Introduction
De ontwikkeling van gen targetingtechnologieën is de constructie van cellijnen en diermodellen nodig om verschillende biologische systemen 1-3 onderzoeken. Een belangrijke eerste stap in de wijziging van een genomische sequentie is het ontwerp en de bouw van een gen-targeting vector 4. Richtende vectoren zijn plasmide constructen die het allel van belang dat de gewenste veranderingen (s) geflankeerd door een selectiemerker (bijvoorbeeld neomycine) dragen, en lange genomische regio's die voor efficiënte homologe recombinatie in zoogdiercellen 5. Precieze genmodifcatie wordt bereikt door de introductie van de targeting vector in embryonale stamcellen (ES cellen) 6 of somatische cellen 7, waarbij homologe recombinatie tussen identieke stukken DNA sequentie op de targeting vector en het genomische locus in de overdracht van de beoogde modificatie het genoom van genconversie 8. Dergelijke wijzigined ES cellen kunnen worden geïnjecteerd in blastocysten van de muis om nageslacht (chimeren) produceren die vervolgens kan doorgeven deze gemodificeerde allelen via de kiemlijn 9. Een alternatieve route om transgene muizen te produceren omvat de micro-injectie van een gen expressievector in eencellige zygoten muizen, wat leidt tot de willekeurige integratie van de vector in het muizengenoom 10. Traditionele methoden van vector bouw hebben vertrouwd op conventionele 'knippen en plakken' klonen met behulp van restrictie-enzymen en DNA ligases om de verschillende selectie marker en genomische fragmenten in een vector backbone klonen. Echter, een inherente beperkende factor traditionele klonen is de positionering en keuze van restrictieplaatsen, vooral bij langere DNA-sequenties. Dit vereist vaak meerdere subklonering stappen en voert ook vreemde DNA sequenties in de vector, wat vaak leidt tot een lagere efficiëntie van gen targeting.
Recombineering (recombinogene engineering) is een DNA-techniek technologie die deze beperkingen overwint door het gebruik van homologe recombinatie (HR) gemedieerd door faag recombinatie eiwitten in E. coli cellen 11,12. Aangezien elk gebied van een homologe sequentie kan dienen als een substraat van recombineering, worden de beperkingen van de beschikbaarheid van restrictieplaatsen verwijderd. Grote DNA-sequenties kunnen naadloos direct worden gemodificeerd in vivo, dus ook behouden hun structurele integriteit 13. Recombineering is zeer efficiënt met korte homologieën (50 bp) 14 en derhalve homologie-armen (HA) kan gemakkelijk worden opgenomen in synthetische oligo sequenties. In een typisch experiment recombineering, een oligo of dubbelstrengs DNA (dsDNA) fragment met HA wordt geëlektroporeerd in competente E. recombineering coli-cellen met het doel zich ofwel op het chromosoom of op een plasmide 15. De recombinatie mogelijk wordt door induceerbare expressie van het Red rec toegekendombination eiwitten van de faag 16,17 of recET eiwitten van de rac profaag 18. De rode / exonuclease RecE zet lineair dsDNA een enkelstrengs DNA (ssDNA) tussenproduct, dat vervolgens door zijn partner, Rood / RecT, een enkelstrengs annealing eiwit (SSAP) 19 gebonden. Hybridisatie van een ssDNA lange of korte oligo met zijn complementaire doelsequentie plaatsvindt op de achterblijvende streng van de replicatie vork en leidt tot de integratie van de sequentie op de doelplaats. Achterblijvende streng ssDNA recombinatie is de basis van het hoge rendement van recombineering en kan worden beschreven door de 'beta' recombinatie model 20,21.
Een typische recombineering werkstroom bouwen een gen richtende vector omvat een van de volgende twee routes. Een route omvat subkloneren het gewenste genomisch gebied van een muis BAC-kloon in een plasmide, gevolgd door de opeenvolgende inbrengen van LoxP recombinatie locaties, een selectiemerker
Protocol
1. gene targeting Ontwerp
- Bestel een geschikte BAC-kloon die de genomische regio van belang. Zorg ervoor dat dit isogeen het type ES-cellen worden gemodificeerd bijvoorbeeld RPCI-23 en RPCI-24 BAC-klonen voor gen targeting met C57BL / 6 ES-cellen.
- Solliciteer conventionele gene targeting criteria bij het ontwerpen van de targeting vector. De belangrijkste parameters zijn onder andere de vraag of de wijziging is nodig constitutieve of voorwaardelijk te zijn, het definiëren van kritische exons (CE) voor verwijdering in een gen knock-out strategie en de onderlinge afstand en plaatsing van intronic cassettes.
OPMERKING: Elk van deze is besproken in detail elders 10. - Kies genomische regio's elk van 5-6 kb aan weerszijden van de beoogde wijziging plaats.
OPMERKING: De grootte van de gesubkloneerde insertie derhalve typisch 10-12 kb, hoewel de bovengrens zo hoog als 80 kb met een laag kopie-plasmide als subkloneren p15A kan, pBR322 etc. en tot 200 kb met een BACvector.
2. Multiplex recombineering Oligos
- Ontwerp oligo voor de plasmide backbone (subklonering plasmide) en de selecteerbare merker (insertie cassette). Ontwerp ieder oligo zodanig dat deze 180 bp HA flankerende genomische doelplaats en 20 bp van specifieke priming sequentie van de insertie cassette of subklonering plasmide (figuur 2).
OPMERKING: homologiearmen mag geen repetitieve elementen bevatten, zal de aanwezigheid van repetitieve elementen resulteren in foutieve targeting en subklonering. Repetitieve elementen kan worden gedetecteerd door het gebruik van web-based tools zoals de '' Repeat Masker ''. - Neem een unieke restrictie-enzym (RE) plaats op één van de vector oligo aan het gen targeting vector ES celgericht (figuur 2) lineariseren.
