Introduction
Utviklingen av genet målrettingsteknologier har aktivert bygging av cellelinjer og musemodeller for å undersøke ulike biologiske systemer 1-3. Et viktig første trinn i ombygging av en genomisk sekvens er design og bygging av et gen målretting vektor 4. Målretting vektorer er plasmidkonstruksjoner som bærer allelet av interesse som inneholder de ønskede endringer (s) flankert av en seleksjonsmarkør (f.eks neomycin), og lange genomiske regioner som kreves for effektiv homolog rekombinasjon i pattedyrceller 5. Presis gen modifikasjon blir oppnådd ved innføring av det målsøkende vektor inn i embryonale stamceller (ES-celler) 6 eller somatiske celler 7, hvorved homolog rekombinasjon mellom like strekninger av DNA-sekvensen i vektoren målretting og de genomiske locus resulterer i overføring av den tilsiktede modifikasjon til genomet av genet konvertering 8. Slik modified ES-celler kan bli injisert i mus blastocyster til å produsere avkom (kimærer) som deretter overfører disse modifiserte alleler via kimlinje 9. En alternativ rute for å fremstille transgene mus som involverer mikroinjeksjon av et gen i ekspresjonsvektoren encellede mus zygoter, noe som fører til tilfeldig integrasjon av vektoren i musegenomet 10. Tradisjonelle metoder for vektor konstruksjon har stolt på konvensjonelle "klipp og lim" kloning ved hjelp av restriksjonsenzymer og DNA ligaser å klone forskjellig seleksjonsmarkør og genomiske fragmenter inn i en vektor ryggrad. Men en iboende begrensende faktor på tradisjonell kloning er posisjonering og valg av restriksjonsseter, spesielt med lengre DNA-sekvenser. Dette nødvendiggjør ofte flere subkloning trinn og introduserer også fremmede DNA-sekvenser i vektoren, noe som ofte fører til en lavere effektivitet av gen-målretting.
Recombineering (recombinogenic engineering) er en DNA engineering teknologi som overvinner disse begrensningene ved hjelp av homolog rekombinasjon (HR) mediert av fag rekombinasjon proteiner i E. coli-celler 11,12. Siden en region av en homolog sekvens kan tjene som et substrat av recombineering, er begrensninger av tilgjengeligheten av restriksjonsseter fjernes. Store DNA-sekvenser kan sømløst modifiseres direkte in vivo, og dermed også bevare sin strukturelle integritet 13. Recombineering er meget effektiv med korte homologier (50 bp) 14 og derfor homologi armer (HA) kan hensiktsmessig inkorporeres i syntetiske oligo-sekvenser. I et typisk eksperiment recombineering, en oligo- eller et dobbelt-trådet DNA (dsDNA) fragment inneholdende HA blir elektroporert inn i kompetente E. recombineering coli-celler inneholdende målet ligger enten på kromosomet eller på et plasmid 15. Rekombinasjon potensialet er gitt av induserbar uttrykk for Red recombination proteiner av fagen 16,17 eller RecET proteiner av rac profag 18. Røde / reče exonuclease konverterer lineære dsDNA til et enkelttrådet DNA (ssDNA) middels, som deretter bundet av sin partner, Rød / RECT, en enkelt-strandet annealing protein (SSAP) 19. Annealing av en lang eller en kort ssDNA oligo til dens komplementære target-sekvensen foregår på lagging tråd av replikasjons gaffelen og fører til inkorporering av sekvensen ved målstedet. Lagging tråd ssDNA rekombinasjon er grunnlaget for den høye effektiviteten av recombineering og kan beskrives ved "beta" rekombinasjon modell 20,21.
En typisk recombineering arbeidsflyt for å bygge et gen rettet vektor omfatter en av de to følgende ruter. En rute omfatter subkloning ønsket genomisk region fra et muse BAC-klon i et plasmid fulgt av sekvensiell innføring av loxP rekombinasjonsseter, en seleksjonsmarkør
Protocol
1. Gene Targeting Design
- Bestille en passende BAC klone dekker genomisk regionen av interesse. Sørg for at dette er isogen til type ES-celler til å bli endret for eksempel RPCI-23 og RPCI-24 BAC kloner for genet målretting med C57BL / 6 ES celler.
- Påfør vanlig genet målrettingskriteriene når du utformer den målretting vektor. Viktige parametere omfatter om modifikasjon er nødvendig for å være konstitutiv eller betinget, definere kritiske eksoner (CE) for sletting i et gen knockout strategi og avstand og plassering av intronic kassetter.
MERK: Hver av disse har vært diskutert i detalj andre steder 10. - Velg genomiske regioner hver på 5-6 kb flankerer målet modifisering nettstedet.
MERK: Størrelsen på subklonet innsatsen er derfor typisk 10-12 kb, selv om den øvre grensen kan være så høyt som 80 kb med et lavt kopi subkloning plasmid som p15A, pBR322 etc. og opptil 200 kb med BACvektor.
2. Multiplex Recombineering oligos
- Design oligos for plasmid ryggrad (subkloning plasmid) og seleksjonsmarkør (innsetting kassett). Utforme hver oligo slik at den inneholder 180 bp HA flankerende genomisk målstedet og 20 bp av spesifikk priming-sekvens av innføringskassetten eller subkloning plasmid (figur 2).
MERK: Homologiundersøkelser armene bør ikke inneholde noen repeterende elementer, vil tilstedeværelsen av repeterende elementer resultere i feil målretting og subkloning. Gjentatte elementer kan oppdages ved hjelp av web-baserte verktøy som '' Gjenta Masker ''. - Omfatter et unikt restriksjonsenzym (RE) område på en av de vektor oligoer for å linearisere genet rettet vektor for ES-celle målretting (figur 2).
