Introduction
Развитие генных технологий, направленных на позволило строительство клеточных линий и моделей мышей, чтобы исследовать различные биологические системы 1-3. Первым ключевым этапом в модификации геномной последовательности проектирование и строительство гена вектора направленного 4. Ориентация векторы плазмидные конструкции, которые несут аллель интерес, содержащие целевой модификации (ы) фланкированные маркера селекции (например, неомицин) и длинные геномные области, необходимые для эффективного гомологичной рекомбинации в клетках млекопитающего 5. Точное модификации гена достигается путем введения вектора направленного в эмбриональных стволовых (ЭС) клеток 6 или 7 соматических клеток, в результате чего гомологичной рекомбинации между идентичными участками ДНК-последовательности на адресным переносчиком и геномные Результаты локусе передачи предполагаемого модификации в геноме по конверсии генов 8. Такое modifiред ЭС клетки могут быть введены в бластоцисты мыши, чтобы производить потомство (химеры), которые могут затем передать эти измененные аллели через зародышевую линию 9. Альтернативный путь для получения трансгенных мышей предполагает микроинъекции вектора экспрессии генов в одноклеточных зигот мыши, что приводит к случайной интеграции вектора в геном мыши 10. Традиционные методы формирования вектора полагались на обычных "вырезать и вставить 'клонирования с использованием ферментов рестрикции и лигазы ДНК, чтобы клонировать другого маркера выбора и геномных фрагментов в вектор позвоночника. Тем не менее, присущие ограничивающим фактором традиционных клонирования является позиционирование и выбор сайтов рестрикции, особенно с более длинных последовательностей ДНК. Это часто требует нескольких шагов Пересев а также вводит посторонние последовательности ДНК в вектор, который часто приводит к снижению эффективности генного таргетинга.
Recombineering (recombinogenic ENGineering) является ДНК инженерные технологии, которая преодолевает эти ограничения с помощью гомологичной рекомбинации (HR), опосредованного фага рекомбинации белков в E. палочки клетки 11,12. Поскольку любой участок гомологичной последовательности может служить в качестве субстрата recombineering, ограничения доступности сайтов рестрикции удаляются. Большие последовательности ДНК могут быть легко изменены непосредственно в живом организме, таким образом, также сохраняя свою структурную целостность 13. Recombineering очень эффективно с короткими гомологии (50 п.н.) 14 и, следовательно, плечами гомологии (HA) может быть легко включены в синтетические последовательности олиго. В типичной recombineering эксперимента, олиго или двухцепочечной ДНК (дц) фрагмент, содержащий га электропорации в recombineering компетентным Е. палочки клетки, содержащие цели, находящейся либо на хромосоме или на плазмиде 15. Рекомбинация потенциал присуждается индуцируемой экспрессии Красной рекную комбинацию белков фага 16,17 или на RecET белки РАК профага 18. Красный / Rece экзонуклеазную преобразует линейные диДНК к одноцепочечной ДНК (оцДНК) промежуточное соединение, которое затем связывается с его партнером, красный / прямоугольник, одноцепочечной белка отжига (SSAP) 19. Отжиг длительного оцДНК или короткого олигонуклеотида к его комплементарной последовательностью-мишенью происходит на отстающей цепи репликативной вилки и приводит к включению последовательности в сайте-мишени. Отстающей нити оцДНК рекомбинации является основой высокой эффективности recombineering и может быть описана "бета" рекомбинация модели 20,21.
Типичный recombineering рабочий процесс, чтобы построить ген ориентации вектора включает в себя один из двух следующих путей. Один маршрут включает субклонирования желаемого геномной область из мышиного клона ВАС в плазмиду с последующим последовательным включением LoxP рекомбинации сайтов, селективный маркер
Protocol
1. Ген Ориентация дизайн
- Заказать соответствующее BAC клон, охватывающий области геномной интересов. Убедитесь, что это изогенных от типа ЭС клеток, которые будут модифицированы, например, RPCI-23 и RPCI-24 ВАС-клонов для гена ориентации с C57BL / 6 ES-клеток.
- Применить обычный ген критерии таргетинга при проектировании вектора направленного. Основные параметры включают в себя, требуется ли модификация быть конститутивным или условной, определения критических экзонов (CE) для удаления в стратегии генной нокаутом, и расстояние и размещения интронных кассет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый из них был подробно обсуждаются в других 10. - Выберите геномных областей, каждая из 5-6 кб флангового адресованной модификации сайта.
Примечание: Размер субклонированных вставки Поэтому, как правило, 10-12 т.п.н., хотя верхний предел может быть выше, чем 80 т.п.н. с низким копии плазмиды, такие как субклонирования p15A, pBR322, и т.д., и до 200 кб с BACвектор.