- Controleer oligo parameters met behulp van een oligo analyser programma. Zorg ervoor dat secundaire structuren in de priming regio te voorkomens.
- Kortere HA (50 bp) van het inbrengen cassette wordt getolereerd en bereikt lagere aantal recombinanten, maar ervoor te zorgen dat het kloneren plasmide HA is altijd langer (180 bp).
- Bepaal de oriëntatie van de genomische DNA-insert van de bijzondere BAC-kloon met behulp van web-based tools zoals '' cloneDB ''. Bepaal de richting van replicatie van oris door controle van de kaart van de BAC plasmideskelet in de BAC bibliotheek constructie.
OPMERKING: ORIS is meestal tegengesteld aan de transcriptie richting van de chlooramfenicol (Chl) marker voor alle gangbare BAC plasmiden. - Voeg twee eindstandige fosforothioaat (PTO) bindt aan het einde van de oligo die tegengesteld is aan de richting van replicatie van de BAC-kloon de 5 '. Voeg een 5'-fosfaat wijziging van de reverse oligo (figuur 2).
OPMERKING: De asymmetrische phosphorothioated PCR cassette op Rode spijsvertering genereert een ssDNA- tussenproduct dat prime de achterblijvende streng kanvan de replicatie vork.
OPMERKING: Maximale multiplex recombinatie frequentie wordt waargenomen met de achterblijvende streng beschermde cassettes. Leidende streng beschermde of dubbel beschermd cassettes mag niet leiden tot gelijkwaardige recombinatie efficiëntie bij sommige loci. - Bestel oligo met PAGE of HPLC zuivering.
3. BAC kloon Transformatie met pSC101 BADgbaA recombineering Plasmide.
- Aan de E. maken coli-stam met het BAC recombineering bedreven, transformeren met de pSC101 BADgbaA plasmide dat het Rode genen 16.
OPMERKING: De pSC101 BADgbaA plasmide bevat de rode en RecA genen onder de controle van de arabinose induceerbare araC-P BAD-promoter, een tetracycline selectiemerker en de temperatuurgevoelige pSC101 replicon.- Steken een steriele pipet tip in de BAC agar cultuur en te enten 5,0 ml lysogenie bouillon (LB) pH 8,0 met 12,556; g ml -1 Chl. Kweek bij 37 ° C gedurende 5 uur onder schudden bij 200 rpm.
- Chill 10% (v / v) glycerol oplossing, microcentrifugebuizen en elektroporatie cuvetten op ijs. Cool een gekoelde grote centrifuge en microcentrifugepuls tot 4 ° C.
- Bepaal de optische dichtheid (OD) van de kweek met een spectrofotometer gemeten absorptie bij 600 nm. Bereid elektrocompetente cellen (zoals hieronder beschreven) bij een OD600 aflezing van 0,3-0,8 is bereikt.
- Spin down cellen in een 50 ml centrifugebuis in een grote centrifuge bij 1216 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Was de cellen met 1 ml gekoelde 10% glycerol en spin neer cellen bij 17.949 xg gedurende 20 sec bij 4 ° C. Voer de wasstap in totaal 3 keer.
- Resuspendeer de cellen in een totaal volume van 50 ui 10% glycerol en voeg 10-200 ng van het plasmide pSC101 BADgbaA recombineering. Het verkrijgen van een enkele cel schorsing door pipetterenMaak een aantal malen en vervolgens overbrengen van de cellen naar een voorgekoelde 1 mm gat elektroporatie cuvet.
- Electroporate de cellen met een instelling van 1,8 kv, 25 uF en 200 Ω.
OPMERKING: Controleer of de juiste instellingen voor elk merk van electroporator. Een tijdconstante van elektroporatie minder dan 4 geeft de aanwezigheid van zouten en andere onzuiverheden. - Onmiddellijk herstellen de cellen in 1 ml LB en breng de cellen in een 50 ml centrifugebuis.
- Groeien de BAC GBAA kweek bij 30 ° C gedurende 2 uur schudden bij 200 rpm.
OPMERKING: De pSC101 BADgbaA plasmide verloren wanneer de cellen worden gekweekt bij 37 ° C vanwege inactivering van de temperatuurgevoelige repe replicatiefactor. Groeien GBAA cellen bij 30 ° C aan de recombineering functies behouden. - Voeg 9 ml LB die 12,5 ug ml -1 Chl en 4 ug ml-1 tetracycline (Tet) om de herstelde BAC GBAA cultuur. Groeien deBAC GBAA cultuur O / N bij 30 ° C onder schudden bij 200 rpm.
OPMERKING: De transformatie efficiëntie van electroporating het supercoiled GBAA plasmide voldoende hoog verzadiging groei O / N toestaan in vloeibare media.
4. Voorbereiding van de Insertion Cassettes en Subklonering plasmiden
- Om HA nemen in de insertie cassette (s) en het subkloneren plasmide uitvoeren polymerase kettingreactie (PCR) met de lange gemodificeerde oligo zoals hieronder beschreven.
- Optioneel: om plasmide overdracht te voorkomen dat in de recombineering reactie, gebruik dan een R6K oorsprong of soortgelijke smalle gastheergebied plasmide sjabloon aan het inbrengen cassette versterken.
- Als alternatief, lineariseren het plasmide sjabloon met behulp van een RE digest (tabel 2). Kies een RE die snijdt buiten de PCR-amplificatie regio en is hitte geïnactiveerd. Warmte inactiveren van de RE, zoals aanbevolen door de manufacturer.
- Stel polymerase kettingreactie (PCR) met behulp van een high-fidelity Hotstart DNA- polymerase systeem. Bereid een PCR master mix zoals beschreven (tabel 3). Voer thermale cycli zoals weergegeven (tabel 3).