- Sjekk oligo parametre ved hjelp av en oligo analysator program. Pass på å unngå sekundære strukturer i priming regions.
- Kortere HA (50 bp) av innførings kassetten tolerert og gir lavere antall rekombinanter men at subkloning plasmid HA er alltid lenger (180 bp).
- Bestemme retningen av genomisk DNA vedlegget til bestemte BAC klone ved hjelp av web-basert verktøy som '' cloneDB ''. Etablere retning av replikering fra Oris ved å sjekke kartet over BAC plasmid ryggrad brukt i BAC bibliotek konstruksjon.
MERK: Oris er vanligvis motsatt transkripsjons retning av Kloramfenikol (CHL) markør for alle vanlige BAC plasmider. - Legg to terminale fosfortioat (PTO) bindinger til 5'-enden av oligonukleotidet som er motsatt til retningen for replikasjon i BAC-klon. Legg til en 5'-fosfat modifikasjon av den omvendte oligo (figur 2).
MERK: Den asymmetriske phosphorothioated PCR kassett på Red fordøyelse genererer en ssDNA mellom som kan prime lagging strandav replikasjonsgaffelen.
MERK: Maksimal multiplex rekombinasjon frekvens er observert med lagging strand beskyttet kassetter. Ledende tråd beskyttet eller to beskyttede kassetter kan ikke produsere tilsvarende rekombinasjon effektivitet på noen loci. - Bestille oligos med PAGE eller HPLC rensing.
3. BAC Clone Transformation med pSC101 BADgbaA Recombineering Plasmid.
- For å gjøre E. coli-stammen som bærer BAC recombineering dyktig, forvandle den med pSC101 BADgbaA plasmid som inneholder de røde gener 16.
MERK: pSC101 BADgbaA plasmidet inneholder de røde og Reca gener under kontroll av Arabinose induserbare AraC-P BAD promoter, en tetracyklin seleksjonsmarkør og temperaturen sensitive pSC101 replikonsystemet.- Stikke en steril pipette tips i BAC agar kultur og vaksinere 5,0 ml lysogeni kjøttkraft (LB) pH 8,0 inneholdende 12,556 g ml -1 Chl. Vokse ved 37 ° C i 5 timer under rysting ved 200 rpm.
- Chill 10% (v / v) glycerol-løsning, mikrosentrifugerør og electroporation kyvetter på is. Kule en nedkjølt stor sentrifuge og mikro til 4 ° C.
- Bestem den optiske tetthet (OD) av kulturen ved hjelp av et spektrofotometer og måle absorbans ved 600 nm. Forbered elektrokompetente celler (som beskrevet nedenfor) ved en OD 600 avlesning på 0,3 til 0,8 er nådd.
- Spinne ned cellene i et 50 ml sentrifugerør i en stor sentrifuge ved 1216 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Vask cellene med 1 ml kjølt 10% glycerol og spinne ned cellene ved 17 949 xg i 20 sekunder ved 4 ° C. Utføre vasketrinn i alt 3 ganger.
- Resuspender cellene i et totalt volum på 50 pl av 10% glycerol og tilsett 10 til 200 ng av pSC101 BADgbaA recombineering plasmid. Skaff en enkelt celle suspensjon ved pipetteringopp og ned flere ganger og deretter overføre cellene til en pre-kjølt 1 mm gap elektroporering kyvette.
- Electroporate cellene med en innstilling på 1,8 kv, 25 uF og 200 Ω.
MERK: Sjekk de riktige innstillingene for hvert merke av electroporator. En tidskonstant på elektroporering mindre enn 4 indikerer tilstedeværelse av salt og andre urenheter. - Umiddelbart gjenvinne cellene i 1 ml LB og overføre cellene til en 50 ml sentrifugerør.
- Vokser BAC gbaA kultur ved 30 ° C i 2 timer under rysting ved 200 rpm.
MERK: pSC101 BADgbaA plasmidet tapt når cellene blir dyrket ved 37 ° C på grunn av inaktivering av den temperaturfølsomme Repe replikasjonsfaktor. Vokser gbaA celler ved 30 ° C for å opprettholde recombineering funksjoner. - Legg 9 ml LB inneholder 12,5 mikrogram ml -1 CHL og 4 mikrogram ml -1 tetracyklin (Tet) til den gjen BAC gbaA kultur. GrowBAC gbaA kultur O / N ved 30 ° C risting ved 200 rpm.
MERK: Omformingen effektiviteten electroporating den supercoil gbaA plasmid er tilstrekkelig høy til å tillate metning vekst O / N i flytende medier.
4. Utarbeidelse av Innsetting Kassetter og Subkloning Plasmider
- Å inkorporere HA i innsettings kassetten (e) og subkloning plasmid, utføre en polymerasekjedereaksjon (PCR) ved anvendelse av de lange modifiserte oligonukleotider som beskrevet nedenfor.
- Valgfritt: å hindre plasmid carry inn i recombineering reaksjon, må du bruke en R6K opprinnelse eller lignende smalt vertsområde plasmid mal for å forsterke innsetting kassett.
- Alternativt linearize plasmidet malen ved hjelp av en RE digest (tabell 2). Velg en RE som skjærer utenfor PCR forsterkning regionen og er varmeinaktivert. Heat inaktivere RE som anbefalt av Produksjonacturer.
- Sett opp polymerase kjedereaksjon (PCR) ved anvendelse av en høy-fidelity varmstart DNA polymerase system. Forberede en PCR mester blanding som beskrevet (Tabell 3). Utføre termiske sykluser som vist (tabell 3).
