भर करता है, सीडीएनए संश्लेषण कदम सहित इन प्रक्रियाओं के कई अनुक्रमण पुस्तकालय पीढ़ी के साथ सुव्यवस्थित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, Ribo-जीरो इलाज किया आरएनए metatranscriptome अनुक्रमण तुला बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैशिक्षा संस्थानों ScriptSeq आरएनए Seq पुस्तकालय तैयारी किट का उपयोग कर।

पशु-जुड़े समुदायों के Metagenomic विश्लेषण मेजबान और उसके संबंधित समुदायों में शामिल है कि समग्र कार्यात्मक इकाई के लिए एक व्यापक प्रतिनिधित्व प्रदान करता है। यहाँ प्रस्तुत कार्यप्रवाह विशेष रूप से वांछित वायरल और माइक्रोबियल के अलावा मोटी बलगम, सेल मलबे, कोशिकी डीएनए, प्रोटीन और ग्लाइकोप्रोटीन परिसरों की उच्च मात्रा है, साथ ही मेजबान कोशिकाओं होते हैं कि उन जटिल पशु-जुड़े नमूनों की एक किस्म के लिए अनुकूल है कणों। वायरल और माइक्रोबियल कणों हर कदम पर खो दिया जा सकता है, अलगाव और शुद्धि मेजबान डीएनए की मात्रा को कम करने के लिए आवश्यक हैं कणों। Metagenomics डेटा की जांच समुदायों के चयापचय क्षमता प्रदान करता है, इनकोडिंग कार्यों 9 के अंतर अभिव्यक्ति खुलासा करके इस पूरक metatranscriptomics। जीनोमिक्स और टेप डेटा की एक व्यापक मूल्यांकन नई आईएनएस झुकेंगेसमुदाय बातचीत की गतिशीलता के लिए ights और सुधार लाने के उपचारों 9,10,55 के विकास की सुविधा।

Acknowledgments

यह काम वन Rohwer सम्मानित करने के लिए स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (1 R01 GM095384-01) द्वारा समर्थित किया गया। हम Ribo-जीरो महामारी विज्ञान किट के लिए जल्दी पहुँच प्रदान करने के लिए Epicentre, एक Illumina कंपनी धन्यवाद। हम ultracentrifugation ट्यूब धारक के डिजाइन और उत्पादन के लिए मार्क Hatay धन्यवाद। हम फिल्माने की प्रक्रिया की सहायता के लिए महत्वपूर्ण रीडिंग और पांडुलिपि के विचार विमर्श के लिए एंड्रियास हास और बेंजामिन नोल्स धन्यवाद, और लॉरेन पॉल।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer Life Technologies 10296-028 TRIzol LS Reagent was used in this study
Silica beads; 0.1 to 0.15 mm Cole-Parmer YO-36270-62 Zirconia-silicate beads were used in this study
Dithiothreitol, molecular grade (dry powder) Promega V3155 Can be purchased from any other company
Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane Millipore SLHV033RS
DNase I enzyme  Calbiochem 260913
Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-13 Diameter: 25 mm
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman 344059 9/16 x 3 ½ in. (14 x 90 mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation
SW41 Ti Rotor Beckman 333790
SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
Phi29 DNA polymerase Monserate Biotech 4001 10 U/µl
Phi29 Random Hexamer Thermo Scientific S0181 Previously bought from Fidelity Systems
Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-34 Whatman Anodisc filter membranes were used in this study; diameter 25 mm
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S-11494
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNase-free DNase I  NEB M0303S Can be purchased from any other company
Glycogen, RNA grade FisherScientific FERR0551 Can be purchased from any other company
Oak Ridge high-speed centrifuge tubes FisherScientific 05-562-16B For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor
Total rRNA removal kit Epicentre MRZE724 ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation
Cesium chloride  FisherScientific BP1595-500
Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 94 virome microbiome metagenomics metatranscriptomics सिस्टिक फाइब्रोसिस mucosal सतह
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Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. (94), e52117, doi:10.3791/52117 (2014).

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