- Analyseer PCR producten door agarose gelelektroforese. Laad 1-5 pi van elke PCR op een 1% (w / v) agarosegel die 0,5 mg ml-1 ethidiumbromide (EtBr).
OPMERKING: De aanwezigheid van niet-specifieke amplificatieproducten niet hindert het recombineering reactie. In sommige gevallen kan echter primer-dimeren recombineering minder efficiënt. - Zuiver PCR producten met behulp van een PCR zuivering kit.
- Optioneel: verwijder het plasmide sjabloon uit PCR's door behandeling met DpnI gevolgd door PCR clean-up. Elueer DNA in een minimaal volume steriel gedeïoniseerd water (zoals aanbevolen door de fabrikant).
NB: Toevoeging van DpnI aan PCR reacties resultaten ongezuiverd in verminderde efficiëntie van de splitsing van the gemethyleerd plasmide-DNA template.
- Optioneel: verwijder het plasmide sjabloon uit PCR's door behandeling met DpnI gevolgd door PCR clean-up. Elueer DNA in een minimaal volume steriel gedeïoniseerd water (zoals aanbevolen door de fabrikant).
- Kwantificeren PCR geamplificeerde DNA door agarose gel analyse tegen een reeks bekende DNA standaarden bijvoorbeeld λ HindIII digestie of door een NanoDrop spectrofotometer.
5. Subklonering Plus Insertion
- Verdun de O / N BAC GBAA cultuur 50-voudige door het toevoegen van 200 ul in 10 ml LB + Chl + Tet. Groeien bij 30 ° C schudden bij 200 rpm gedurende 1 uur 50 min. Inclusief een monster worden als negatieve controle.
- Chill alle recombineering materialen en apparatuur tot 4 ° C, zoals beschreven in stap 3.1.2.
- Giet LB agar pH 8 platen met de juiste concentratie van de geschikte selectieve antibioticum (en) dat de selectie van het DNA fragment dat als ingevoegd voor de selectie van de subkloneervector (tabel 4) zal toestaan.
OPMERKING: Sommige antibiotica zijn pH-gevoelig. Gebruik LBagar pH 8 als een regel. - Bereid een 10% (w / v) oplossing van L-arabinose. Filter steriliseren door een 0,2 urn spuitfilter.
OPMERKING: Arabinose induceert de expressie van de eiwitten van de recombineering GBAA plasmide. - Controleer de buitendiameter van de BAC GBAA cultuur met behulp van een spectrofotometer. Zodra een OD600 van 0,25-0,3 bereikt, induceren recombineering eiwitten zoals beschreven in de volgende stap.
- Voeg 200 ul van 10% arabinose oplossing 10 ml van de BAC kweek tot een uiteindelijke concentratie van arabinose van 0,2% te bereiken. Inclusief een geïnduceerde kweek (zonder arabinose) wordt gebruikt als negatieve controle.
- Breng de BAC cultuur naar een 37 ° C schudincubator en induceren Rode uitdrukking voor 45 minuten schudden bij 230 rpm.
OPMERKING: Expressie van Red eiwitten is inefficiënt bij 30 ° C. - Spin down cellen en wassen met 10% glycerol 3 keer zoals in stap 3.1.5.
- Voeg 600-1,000 ng elk van de subklonering plasmide en de insertie cassette (s) naar de recombineering reactie. Neem alleen een vector en vector plus enkele insert controles om de recombinatie bekwaamheid en integriteit van de vector en de cassettes te controleren.
- Verkrijgen van een enkele celsuspensie door en neer te pipetteren. Voer elektroporatie zoals beschreven in stap 3.1.7 en daaropvolgende herstel in 1 ml LB bij 37 ° C gedurende 1 uur voor multi-kopie plasmiden of 10 ml LB bij 37 ° C gedurende 3 uur voor BAC-vectoren.
- Plaat verschillende verdunningen van de kweek teruggewonnen bijvoorbeeld 90%, 10%, 1% op de dubbele selectie agarplaten en groeien bij 37 ° C gedurende 16 uur.
6. Analyse van recombinanten
- Optioneel: Neem 6 tot 12 kolonies en uit te voeren kolonie PCR met behulp van een HA flankerende primer en een insert specifieke primer. Omvatten de subklonering plasmide en het inbrengen cassette plasmide als de ouder BAC-kloon als negatieve controles.
- Voeren agarosegelanalyse van de kolonie PCR's. Identificeer positieve klonen door de aanwezigheid van een heldere band bij de verwachte grootte.
OPMERKING: Het hoge rendement van de SPI-klonen proces genereert meestal correcte recombinanten.
- Voeren agarosegelanalyse van de kolonie PCR's. Identificeer positieve klonen door de aanwezigheid van een heldere band bij de verwachte grootte.
- Pick-kolonies in 5 ml LB pH 8 met de selectieve antibiotica en te groeien O / N bij 37 ° C.
- Bereid DNA minipreps toepassing van een kolom zuivering kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereid BAC miniprep DNA middels standaard fenol- chloroform isolatie of een vergelijkbaar protocol.
- Voeren RE verteert op het miniprep DNA. Afzonderlijke DNA door agarose gelelektroforese. Analyseer RE patronen om de klonen die de verwachte fragmenten afmetingen van de juiste targeting vector identificeren. Kies een RE die duidelijk onderscheid maakt tussen de vector ontbreekt insert (s) en de vector die het inzetstuk (s).
- Optional: cellen die verstoken zijn van de BAC, die nog in de E. zijn verkregen coli na recombineering, gebruik dan de miniprep plasmide DNA om DH5alfa of DH10B E. transformeren coli-cellen.
- Uit te voeren DNA-sequencing over de HA en inbrengen cassette aan oligo synthese fouten te controleren.