- Analyse av PCR-produkter ved agarosegel-elektroforese. Belastnings 1-5 ul av hver av PCR på en 1% (w / v) agarosegel inneholdende 0,5 mg ml -1 etidiumbromid (EtBr).
MERK: Tilstedeværelsen av uspesifikke amplifikasjonsproduktene ikke blande seg inn i recombineering reaksjon. I noen tilfeller kan imidlertid primer-dimerer redusere recombineering effektivitet. - Rense PCR produkter ved hjelp av en PCR rensing kit.
- Valgfritt: fjern plasmid mal fra PCRs ved behandling med DpnI fulgt av PCR opprydding. Elute DNA i et minimalt volum av sterilt avionisert vann (som anbefalt av produsenten).
MERK: Tilsetting av DpnI til urenset PCR reaksjoner resulterer i redusert effektivitet av spalting av the metylert plasmid DNA mal.
- Valgfritt: fjern plasmid mal fra PCRs ved behandling med DpnI fulgt av PCR opprydding. Elute DNA i et minimalt volum av sterilt avionisert vann (som anbefalt av produsenten).
- Kvantifisere PCR amplifisert DNA ved agarosegel-analyse mot et kjent sett av DNA-standarder, f.eks, λ Hindlll digest eller ved hjelp av et Nanodrop spektrofotometer.
5. Subkloning Plus Insertion
- Fortynne O / N BAC gbaA kultur 50 ganger ved å legge 200 pl i 10 ml LB + Chl + Tet. Vokse ved 30 ° C risting ved 200 rpm i 1 time 50 min. Omfatte en prøve for å bli brukt som negativ kontroll.
- Chill alle recombineering materialer og utstyr til 4 ° C som beskrevet i trinn 3.1.2.
- Hell LB agar plater inneholdende pH 8 i riktig konsentrasjon av den aktuelle selektive antibiotikum (r) som vil tillate valg av DNA-fragmentet som er satt inn, så vel som ved valg av subkloning vektor (tabell 4).
MERK: Noen antibiotika er pH sensitive. Bruk LBagar pH 8 som en regel. - Forberede en 10% (w / v) løsning av L-Arabinose. Filtrere sterilisere gjennom et 0,2 mikrometer sprøyte filter.
MERK: Arabinose induserer ekspresjon av recombineering proteiner fra gbaA plasmid. - Kontroller OD for BAC gbaA kulturen ved hjelp av et spektrofotometer. Når en OD 600 på 0,25 til 0,3 er nådd, indusere recombineering proteiner som beskrevet i det etterfølgende trinn.
- Tilsett 200 ul av 10% Arabinose oppløsning til 10 ml av BAC kulturen for å oppnå en sluttkonsentrasjon på Arabinose 0,2%. Omfatte en ikke-indusert kultur (uten Arabinose) til å bli brukt som negativ kontroll.
- Overfør BAC kulturen til en 37 ° C risteinkubator og indusere Red uttrykk for 45 min risting ved 230 rpm.
MERK: Expression of Red proteiner er ineffektiv ved 30 ° C. - Spinne ned cellene, og vaskes med 10% glycerol 3 ganger som beskrevet i trinn 3.1.5.
- Legg 600-1,000 ng hver av plasmid og subkloning innsettings kassetten (e) til recombineering reaksjonen. Inkluder en vektor bare og vektor pluss enkeltinnleggs kontroller for å sjekke rekombinasjon dyktighet og integritet av vektoren og kassettene.
- Oppnå en enkel cellesuspensjon ved å pipettere opp og ned. Utføre elektroporering som beskrevet i trinn 3.1.7 og påfølgende gjenvinning i 1 ml LB ved 37 ° C i 1 time for multi-kopierings plasmider eller i 10 ml LB ved 37 ° C i 3 timer for BAC-vektorer.
- Plate forskjellige fortynninger av den gjenvunnede kultur f.eks, 90%, 10%, 1% på de to agarplater og vokse ved 37 ° C i 16 timer.
6. Analyse av Rekombinanter
- Valgfritt: Plukk 6 til 12 kolonier og utføre koloni PCR ved hjelp av en HA flanke primer og et innstikk spesifikk primer. Inkluder subkloningen plasmid og innsetting casSette plasmid samt den overordnede BAC-klon som negative kontroller.
- Utføre agarosegel analyse av koloni PCRs. Identifisere positive kloner ved nærværet av en lysende bånd ved den forventede størrelse.
MERK: Den høye effektiviteten i SPI kloning prosessen genererer mest riktige rekombinanter.
- Utføre agarosegel analyse av koloni PCRs. Identifisere positive kloner ved nærværet av en lysende bånd ved den forventede størrelse.
- Pick kolonier i 5 ml LB pH 8 inneholdende det selektive antibiotikum og vokse O / N ved 37 ° C.
- Forbered DNA minipreps bruker en kolonne rensing kit i henhold til produsentens anvisninger.
- Forbered BAC miniprep-DNA ved bruk av standard fenol-kloroform isolasjon eller en lignende protokoll.
- Utføre RE fordøyer på miniprep DNA. Separat DNA ved agarosegel-elektroforese. Analyser RE mønstre for å identifisere kloner inneholdende de forventede størrelser av fragmenter riktig målretting vektor. Velge en RE som tydelig skiller mellom vektoren mangler innsatsen (e) og vektor inneholdende innsatsen (e).
- Optional: for å oppnå celler som er blottet av BAC, som fremdeles er tilstede i E. coli etter recombineering, bruker miniprep plasmid DNA for å forvandle DH5alpha eller DH10B E. coli-celler.
- Utføre DNA-sekvensering på tvers av HA og innsetting kassett for å sjekke oligo syntese feil.