2. Мультиплекс Recombineering олигонуклеотиды
- Дизайн олигонуклеотиды для плазмиды позвоночника (субклонирование плазмиды) и селективного маркера (вставки кассеты). Конструкция каждого олигонуклеотида таким образом, что он содержит 180 п.о. HA фланкирующей геномной целевой сайт и 20 п.н. определенной последовательности грунтовочного кассеты вставки или субклонирования плазмиды (рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: гомологии оружие не должно содержать никаких повторяющихся элементов, наличие повторяющихся элементов приведет к неправильному адресности и субклонировании. Повторяющиеся элементы могут быть обнаружены с помощью веб-основе таких инструментов, как '' Повторите Masker ''. - Включите уникальный фермент рестрикции (RE) сайта на одном из векторных олигонуклеотидов для линеаризации вектор генного таргетинга для ES клеток целеполагания (рис 2).
- Проверьте параметры олиго с помощью программы анализатора олиго. Будьте осторожны, чтобы избежать вторичных структур в грунт областис.
- Короче HA (50 п.н.) из кассеты для вставки переносится и дает меньшее число рекомбинантов, но гарантировать, что ГА субклонирование плазмиду всегда больше (180 п.н.).
- Определить ориентацию геномной ДНК-вставки конкретного клона ВАС с использованием веб-основе инструменты, такие как '' cloneDB ''. Установите направление репликации из Oris, проверив карту плазмиды позвоночника ВАС использовано в библиотеке строительства ВАС.
ПРИМЕЧАНИЕ: Oris, как правило, напротив транскрипции направлении хлорамфеникол (CHL) маркера для всех обычно используемых плазмид ВАС. - Добавить две концевые фосфоротиоат (ВОМ) связи с 5'-конца от олиго, противоположном направлению репликации на ВАС-клона. Добавить 5 'фосфат модификация А в обратном олиго (рис 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: асимметричная phosphorothioated кассета ПЦР на Красной пищеварения генерирует онДНК промежуточный продукт, который может премьер отстающей нитивилки репликации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная мультиплекс частота рекомбинации наблюдается с отстающей нити охраняемых кассет. Ведущей нити защищен или два охраняемых кассеты не может эквивалентные эффективности рекомбинации в какой-то локусам. - Заказать олигонуклеотидов со страницей или ВЭЖХ.
3. ВАС-клон преобразование с pSC101 BADgbaA Recombineering плазмиды.
- Для того, чтобы E. Штамм, несущий ВАС recombineering опытный, превратить его с помощью плазмиды pSC101 BADgbaA, содержащей Красные гены 16.
ПРИМЕЧАНИЕ: pSC101 BADgbaA плазмида содержит гены Red и гее под контролем арабинозой индуцибельного ARAÇ-P BAD промотор, выбора тетрациклин маркера и чувствительных к температуре pSC101 репликоне.- Stab стерильный наконечник пипетки в BAC агаре и привить 5,0 мл лизогении бульона (LB) pH 8,0, содержащий 12,556; г мл -1 КХЛ. Выращивают при температуре 37 ° С в течение 5 ч встряхивания при 200 оборотах в минуту.
- Холод 10% (V / V) раствора глицерина, микроцентрифужных пробирок и электропорации кюветы на льду. Охлаждают в холодильнике большой центрифуги и микроцентрифужные до 4 ° С.
- Определение оптической плотности (OD) культуры с использованием спектрофотометра и измерения оптической плотности при 600 нм. Подготовка Электрокомпетентные клетки (как описано ниже), когда OD 600 чтение 0,3 до 0,8 достигается.
- Спин вниз клетки в 50 мл центрифужную пробирку в большом центрифуге при 1216 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
- Промыть клеток с 1 мл охлажденного 10% глицерина и спином вниз клетки при 17949 х г в течение 20 сек при 4 ° С. Выполнение стирки шаг в общей сложности 3 раза.
- Ресуспендируют клеток в общем объеме 50 мкл 10% глицерина и добавить 10-200 нг плазмиды recombineering pSC101 BADgbaA. Получение суспензии отдельных клеток с помощью пипеткивверх и вниз несколько раз, а затем перенести клетки с предварительно охлажденной 1 мм зазора электропорации кюветы.
- Электропорации клеток с установкой 1,8 кВ, 25 мкФ и 200 Ω.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте правильность настроек для каждой марки электропоратора. Постоянная времени электропорации менее 4 указывает на наличие соли и другие примеси. - Немедленное восстановление клеток в 1 мл LB и передачи клеток в 50 мл центрифужную пробирку.