Representative Results
Knockin Vectoren
Knockin richtende vectoren aan de noodzaak om een nieuwe sequentie functie introduceren in het genoom waaronder enkel basepaar substitutie in een eiwit coderend gebied, de fusie van een fluorescente merker of een affiniteit tag aan een eiwit of de integratie van een gen-expressiecassette. Om de toepassing van de SPI in Knockin vectorconstructie strategieën te testen, werden twee verschillende testcases onderzocht. Dnttip1 codeert de deoxynucleotidyltransferase, terminal, interactie eiwit 1A (TDIF1) die samen met klasse I histondeacetylase (HDAC) vormen een mitotische deacetylase- complex (Midac) 28. Om de rol van Dnttip1 in celdeling te onderzoeken, werd een tandem-affiniteit tagging aanpak van de TDIF1 interagerende eiwitten te isoleren. Eerdere pogingen om een gedeelte van de Dnttip1 gen subkloneren met een p15A vector die lange homologie gebieden resulteerde in lage spleet reparatie efficiencyredenennd frequente afwijkende recombinatie producten (gegevens niet getoond). Zo is de constructie van een knockin vector op Dnttip1 locus ontvangen uitdagende recombineering oefening. Een SPI strategie ontworpen om een 12 kb gedeelte van de Dnttip1 gen overspant de laatste exon (exon 13) subkloneren in een laag kopie p15A vector en gelijktijdig plaats een dubbele affiniteitstag selectie cassette in exon 13, vervanging van de stopcodon (Figuur 3A ). De 2X FLAG-calmoduline-bindend eiwit (CBP) gekoppeld FRT-PGK-EM7-Neomycine (Neo) -BGhpA-FRT cassette (2,0 kb) werd geamplificeerd van een RE gelineariseerd plasmide met een dual PTO gemodificeerde oligo dat bevatte 120 bp HA aan weerszijden van de Dnttip1 codon stoppen. Een p15A Zeo Dnttip1 subkloneervector (1,7 kb) geconstrueerd dat bevatte 200 bp regio homoloog aan de uiteinden van de Dnttip1 sequentie worden gesubkloneerd. De Dnttip1 subkloning plasmide werd gelineariseerd RE en PCR geamplificeerd door middel van 20 bp gemodificeerde oligodie gegenereerd een leidende streng beschermd vector. De PCR producten werden Dpnl behandeld, gezuiverd en co-elektroporatie in recombineering bevoegde Dnttip1 BAC E. coli-cellen en geïnduceerde controlecellen. De SPI reacties werden uitgeplaat op Zeocin (Zeo) en kanamycine (Kan) bevattende agarplaten (figuur 3B). SPI geproduceerde correct gemodificeerde Dnttip1 knockin vector in alle 12 recombinanten geanalyseerd (Figuur 3C). DNA-sequencing geverifieerd de afwezigheid van eventuele fouten die voortvloeien uit oligo synthese of PCR-amplificatie.
Een ander voorbeeld van SPI betrokken bij het frame invoegen van een versterkt geel fluorescerend eiwit (eYFP) gekoppeld selectiecassette de P2rx1 gen. De P2rx1 gen codeert voor een G-eiwit-gekoppelde receptor die functioneert als een ATP-gated ionkanalen 29. Koppeling met YFP fluorescentie maakt het volgen van de P2X1 receptor op het celoppervlak in various functionele assays. P2rx1 is een moeilijk locus die aanzienlijke problemen heeft ingediend met gebruikelijke methoden recombineering (gegevens niet getoond). Met SPI, een 12 kb segment van de P2rx1 gen omvattende de terminal exon (exon 12) werd gesubkloneerd in een p15A zeo vector en gemodificeerd met de gezamenlijke insertie van een eYFP -LoxP geflankeerd Neo cassette vervangt het stopcodon in exon 12 van de constructie P2rx1-eYFP Knockin vector (Figuur 3D). In dit voorbeeld, de achterblijvende streng beschermde p15A vector (1,7 kb) bevatte 230 bp HA en eYFP cassette bevatte 50 bp HA en werd gelaten ongemodificeerd. De eYFP insertie cassette (2,7 kb) werd samengesteld door splicing overlap PCR van de eYFP gen PCR geamplificeerd uit pEYFP-C1 en de LoxP- PGK-EM7-Neo-BGhpA loxP cassette werd PCR geamplificeerd uit pL452 (NCI, Frederick) . De SPI reactie produceerde honderden kolonies (gegevens niet getoond). RE analyse van DNAminipreps bereid uit 11 klonen toonde de meerderheid bevatte de juiste wijze gemonteerd P2rx1-eYFP Knockin vector (Figuur 3E). Extra validatie door DNA-sequentiebepaling toonde foutloos inbrengen van de eYFP cassette. Sommige van de klonen toonde profielen van de ongelabelde gat gerepareerd en de gemerkte gat gerepareerd plasmiden in dezelfde cel (lanen 6-9). Enkele monsters bevatten ook verkeerd gap hersteld (laan 2) of mistargeted plasmiden (lanen 4 en 5). Het falen gelijktijdige subkloneren en targeting in sommige SPI recombinanten wijst de grenzen van efficiënte SPI klonen bij gebruik van grote cassettes (> 3 kb), die voortvloeien uit de beperkingen van Red processivity lange DNA-fragmenten 30, of met korte HA. Inderdaad, het verhogen van de HA van de eYFP cassette 200 bp SPI grotere efficiëntie en de juiste gerichtheid van de cassette (gegevens niet getoond). Gene targeting met de P2rx1 - eYFP Knockin vector in JM8.N4muis ES-cellen (C57BL / 6 stam) gegenereerd 6 positieve klonen uit 96, die de juiste wijze doelgericht P2rx1-eYFP sequence (figuur 3F) bevatte.