Representative Results
Knockin Vektorer
Knockin målretting vektorer reflekterer behovet for å innføre en ny sekvens funksjon i genomet enkelt basepar-substitusjon i en protein-kodende region, fusjon av en fluorescerende markør eller en affinitetsmerkelapp for et protein eller integrering av et gen ekspresjonskassett inkludert. For å teste anvendelsen av SPI i Knockin vektorbyggestrategier, ble to ulike testtilfeller undersøkt. Dnttip1 koder deoxynucleotidyltransferase, terminal, i samspill protein 1A (TDIF1) som sammen med klassen jeg histondeacetylase (HDAC) danner en mitotisk deacetylase kompleks (Midac) 28. For å undersøke hvilken rolle Dnttip1 i celledeling, ble en tandem-affinitet tagging tilnærming tatt for å isolere TDIF1 samspill proteiner. Tidligere forsøk på å subklone et parti av Dnttip1-genet ved hjelp av en p15A vektor som inneholder lange homologi regioner resulterte i lav gap reparasjon effektivitet ennd hyppige avvikende rekombinasjon produkter (data ikke vist). Dermed bygging av en Knockin vektor på Dnttip1 locus gitt en utfordrende recombineering trening. En SPI strategi er designet for å subklone en 12 kb delen av Dnttip1 genet som strekker seg over den siste ekson (ekson 13) inn i en lav kopi p15A vektor og samtidig sette inn en dual affinitetsmarkør utvalg kassetten inn ekson 13, erstatte stoppcodonet (figur 3A ). Den 2X FLAG-kalmodulin bindende protein (CBP) knyttet FRT-PGK-EM7-neomycin (Neo) -BGhpA-FRT kassett (2,0 kb) ble forsterket fra en RE linearisert plasmid bruker dual PTO modifiserte oligos som inneholdt 120 bp HA flankerer Dnttip1 stoppkodonet. En p15A Zeo Dnttip1 subkloning vektor (1,7 kb) ble konstruert som inneholdt 200 bp regioner homologe til endene av Dnttip1 sekvensen som skal bli subklonet. Den Dnttip1 delkloning plasmid ble RE linearized og PCR forsterket ved hjelp av 20 bp endret oligossom genererte en ledende tråd beskyttet vektor. PCR produktene ble DpnI behandlet, renset og co-electroporated inn recombineering kompetent Dnttip1 BAC E. coli-celler, så vel som ikke-induserte kontrollceller. SPI reaksjonene ble sådd ut på Zeocin (Zeo) og kanamycin (Kan) som inneholder agar plater (Figur 3B). SPI produserte riktig modifisert Dnttip1 Knockin vektor i alle de 12 rekombinanter analysert (Figur 3C). DNA-sekvensering bekreftet fravær av eventuelle feil som følge av oligo syntese eller PCR forsterkning.
Et annet eksempel på SPI involvert i leseramme innsetting av en forbedret gul fluorescerende protein (EYFP) koblet valg kassetten ved P2rx1 genet. Den P2rx1-genet koder for en G-protein-koblet reseptor som virker som en ATP-gated ionekanal 29. Binding til YFP fluorescens tillater sporing av P2x1 reseptoren på celleoverflaten i various funksjonelle analyser. P2rx1 er en annen vanskelig locus som har presentert betydelige problemer med konvensjonelle recombineering metoder (data ikke vist). Ved hjelp av SPI, en 12 kb segment av P2rx1 genet som omfatter terminal ekson (ekson 12) ble subklonet inn en p15A Zeo vektor og modifisert med den felles innsetting av en EYFP -LoxP flankert Neo kassett erstatte stoppkodonet i ekson 12 for å konstruere P2rx1-EYFP Knockin vektor (Figur 3D). I dette eksemplet er lagging strand beskyttet p15A vektor (1,7 kb) inneholdt 230 bp HA og EYFP kassett inneholdt 50 bp HA og var også igjen uendret. Den EYFP innsetting kassett (2,7 kb) ble satt sammen av spleising overlapping PCR av EYFP genet, PCR amplifisert fra pEYFP-C1, og LoxP- PGK-EM7-Neo-BGhpA-loxP kassett, PCR amplifisert fra pL452 (NCI, Frederick) . SPI reaksjon produsert hundrevis av kolonier (data ikke vist). RE analyse av DNAminipreps fremstilt av 11 kloner viste flertallet inneholdt korrekt montert P2rx1-EYFP Knockin vektor (Figur 3E). Ytterligere kontroll av DNA-sekvensering viste feilfri innsetting av EYFP kassett. Men noen av klonene viste profiler av den ukodede gap reparert og de kodede gap reparert plasmider i den samme celle (kolonnene 6-9). Noen eksempler inneholdt også feilaktig gap reparert (kolonne 2) eller mistargeted plasmider (banene 4 og 5). Svikt i samtidige subkloning og målretting i noen SPI rekombinanter streker grensene for effektiv SPI kloning ved bruk av store kassetter (> 3 kb), som oppstår fra de føringer på Red processivity av lange DNA-fragmenter 30, eller hvis du bruker kort HA. Faktisk øker HA av EYFP kassett til 200 bp SPI øket effektivitet og den korrekte målretting av kassetten (data ikke vist). Gene målretting med P2rx1 - EYFP Knockin vektor i JM8.N4mus ES-celler (C57BL / 6 belastningen) generert 6 positive kloner av 96, som inneholdt det riktig målrettet P2rx1-EYFP sekvens (Figur 3F).