BAC Reporter Vectoren
Een BAC kloon van het doelwitgen bevat vaak alle vereiste stroomopwaartse en stroomafwaartse regulerende elementen zoals enhancers, UTR's etc. alsook de endogene promotor genexpressie op natuurlijke niveaus 31. Een BAC reporter vector Daarom wordt de voorkeur voertuig de endogene expressie patroon van een gen 32 recapituleren. De grote omvang van een BAC plasmide (tot 200 kb) geeft aanzienlijke praktische problemen transfecteren van een intact BAC in cellen 33. Het verkleinen van de genomische BAC-insertie door BAC trimmen 34,35, terwijl de noodzakelijke regulerende elementen van een gen behoudt, gemakkelijk te verwerken van de BAC en resulteert in een efficiëntere transfectiop. Huidige BAC engineering technologie bestaat uit meerdere rondes van recombineering om dit doel 35 te bereiken. Om de bruikbaarheid van SPI demonstreren BAC trimmen, een pBeloBAC11 BAC vector werd gebruikt om 30 kb genomische sequentie met de volledige lengte P2rx1 gen van 168 kb BAC P2rx1 samen subkloneren het gelijktijdig inbrengen van een cassette in de eYFP P2rx1 gen (Fig 4A). De pBeloBAC11 Zeo vector backbone (6,5 kb) met 180 bp HA werd PCR versterkt met aangepaste oligo dat een achterblijvende streng beschermd vector gegenereerd. Dezelfde eYFP Neo cassette (3 kb), die in de vorige P2rx1 knockin vector constructie werd PCR geamplificeerd met achterblijvende streng beschermde oligo met 180 bp HA en doelgerichte de P2rx1 exon 12 vervangt het stopcodon. Volgende gecombineerde elektroporatie van de eYFP cassette en de pBeloBAC11 zeo vector in P2rx1 BAC cellen expressing de GBAA recombineering eiwitten, werd de kweek teruggewonnen in 10 ml LB pH 8 gedurende 3 uur bij 37 ° C aan de BAC plasmiden scheiden. Pure recombinanten werden geselecteerd op Zeo en Kan agarplaten en werden waargenomen bij een frequentie van 2 x 10 -6. Kolonie PCR genotypering analyse bleek succesvol BAC trimmen in 3 van de 6 klonen die werden geanalyseerd (Figuur 4B). Long range PCR-amplificatie over de eYFP invoegplaats bevestigde de juiste cassette incorporatie in de drie positieve klonen (Figuur 4B). De drie klonen zonder de eYFP insert waren ook verkeerd gat gerepareerd het 5 'einde, maar de oorzaak van de eYFP Rol van afwijkende cassette in deze klonen afzonderlijk op de correcte afsluiting van de 5 gevallen zijn dit BAC uiteinde. De drie eYFP positieve BAC-klonen werden verder geanalyseerd met RE verteert en vertoonden het verwachte patroon van de juiste bijgesneden eYFP recombinant BAC (Figuur 4C </ Strong>). Sequentieanalyse toonde afwezigheid van fouten in de eYFP cassette slechts 1 kloon van de 3 positieven.
Voorwaardelijke Knockout (CKO) Vectoren
Voorwaardelijke ablatie van genexpressie is een belangrijk instrument om ontwikkelingsprocessen te onderzoeken of aan biologische systemen op een bepaald tijdstip te bestuderen. Een conditionele knockout strategie omvat normaliter de plaatsing van LoxP recombinatie locaties rondom een kritische exon (CE). De schrapping van een CE-upon Cre expressie of activering produceert een frameshift en een voortijdig stopcodon, wat resulteert in de afbraak van het mRNA te wijten aan nonsense gemedieerde verval (NMD). De bouw van een conditionele gene targeting vector is een complexe taak en omvat verschillende stappen van subklonering, targeting en transformatie 22. SPI biedt een geschikte route om dit proces te vereenvoudigen. Als testcase, een voorwaardelijke allel van de Zrsr2 gen werd geconstrueerdvia de SPI methode (figuur 5A). De Zrsr2 gen codeert voor een splicing factor en een enkele kopie op het X chromosoom. De conditionele status gen deletie van bijzonder belang in dit geval te controleren voor de mogelijkheid van cellen aanpassing aan het gebrek aan Zrsr2 tijdens ES celselectie in een constitutief gen deletie targeting. SPI werd uitgevoerd met een 10 kb deel van de ZrSr2 gen subkloneren met gelijktijdig inbrengen van twee verschillende LoxP geflankeerd selectie cassettes. De FRT-PGK-EM7-Neo-FRT-LoxP cassette (2 kb) werd PCR geamplificeerd van RE verteerd pL451 behulp achterblijvende streng beschermde oligo's die bevatte 180 bp HA gericht op de ZrSr2 intron 2. Een tweede cassette met Rox-PGK-em7- Blasticidine (BSD) -Rox-LoxP (2 kb) werd PCR geamplificeerd uit een plasmide R6K met achterblijvende streng beschermde oligo bevattende 180 bp HA identiek is aan een stroomafwaarts gebied in intron 3. De twee loxP geflankeerd exon 3, de CE waarvan deletion overeengekomen voorwaardelijke Cre activering resulteert in een frameshift en introduceert een voortijdig stopcodon. De Zrsr2 subklonering plasmide (1.6 kb) werd PCR geamplificeerd uit een RE gelineariseerd p15A zeo plasmide met achterblijvende streng beschermde oligo bevattende 180 bp HA passen de einden van het 10 kb Zrsr2 sequentie. SPI reacties werden uitgevoerd zoals eerder beschreven en uitgeplaat op Zeo + Neo + Bsd platen. De ZrSr2 conditionele targeting vector werd succesvol geassembleerd in de meeste van de 12 recombinanten onderzocht (Figuur 5B). Verdere DNA-sequencing analyse toonde juiste plaatsing van zowel de selectie markers in de ZrSr2 CKO vector.
Figuur 1. SPI klonering. Overzicht van de SPI klonen combineren cassette inbrengen en subklonering in een enkele stap. (A) De BAC-kloon is transformed met de pSC101 BADgbaA plasmide en gegroeid bij 30C. (B) Na arabinose inductie naar het Rode eiwitten tot expressie, de asymmetrische gewijzigde inbrengen cassette en subkloning plasmide worden geïntroduceerd in de BAC-kloon en geselecteerd met zowel het inbrengen en subklonering markers om de uiteindelijke vector genereren. Klik hier om een grotere versie van te bekijken dit cijfer.
Figuur 2. Schematische illustratie van het ontwerp van SPI recombineering oligo. De subklonering plasmide en insertie cassette worden beide gegenereerd met PCR met gebruik van een combinatie van terminal PTO en fosfaat gemodificeerde oligo. De PCR-fragment op Rode spijsvertering in vivo, produceert een ssDNA intermediair, die zich bindt aan de achterblijvende streng van de replicatie vork. Gene specifieke HA 50-180 bp is opgenomen in ieder oligo zoals afgebeeld. De pijl geeft de richting van DNA-replicatie in een kandidaatgen. Binnen de lijn vertegenwoordigt subkloning plasmidesequentie niet in het PCR-product verwerkt. RE site, restrictie-enzym plaats van linearisatie van de uiteindelijke vector; F, vooruit reeks (20 bp) die specifiek zijn voor het verder kloneren plasmide of insertie cassette; R, omgekeerde complement volgorde (20 bp) van het plasmide of cassette; sm, selectie marker. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. SPI bouwtechnische moeilijke knockin vectoren. (A) Schematische voorstelling van de SPI strategie gebruikt bij de constructie van de Dnttip1 dubbele gelabeld vector. Arrow indicates de richting van replicatie van de BAC-kloon. (B) Plating resultaten van de niet-geïnduceerde en geïnduceerde monsters van de Dnttip1 SPI experiment. (C) EcoRI digest van Dnttip1 SPI klonen. M, 1 kb ladder (NEB); C, p15A Dnttip1 gat gerepareerd plasmide ontbreekt de dubbele tag cassette. Fragment maten zijn: getagd, 9.2 + 4.4 + 2.2 kb; controle; 9.2 + 4.6 kb. (D) SPI gebaseerd P2rx1-eYFP Knockin vectorconstructie. (E) EcoRI digest van P2rx1-eYFP SPI klonen. M, 1 kb + ladder (Invitrogen); C, p15A P2rx1 gat gerepareerd plasmide ontbreekt het eYFP cassette. Fragment maten zijn: getagd, 8,3 + 4,4 + 3,1 + 0,03 kb; controle; 8,3 + 3,1 + 1,8 + 0,03 kb (F) Southern blot analyse van P2rx1 -. EYFP gen-targeting in JM8.N4 ES-cel-cellen. Bovenpaneel, Southern blot met het 3 'uiteinde van de sonde met behulp van PshAI digest. Getoond is de screening resultaat van 5 klonen. Onderste paneel, Southern blot met behulphet 5 'uiteinde van de sonde en Spel digestie van de positieven geïdentificeerd uit het 3' uiteinde screening. PshAI RE site; S, Spel-RE website. Gestippelde lijn geeft het einde van de vector HA. Zwarte doos duidt zuidelijke sonde. Verwachte restrictie fragmenten zijn, PshAI: WT, 8.9 kb; eYFP-neo, 11,5 kb; Spel:. WT, 6,9 kb; eYFP-neo, 7,6 kb Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Vereenvoudigd BAC trimmen SPI. (A) Schematische illustratie van het concept van BAC trimmen SPI. Legenda wordt beschreven in figuur 1. (B) PCR-amplificatie in de 5 'en 3' uiteinden van de gesubkloneerde insertie en over de P2rx1-eYFP insertion plaats. De screening strategie wordt voor elk type PCR. M (bovenste paneel), Hyperladder 25 bp, (onderste panelen), 1kb +; P, P2rx1 BAC; . S, pBeloBAC11 Zeo subklonering plasmide (C) HindIII verteren van de drie eYFP positieve SPI BAC klonen uit (B); E, verwacht HindIII restrictie patroon van de bijgesneden eYFP BAC. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Voorwaardelijke knockout vector generatie SPI klonen. (A) Schematische voorstelling van de simultane insertie van twee verschillende LoxP geflankeerd selectie cassettes tijdens subkloneren van de Zrsr2 allel. Legenda wordt beschreven in figuur 1. (B) </ Strong> EcoRI samenvattingen van Zrsr2 SPI klonen. L, 1 kb ladder (NEB); C1, p15A ZrSr2 gat gerepareerd plasmide, C2, p15A ZrSr2 gat gerepareerd plasmide dat het neo insert; C3, p15A ZrSr2 gat gerepareerd plasmide dat het bsd insert. Fragment maten zijn: CKO, 7,7 + 2,9 + 2,6 + 1,6 kb; C1, 7,7 + 4,0 kb; C2, 7,7 + 4,3 + 1,6 kb; C3, 7,7 + 2,9 + 2,3 kb. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Geen van de stappen | Conventionele recombineering pijplijn een | Multiplex recombineering b |
| Stap 1 | Transformatie van recombineering plasmide in BAC gastheer | Transformatie van recombineering plasmide in BAC gastheer. Bereiding van de targeting cassettes en subklonering vectoren. |
| Stap2 | Inbrengen van R1 / R2 Gateway cassette | Multiplex kloof reparatie klonen |
| Stap 3 | Inbrengen van floxed Kan cassette | O / N cultuur van enkele kolonies |
| Stap 4 | Gap reparatie in R3 / R4 plasmide | Plasmide voorbereiding en verificatie |
| Stap 5 | Transformatie naar Cre + E. coli | |
| Stap 6 | Plasmide voorbereiding en verificatie | |
| Stap 7 | O / N drieweg Gateway reactie | |
| Stap 8 | Transformatie van de drie-weg Gateway reactie in DH10B E. coli-cellen | |
| Stap 9 | Overnacht cultuur van enkele kolonies | |
| Stap 10 | Plasmide voorbereiding en sequentieverificatie | |
| b gemiddelde tijd van 4 dagen om geverifieerde kloon | ||
Tabel 1: Vergelijking van conventionele recombineering met SPI in de constructie van conditionele knockout vectoren.