BAC Reporter Vektorer
En BAC klone av målet genet inneholder ofte alle nødvendige oppstrøms og nedstrøms regulatoriske elementer for eksempel, Forsterker, UTR etc. samt den endogene promoter å kjøre genuttrykk ved naturlige nivåer 31. En BAC reporter vektor er derfor den foretrukne kjøretøyet å rekapitulere den endogene ekspresjon mønster av et gen 32. Imidlertid, den store størrelsen på en BAC plasmid (opptil 200 kb) presenterer betydelige praktiske problemer med å transfektere en intakt BAC i celler 33. Reduksjon av størrelsen på BAC genomisk innskudd gjennom BAC trimming 34,35, samtidig som de nødvendige regulatoriske elementer av et gen, muliggjør lettere håndtering av BAC og resulterer i en mer effektiv transfectipå. Nåværende BAC engineering teknologi involverer flere runder med recombineering å oppnå dette målet 35. For å demonstrere nytten av SPI i BAC trimming, en pBeloBAC11 BAC-vektor ble anvendt for å subklone et 30 kb genomisk sekvens, inkludert den fulle lengde P2rx1 genet fra 168 kb P2rx1 BAC sammen med den samtidige innføring av en EYFP kassett i P2rx1-genet (figur 4A). Den pBeloBAC11 Zeo vektor ryggrad (6,5 kb) inneholder 180 bp HA ble PCR forsterket med modifiserte oligos som genererte en lagging strand beskyttet vektor. Det samme EYFP Neo kassett (3 kb), som brukes i den forrige P2rx1 Knockin vektor konstruksjon, var PCR forsterket ved hjelp av lagging strand beskyttet oligos inneholder 180 bp HA og målrettet P2rx1 ekson 12 erstatte stoppcodonet. Følgende kombinert elektroporering av EYFP kassett og pBeloBAC11 Zeo vektoren inn P2rx1 BAC celler expressing de gbaA recombineering proteiner, ble kulturen gjenvunnet i 10 ml LB pH 8 i 3 timer ved 37 ° C for å skille de BAC-plasmider. Rene rekombinanter ble utvalgt på Zeo og Kan-agar-plater og ble observert ved en frekvens på 2 x 10 -6. Koloni PCR genotyping analyse viste vellykket BAC trimming i 3 av 6 kloner som ble analysert (figur 4b). Lang rekke PCR-amplifisering på tvers av EYFP innføringsstedet bekreftet den korrekte kassett inkorporering i de tre positive kloner (figur 4b). De tre kloner som mangler EYFP innsatsen var også feilaktig gap reparert ved 5'-enden, selv om årsaken til mistargeting av EYFP kassetten i disse kloner kan være separat til korrekt lukking av 5 'enden BAC. De tre EYFP positiv BAC kloner ble videre analysert med RE fordøyer og viste en forventet av riktig trimmet EYFP rekombinant BAC (Figur 4C </ Strong>). Sekvensanalyse viste fravær av feil i EYFP kassetten i bare en klon av de tre positive.
Betinget Knockout (CKO) Vektorer
Betinget ablasjon av genuttrykk er et viktig verktøy for å undersøke utviklingsprosesser eller for å studere biologiske systemer på et bestemt tidspunkt. En betinget gen knockout strategi innebærer typisk plassering av loxP rekombinasjonsseter rundt en kritisk ekson (CE). Slettingen av et CE ved Cre ekspresjon eller aktivisering frembringer en rammeskift og for tidlig stoppkodon, noe som resulterer i nedbrytning av mRNA som følge av nonsens-mediert nedbrytning (SD). Byggingen av en betinget gen målretting vektor er en kompleks oppgave og involverer flere trinn på subkloning, målretting og transformasjon 22. SPI tilbyr en praktisk rute for å forenkle denne prosessen. Som en test, ble en betinget allel av Zrsr2 genet konstruerthjelp av SPI metodikk (Figur 5A). Den Zrsr2-genet koder for et spleise faktor og en enkelt kopi ligger på X-kromosomet. Den betingede status for genet delesjon er spesielt viktig i dette tilfellet for å kontrollere for muligheten av celler tilpasse på mangelen på Zrsr2 under ES celle utvalg i en konstitutivt genet delesjon målrettingsstrategien. SPI ble utført for å subklone et 10 kb-delen av genet ZrSr2 med samtidig innføring av to forskjellige loxP flankert seleksjons kassetter. Den FRT-PGK-EM7-Neo-FRT-loxP kassett (2 kb) ble PCR amplifisert fra RE fordøyd pL451 bruker lagging strand beskyttet oligos som inneholdt 180 bp HA rettet mot ZrSr2 intronet 2. En annen kassett som inneholder Rox-PGK-em7- Blasticidin (Bsd) -Rox-loxP (2 kb) ble PCR amplifisert fra en R6K plasmid med lagging strand beskyttet oligos inneholder 180 bp HA identisk med en nedstrøms region i intron 3. De to loxP sider flankert ekson 3, CE hvis dSLETTING på betinget Grobunn aktiverings resulterer i et rammeskifte og introduserer en tidlig stopp kodon. Den Zrsr2 subkloning plasmid (1,6 kb) ble PCR-amplifisert fra et RE linearisert p15A Zeo plasmid ved bruk henger streng beskyttet oligoer som inneholdt 180 bp HA samsvarende endene av det 10 kb Zrsr2 sekvens. SPI-reaksjoner ble utført som beskrevet tidligere og plettert på Zeo + Neo + BSD platene. Den ZrSr2 betinget målretting vektor ble vellykket montert i de fleste av de 12 rekombinanter undersøkt (figur 5b). Ytterligere DNA-sekvensering analyse viste riktig innsetting av både markeringsindikatorene i ZrSr2 CKO vektor.