| RE buffer | 5 gl |
| DNA | 1 ug plasmide of gezuiverde PCR producten |
| RE | 1 ui (5 stuks of meer) |
| TE | tot 50 gl |
| Incubeer bij 37 ° C gedurende tenminste 1 uur. Verwarm inacitvate volgens de instructies van de fabrikant | |
Tabel 2: RE digest.
| PCR materialen | De eindconcentratie |
| PCR buffer | 1x |
| dNTP | 200 nM |
| MgSO4 | 1.5 mM |
| Betaine | 1.3 M |
| DMSO | 1% |
| Voorwaartse primer | 200 nM |
| Reverse primer | 200 nM |
| DNA polymerase | 1 U |
| Sjabloon | 10 ng van multicopy plasmiden of 2,5 pl miniprep DNA voor genotypering PCRs |
| Water | tot 50 pi van een |
| Voor een standaard 50 ul PCR reactie met multicopy plasmiden. Lange afstand genotypering PCR's werden opgezet in 25 ul PCR-reacties. | |
| PCR-omstandigheden | |
| 95 ° C | 2 min |
| 92 ° C | 10 sec |
| 55 ° C | 30 sec |
| 72 ° C | 30 sec |
| 30 cycli b | |
| b Cycle niet kan worden verlengd tot 35 BAC PCR genotypering | |
Tabel 3: PCR Set-up voorwaarden.
| Antibiotica | Concentratie bis (ug ml-1) |
| Ampicllin | 50 |
| Blasticidine b | 40 |
| Chlooramfenicol | 12.5 |
| Gentamicine | 2 |
| Hygromycine c | 30 |
| Kanamycine b | 15 |
| Tetracycline | 4 |
| Trimethoprim c | 10 |
| Zeocine | 5 |
| Een aanbevolen voor gebruik met BAC en multicopy plasmiden wanneer gebruikt in combinaties multiplex recombineering | |
| b Blasticidine (35 ug ml-1) en kanamycine (6 ug ml-1) wanneer gecombineerd in combinatie | |
| c Hygromycine en trimethoprim worden niet aanbevolen voor de selectie met enkele kopie BAC. | |
Tabel 4. Aanbevolen antibioticumconcentraties voor gebruik in SPI experimenten.
Discussion
Bouw van ES cellijnen en muismodellen is historisch betrokken gentargeting behulp plasmideconstructen dat de gewijzigde allel 4 bevatte. De constructie van deze complexe gen richtende vectoren blijkt een belangrijk knelpunt bij de tijdige productie van dergelijke modellen. De ontwikkeling van recombineering gebaseerd vectorconstructie strategieën heeft toegestaan verbeterde vector ontwerpen en efficiënter vector montage. Toch huidige recombineering protocollen nog steeds te betrekken meerdere stappen, vereisen tussenliggende plasmidezuivering en maken gebruik van verschillende bacteriestammen. Subkloneren plus insertie biedt een nieuwe benadering vector constructie die kan worden uitgevoerd in één elektroporatie gebeurtenis in de resident BAC gastheerstam. Het nut van SPI gen targeting werd hier getest in verschillende vector bouwtoepassingen. In alle gevallen hier onderzocht, SPI blijkt efficiënt te werken en de juiste recombinante plasmide werd geproduceerd.In de meeste gevallen werden de meerdere verschillende cassettes correct in de targeting vector. Grote DNA cassettes en vectoren werden gemakkelijk ondergebracht in de SPI protocol en toonde de flexibiliteit van het systeem.
SPI gebaseerd op het gebruik van lange homologie sequenties en fosforothioaat (PTO) bescherming van het lineaire DNA-cassettes. PTO modificatie bescherming biedt tegen exonucleases de lineaire DNA 20,21 en de lange HA verhoogt recombinatie efficiëntie multiplexing mogelijk. Echter, de synthese van langere oligo sequenties verhoogt de kans op fouten accumuleren bijzonder deleties. Mutaties in de oligo kan bijzonder schadelijk zijn wanneer zij de voor eiwit coderende gebieden. DNA sequentiebepaling over de HA en over de volledige lengte van het ingebrachte cassette wordt sterk aanbevolen om klonen met alle sequentieveranderingen elimineren. Het gebruik van een high-fidelity DNA polymerase systeem wordt ook voorgesteld om invoering van een te vermijdeny PCR fouten. De lengte en samenstelling van de HA van de subklonering plasmide kritischer ten opzichte van die van de insertie cassette (gegevens niet getoond). Voor bijzonder gevoelige toepassingen zoals de bouw van Knockin vectoren, waarbij elke mutatie in exon regio's niet worden getolereerd, kan de HA van het inbrengen cassette worden ingekort (50-120 bp) tot problemen in verband met de lange oligo's te vermijden. De insertie cassette kan ook worden overgelaten ongemodificeerd of dubbele phosphorothioated (waarbij kennis van de richting van replicatie niet beschikbaar). Maar multiplexen in deze gevallen nog steeds vereist lang beschermd HA subkloning plasmiden. Een nadeel van deze specifieke strategie is de verlaging van multiplexing efficiëntie die mogelijk invloed SPI klonen op verschillende loci.