Figur 1. SPI kloning. Oversikt over SPI kloningsprosessen kombinere kassett innsetting og subkloning i et enkelt trinn. (A) BAC klone er transformed med pSC101 BADgbaA plasmid og dyrket ved 30C. (B) Etter arabinose induksjon til å uttrykke de røde proteiner, blir den asymmetriske endret innsetting kassett og Subkloning plasmid introdusert i BAC klone og valgt med både innsetting og Subkloning markører for å generere den endelige vektor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Skjematisk viser utformingen av SPI recombineering oligoer. Den subkloning plasmid og innføring kassett er begge generert ved hjelp av PCR ved anvendelse av en kombinasjon av kraftuttaksterminal og fosfat-modifiserte oligonukleotider. PCR-fragmentet ved Red fordøyelse in vivo, frembringer et ssDNA mellomprodukt, som hybridiserer til den forsinkede tråden av replikasjonsgaffelen. Gene spesifikk HA fra 50 til 180 bp er innlemmet i hver oligo som vist. Pilen viser retningen av DNA replikasjon over en kandidat genet. Den stiplede linje representerer subkloning plasmid-sekvens ikke innlemmet i PCR-produktet. RE nettsted, restriksjonsenzymsete av linea av endelig vektor; F, forover-sekvens (20 bp) som er spesifikke for subkloning plasmid eller innsetting av kassetten; R, reverse komplement-sekvensen (20 bp) av plasmidet eller kassett; sm, seleksjonsmarkør. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. SPI muliggjør bygging av vanskelige Knockin vektorer. (A) Skjematisk av SPI-strategi som brukes i konstruksjonen av Dnttip1 dobbelt merket vektor. Arrow indicates retning av replikering på BAC klone. (B) Plating resultatene av de ikke-induserte og induserte prøver av Dnttip1 SPI eksperiment. (C) EcoRI sammendrag av Dnttip1 SPI kloner. M, en kb stige (NEB); C, p15A Dnttip1 gap reparert plasmid mangler den doble tag kassett. Fragment størrelser er: merket, 9,2 + 4,4 + 2,2 kb; kontroll; 9.2 + 4.6 kb. (D) SPI basert P2rx1-EYFP Knockin vektor konstruksjon. (E) EcoRI fordøye av P2rx1-EYFP SPI kloner. M, en kb + ladder (Invitrogen); C, p15A P2rx1 gap reparert plasmid mangler EYFP kassett. Fragment størrelser er: merket, 8,3 + 4,4 + 3,1 + 0,03 kb; kontroll; 8.3 + 3.1 + 1.8 + 0,03 kb (F) Southern blot analyse av P2rx1 -. EYFP genet målretting i JM8.N4 ES celle celler. Toppanelet, Southern blot med 3 'enden sonde hjelp PshAI fordøye. Vist er den screening resultat av fem kloner. Nedre panelet, Southern blot hjelp5'-ende probe og Spel-digest av positive identifisert fra 3'-enden screening. PshAI RE nettsted; S, Spel RE nettstedet. Den stiplede linje representerer den ende av vektoren HA. Svart boks betegner sørlige sonde. Ventede restriksjonsfragmenter er, PshAI: WT, 8,9 kb; EYFP-neo, 11,5 kb; Spel:. WT, 6,9 kb; EYFP-neo, 7,6 kb Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Forenklet BAC trimming hjelp SPI. (A) Skjematisk illustrerer begrepet BAC trimming hjelp SPI. Nøkkel til symbolene er beskrevet i figur 1. (B) PCR-amplifisering på tvers av 5 'og 3' ender av subklonet innsatsen og over P2rx1-EYFP insertion nettstedet. Screeningstrategi er vist for hver type av PCR. M (øverste panel), Hyperladder 25 bp, (bunnplater), 1 kb +; P, P2rx1 BAC; . S, pBeloBAC11 Zeo delkloning plasmid (C) HindiII fordøye av de tre EYFP positive SPI BAC kloner fra (B); E, ventes HindiII begrensning mønster av den trimmede EYFP BAC. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Betinget knockout vektor generasjon bruker SPI kloning. (A) Skjematisk av samtidige innsetting av to forskjellige loxP flankert utvalgs kassetter under subkloning av Zrsr2 allel. Nøkkelen til symboler er beskrevet i figur 1. (B) </ Strong> EcoRI- oppsummeringer av Zrsr2 SPI kloner. L, en kb stige (NEB); C1, p15A ZrSr2 gap reparert plasmid, C2, p15A ZrSr2 gap reparert plasmid som inneholder neo innsats; C3, p15A ZrSr2 gap reparert plasmid som inneholder bsd innsatsen. Fragment størrelser er: CKO, 7,7 + 2,9 + 2,6 + 1,6 kb; C1, 7,7 + 4,0 kb; C2, 7,7 + 4,3 + 1,6 kb; C3, 7,7 + 2,9 + 2,3 kb. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Ingen av trinnene | Konvensjonell recombineering rørledning en | Multiplex recombineering b |
| Trinn 1 | Transformasjon av recombineering plasmid inn BAC verten | Transformasjon av recombineering plasmid inn BAC vert. Utarbeidelsen av målretting kassetter og Subkloning vektorer. |
| Trinn2 | Innsetting av R1 / R2 Gateway kassett | Multiplex gap reparasjon kloning |
| Trinn 3 | Innsetting av floxed Kan kassett | O / N kultur fra enkeltkolonier |
| Trinn 4 | Gap reparasjon i R3 / R4 plasmid | Plasmid forberedelse og verifisering |
| Trinn 5 | Transformasjon til Cre + E. coli | |
| Trinn 6 | Plasmid forberedelse og verifisering | |
| Trinn 7 | O / N treveis Gateway reaksjon | |
| Trinn 8 | Transformasjon av treveis Gateway reaksjon i DH10B E. coli-celler | |
| Trinn 9 | Overnatter kultur fra enkeltkolonier | |
| Trinn 10 | Plasmid forberedelse og sekvens verifisering | |
| b Gjennomsnittlig tid av fire dager til bekreftet klone | ||
Tabell 1: Sammenligning av konvensjonell recombineering med SPI i konstruksjonen av betingede knockout vektorer.
| RE buffer | 5 mL |
| DNA | 1 mikrogram plasmid eller rensede PCR-produkter |
| RE | En mikroliter (5 enheter eller mer) |
| TE | opp til 50 ul |
| Inkuber ved 37 ° C i minst 1 time. Varm inacitvate i henhold til produsentens instruksjoner | |
Tabell 2: RE fordøye.
| PCR materialer | Sluttkonsentrasjon |
| PCR-buffer | 1x |
| dNTP | 200 nM |
| MgSO4 | 1,5 mm |
| Betain | 1,3M |
| DMSO | 1% |
| Forward primer | 200 nM |
| Revers primer | 200 nM |
| DNA-polymerase | 1 U |
| Mal | 10 ng av multikopiplasmider eller 2,5 mL av miniprep DNA for genotyping PCRs |
| Vann | opp til 50 pl en |
| a For en standard 50 mL PCR reaksjon med multikopiplasmider. Lang rekkevidde genotyping PCR ble satt opp i 25 mL PCR reaksjoner. | |
| PCR-betingelsene | |
| 95 ° C | 2 min |
| 92 ° C | 10 sek |
| 55 ° C | 30 sek |
| 72 ° C | 30 sek |
| 30 sykluser b | |
| b Cycle ikke kan utvides til 35 for BAC PCR genotyping | |
Tabell 3: PCR oppsett og betingelser.
| Antibiotika | Konsentrasjon en (mikrogram ml -1) |
| Ampicllin | 50 |
| Blasticidin b | 40 |
| Kloramfenikol | 12.5 |
| Gentamicin | 2 |
| Hygromycin c | 30 |
| Kanamycin b | 15 |
| Tetracyklin | 4 |
| Trimetoprim c | 10 |
| Zeocin | 5 |
| en Anbefales for bruk med BACS og multikopiplasmider når det brukes i kombinasjoner i multiplex recombineering | |
| b Blasticidin (35 ug ml -1) og kanamycin (6 ug ml -1) når de brukes sammen i kombinasjon | |
| c Hygromycin og Trimetoprim er ikke anbefalt for utvalg med løssalgs BACS. | |
Tabell 4 Anbefalt. Antibiotika konsentrasjoner for bruk i SPI eksperimenter.
Discussion
Bygging av ES cellelinjer og musemodeller har historisk involvert genet målretting hjelp plasmidkonstruksjoner som inneholdt den modifiserte allelet 4. Imidlertid har konstruksjon av disse komplekse gen rettet mot svektorer viste seg å være en signifikant flaskehals i riktig fremstilling av slike modeller. Utviklingen av recombineering basert vektorbygge strategier har tillatt forbedrede vektor design og mer effektiv vektor montering. Likevel, dagens recombineering protokoller fortsatt involverer flere trinn, krever middels plasmid rensing og bruke ulike bakteriestammer. Subkloning pluss innsetting tilbyr en ny tilnærming til vektorkonstruksjon som kan utføres i en elektroporering arrangementet i den fastboende BAC vertsstammen. Nytten av SPI i genet målretting ble testet her i en rekke vektorkonstruksjons applikasjoner. I alle tilfeller som ble undersøkt her, SPI vist seg å være effektiv, og den korrekte rekombinant plasmid ble fremstilt.I de fleste tilfellene ble de flere forskjellige kassetter korrekt satt i målretting vektor. Store DNA kassetter og vektorer ble enkelt innlemmes i SPI-protokollen og demonstrerte fleksibiliteten i dette systemet.
SPI er avhengig av bruk av lange homologi sekvenser og fosfortioat (PTO) beskyttelse av de lineære DNA-kassetter. PTO modifikasjon confers beskyttelse mot eksonukleaser til det lineære DNA 20,21 og den lange HA øker effektiviteten rekombinasjon for å tillate multipleksing. Imidlertid syntese av lengre oligo-sekvenser øker sjansene for å akkumulere feil særlig delesjoner. Mutasjoner i oligo kan være særlig skadelig hvis de dekker protein-kodende regioner. DNA-sekvensering på tvers av HA og dekker full lengde på den innsatte kassetten er sterkt anbefalt å eliminere kloner med noen sekvensendringer. Anvendelse av et høy-fi-DNA-polymerase-systemet er også foreslått for å unngå innføring av eny PCR feil. Lengden og sammensetningen av HA for subkloning plasmid er mer kritisk i forhold til den for innsetting kassetten (data ikke vist). For spesielt sensitive applikasjoner som bygging av Knockin vektorer, hvor eventuelle mutasjoner i ekson regioner ikke blir tolerert, kan HA for innsettings kassett forkortes (50-120 bp) for å unngå problemer i forbindelse med lange oligos. Innførings kassetten kan også stå umodifisert eller dobbelt phosphorothioated (hvor kunnskap om retningen av replikasjon er ikke tilgjengelig). Men multipleksing i disse tilfellene fortsatt krever lang beskyttet HA Subkloning plasmider. En påminnelse av denne strategien er senking av multipleksing effektivitet som potensielt kan påvirke SPI kloning på forskjellige loci.