De lengte van de insertie cassette en subklonering plasmide is een andere belangrijke parameter in SPI klonen. Grotere DNA-moleculen electroporate minder efficiënt en het effect is cumulatief, gezien de requirement alle cassettes in dezelfde cel voeren (data niet getoond). Multiplexing het meest efficiënt met kleinere inbrengen cassettes. DNA fragmenten groter dan 3 kb een beperking Red gemedieerde ssDNA verwerking, die het meest efficiënt tot 3 kb 30 ook plaats. Inbrengen cassettes van meer dan 3 kb zijn dual gereseceerde en minder efficiënt recombineren via een beta onafhankelijke route 20. Daarom screening voldoende kolonies het correcte kloon te identificeren wordt belangrijk in deze gevallen. Een langere duur van de recombinatie na elektroporatie verhoogt ook de kans op herstel van de juiste kloon in moeilijke SPI oefeningen. Tot vier kleine cassettes (<1,5 kb) tegelijkertijd worden ingebracht met het SPI proces, hoewel het multiplexen efficiëntie afneemt met elke extra cassette (gegevens niet getoond). Echter, dit weerspiegelt het resultaat van een optimale SPI experiment is het raadzaam om de grenzen van multiplexing overwegen bij gebruik veel grote cassettes. De ontwikkeling van genoom editing tools zoals geclusterd regelmatig afgewisseld korte palindroom herhalingen (CRISPR) -cas9 endonuclease systeem is de creatie van nieuwe genoom aanpassingen mogelijk gemaakt en heeft geleid tot een efficiëntere genoom techniek 36. Echter, deze nieuwere technologieën gentargeting vectoren aangevuld plaats verdrongen hen. Het is de bedoeling dat de CRISPR-cas systeem antibiotische selectie zou kunnen vervangen en verder verfijnen van de multiplex recombineering protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
|
| Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
| C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
| KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
| L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
| Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
| QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
| Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |
References
- Dovey, O. M., Foster, C. T., Cowley, S. M. Histone deacetylase 1 (HDAC1), but not HDAC2, controls embryonic stem cell differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 8242-8247 (2010).
- Harvey, M., et al. Spontaneous and carcinogen-induced tumorigenesis in p53-deficient mice. Nat. Genet. 5, 225-229 (1993).
- Waterhouse, P., et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4. Science. 270, 985-988 (1995).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
- Hasty, P., Rivera-Pérez, J., Bradley, A. The length of homology required for gene targeting in embryonic stem cells. Mol. Cell. Biol. 11, 5586-5591 (1991).
- Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination. Nature. 317, 230-234 (1985).
- Hirata, R., Chamberlain, J., Dong, R., Russell, D. W. Targeted transgene insertion into human chromosomes by adeno-associated virus vectors. Nat. Biotechnol. 20, 735-738 (2002).
- Szostak, J. W., Orr-Weaver, T. L., Rothstein, R. J., Stahl, F. W. The double-strand-break repair model for recombination. Cell. 33, 25-35 (1983).
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309, 255-256 (1984).
- Fu, J., Teucher, M., Anastassiadis, K., Skarnes, W., Stewart, A. F. A recombineering pipeline to make conditional targeting constructs. Methods Enzymol. Soriano, P. M., Wassarman, P. M. 477, Academic Press. 125-144 (2010).
- Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J., Stewart, A. A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nat. Genet. 20, 123-128 (1998).
- Copeland, N., Jenkins, N., Court, D. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
- Muyrers, J., Zhang, Y., Testa, G., Stewart, A. Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination. Nucleic Acids Res. 27, 1555-1557 (1999).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5978-5983 (2000).
- Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nature Protoc. 4, 206-223 (2009).
- Wang, J., et al. An improved recombineering approach by adding RecA to λ red recombination. Mol. Biotechnol. 32, 43-53 (2006).
- Datta, S., Costantino, N., Court, D. L. A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria. Gene. 379, 109-115 (2006).
- Fu, J., et al. Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting. Nat. Biotechnol. 30, 440-446 (2012).
- Muyrers, J., Zhang, Y., Buchholz, F., Stewart, A. RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners. Genes Develop. 14, 1971-1982 (2000).
- Maresca, M., et al. Single-stranded heteroduplex intermediates in lambda Red homologous recombination. BMC Mol. Biol. 11, 54 (2010).
- Mosberg, J. A., Lajoie, M. J., Church, G. M. Lambda Red recombineering in Escherichia coli occurs through a fully single-stranded intermediate. Genetics. 186, 791-799 (2010).
- Liu, P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations. Genome Res. 13, 476-484 (2003).
- Chan, W., et al. A recombineering based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction. Nucleic Acids Res. 35, e64 (2007).
- Zhang, Y., Muyrers, J. P. P., Testa, G., Stewart, A. F. DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 18, 1314-1317 (2000).
- Lee, E. C., et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA. Genomics. 73, 56-65 (2001).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
- Valenzuela, D. M., et al. High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat. Biotechnol. 21, 652-659 (2003).
- Bantscheff, M., et al. Chemoproteomics profiling of HDAC inhibitors reveals selective targeting of HDAC complexes. Nat. Biotechnol. 29, 255-265 (2011).
- Mulryan, K., et al. Reduced vas deferens contraction and male infertility in mice lacking P2X1 receptors. Nature. 403, 86-89 (2000).
- Subramanian, K., Rutvisuttinunt, W., Scott, W., Myers, R. The enzymatic basis of processivity in lambda exonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 1585-1596 (2003).
- Antoch, M. P., et al. Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue. Cell. 89, 655-667 (1997).
- Rostovskaya, M., et al. Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells. Nucleic Acids Res. 40, e150 (2012).
- Giraldo, P., Montoliu, L. Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals. Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).
- Hill, F., et al. BAC trimming: minimizing clone overlaps. Genomics. 64, 111-113 (2000).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339, 819-823 (2013).