Lengden av innførings kassett og subkloning plasmidet er en annen viktig parameter i SPI kloning. Større DNA-molekyler electroporate mindre effektivt og effekten er kumulativ, gitt rekravet for å innføre alle kassettene i den samme cellen (data ikke vist). Multipleksing er mest effektiv med mindre innsetting kassetter. DNA fragmenter større enn 3 kb også plassere en grense på Red mediert ssDNA behandling, som er mest effektive opp til 3 kb 30. Innsetting kassetter som overstiger 3 kb er dual resected og rekombinerer mindre effektivt via en beta uavhengig bane 20. Derfor blir screening av tilstrekkelige kolonier for å identifisere den riktige klone viktig i disse tilfellene. En lengre varighet av rekombinasjon post elektroporering øker også sjansene for utvinning av riktig klone i vanskelige SPI øvelser. Opp til fire små kassetter (<1,5 kb) kan settes inn samtidig med SPI prosessen, selv om multipleksing virkningsgrad avtar med hver ekstra kassett (data ikke vist). Imidlertid gjenspeiler dette utfallet av en optimal SPI eksperiment, og det er tilrådelig å vurdere grensene for multipleksing ved hjelp av mange store kassetter. Utviklingen av genom redigeringsverktøy som klynget regelmessig avbrutt av korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) -cas9 endonuclease systemet har aktivert etableringen av nye genom modifikasjoner og har ført til mer effektiv genom ingeniør 36. Imidlertid har disse nyere teknologi suppleres gene targeting vektorer snarere enn fortrengt dem. Det er tenkt at CRISPR-cas system kan erstatte antibiotika utvalg og ytterligere forbedre multipleks recombineering protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
|
| Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
| C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
| KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
| L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
| Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
| QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
| Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |
References
- Dovey, O. M., Foster, C. T., Cowley, S. M. Histone deacetylase 1 (HDAC1), but not HDAC2, controls embryonic stem cell differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 8242-8247 (2010).
- Harvey, M., et al. Spontaneous and carcinogen-induced tumorigenesis in p53-deficient mice. Nat. Genet. 5, 225-229 (1993).
- Waterhouse, P., et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4. Science. 270, 985-988 (1995).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
- Hasty, P., Rivera-Pérez, J., Bradley, A. The length of homology required for gene targeting in embryonic stem cells. Mol. Cell. Biol. 11, 5586-5591 (1991).
- Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination. Nature. 317, 230-234 (1985).
- Hirata, R., Chamberlain, J., Dong, R., Russell, D. W. Targeted transgene insertion into human chromosomes by adeno-associated virus vectors. Nat. Biotechnol. 20, 735-738 (2002).
- Szostak, J. W., Orr-Weaver, T. L., Rothstein, R. J., Stahl, F. W. The double-strand-break repair model for recombination. Cell. 33, 25-35 (1983).
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309, 255-256 (1984).
- Fu, J., Teucher, M., Anastassiadis, K., Skarnes, W., Stewart, A. F. A recombineering pipeline to make conditional targeting constructs. Methods Enzymol. Soriano, P. M., Wassarman, P. M. 477, Academic Press. 125-144 (2010).
- Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J., Stewart, A. A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nat. Genet. 20, 123-128 (1998).
- Copeland, N., Jenkins, N., Court, D. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
- Muyrers, J., Zhang, Y., Testa, G., Stewart, A. Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination. Nucleic Acids Res. 27, 1555-1557 (1999).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5978-5983 (2000).
- Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nature Protoc. 4, 206-223 (2009).
- Wang, J., et al. An improved recombineering approach by adding RecA to λ red recombination. Mol. Biotechnol. 32, 43-53 (2006).
- Datta, S., Costantino, N., Court, D. L. A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria. Gene. 379, 109-115 (2006).
- Fu, J., et al. Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting. Nat. Biotechnol. 30, 440-446 (2012).
- Muyrers, J., Zhang, Y., Buchholz, F., Stewart, A. RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners. Genes Develop. 14, 1971-1982 (2000).
- Maresca, M., et al. Single-stranded heteroduplex intermediates in lambda Red homologous recombination. BMC Mol. Biol. 11, 54 (2010).
- Mosberg, J. A., Lajoie, M. J., Church, G. M. Lambda Red recombineering in Escherichia coli occurs through a fully single-stranded intermediate. Genetics. 186, 791-799 (2010).
- Liu, P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations. Genome Res. 13, 476-484 (2003).
- Chan, W., et al. A recombineering based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction. Nucleic Acids Res. 35, e64 (2007).
- Zhang, Y., Muyrers, J. P. P., Testa, G., Stewart, A. F. DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 18, 1314-1317 (2000).
- Lee, E. C., et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA. Genomics. 73, 56-65 (2001).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
- Valenzuela, D. M., et al. High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat. Biotechnol. 21, 652-659 (2003).
- Bantscheff, M., et al. Chemoproteomics profiling of HDAC inhibitors reveals selective targeting of HDAC complexes. Nat. Biotechnol. 29, 255-265 (2011).
- Mulryan, K., et al. Reduced vas deferens contraction and male infertility in mice lacking P2X1 receptors. Nature. 403, 86-89 (2000).
- Subramanian, K., Rutvisuttinunt, W., Scott, W., Myers, R. The enzymatic basis of processivity in lambda exonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 1585-1596 (2003).
- Antoch, M. P., et al. Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue. Cell. 89, 655-667 (1997).
- Rostovskaya, M., et al. Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells. Nucleic Acids Res. 40, e150 (2012).
- Giraldo, P., Montoliu, L. Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals. Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).
- Hill, F., et al. BAC trimming: minimizing clone overlaps. Genomics. 64, 111-113 (2000).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339, 819-823 (2013).