- Выращивают на ВАС gbaA культуры при 30 ° С в течение 2 ч перемешиванием при 200 оборотах в минуту.
Примечание: pSC101 BADgbaA плазмиду теряется, когда клетки выращивают при 37 ° С из-за инактивации фактора чувствительных к температуре REPE репликации. Выращивают gbaA клеток при 30 ° С для поддержания функций recombineering. - Добавить 9 мл LB, содержащих 12,5 мкг мл -1 КХЛ и 4 мкг мл -1 тетрациклин (TET) в восстановленной BAC gbaA культуры. ВыраститьBAC gbaA культура O / N на 30 ° C встряхивании при 200 оборотах в минуту.
ПРИМЕЧАНИЕ: эффективность преобразования электропорации в Суперспиральная gbaA плазмиды достаточно высокой, чтобы позволить рост насыщения O / N в жидких средах.
4. Подготовка вставки кассеты и Пересев плазмид
- Для включения HA в кассету для вставки (ов) и субклонирования плазмиды, выполнить полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием модифицированных олигонуклеотидов длиной, как описано ниже.
- Дополнительно: для предотвращения плазмиды вынос в реакцию recombineering, используйте происхождение R6K или аналогичный шаблон узкий диапазон хозяина плазмиды для амплификации кассету.
- Кроме того, линеаризации плазмиды шаблон, используя дайджест RE (таблица 2). Выберите RE который режет вне области усиления ПЦР и является термоинактивированной. Тепло инактивировать RE в соответствии с рекомендациями Изготacturer.
- Установка полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием системы полимеразной горячего старта ДНК с высокой точностью воспроизведения. Подготовка мастер-микс ПЦР, как описано (таблица 3). Выполните Амплифицируйте как показано на рисунке (таблица 3).
- Анализ продуктов ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле. Нагрузка 1-5 мкл из каждой ПЦР на 1% (вес / объем) агарозном геле, содержащем 0,5 мг мл -1 бромистый этидий (EtBr).
ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие неспецифических продуктов амплификации не вмешивается в реакции recombineering. В некоторых случаях, однако, праймеров димеры могут снизить эффективность recombineering. - Очищают продукты ПЦР с использованием набора для очистки ПЦР.
- Дополнительно: удалить шаблон плазмиды из МКП обработкой DpnI с последующим ПЦР очистки. Элюировать ДНК в минимальном объеме стерильной деионизированной воды (в соответствии с рекомендациями производителя).
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление ДПНИ неочищенных ПЦР-реакции приводит к снижению эффективности расщепления гое шаблон метилированы ДНК плазмиды.
- Дополнительно: удалить шаблон плазмиды из МКП обработкой DpnI с последующим ПЦР очистки. Элюировать ДНК в минимальном объеме стерильной деионизированной воды (в соответствии с рекомендациями производителя).
- Количественная ПЦР-амплификации ДНК путем анализа на агарозном геле с известным набором стандартов ДНК например, λ HindIII Digest или с помощью спектрофотометра NanoDrop.
5. Субклонирование Plus Вставка
- Развести O / N ВАС-gbaA культура 50 раз, добавляя 200 мкл в 10 мл LB + Хл + Tet. Растут на 30 ° С встряхивании при 200 оборотах в минуту в течение 1 часа 50 мин. Включить образец для использования в качестве отрицательного контроля.
- Холод все recombineering материалы и оборудование до 4 ° С, как описано в стадии 3.1.2.
- Налейте LB-агар рН 8 пластины, содержащие правильную концентрацию соответствующего селективного антибиотика (ов), что позволит выбор фрагмента ДНК, которая вставлена, а также для выбора субклонирования вектора (Таблица 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые антибиотики рН чувствительной. Использование LBагар рН 8, как правило. - Подготовка 10% (вес / объем) раствор L-арабинозы. Фильтр стерилизуют через шприцевой фильтр 0,2 мкм.
Примечание: арабиноза индуцирует экспрессию белков recombineering из плазмиды gbaA. - Проверьте OD БАКа gbaA культуры с помощью спектрофотометра. После того, как наружным диаметром 600 0,25-0,3 достигается, индуцируют recombineering белки, как описано на следующей стадии.
- Добавить 200 мкл 10% раствора арабинозы к 10 мл культуры ВАС, чтобы достичь конечной концентрации арабинозы 0,2%. Включить неиндуцированных культуры (без арабинозы) для использования в качестве отрицательного контроля.
- Передача ВАС культуру в 37 ° C пожимая инкубатор и вызвать Red выражение для 45 мин встряхивания при 230 оборотах в минуту.
Примечание: Выражение красных белков неэффективно при 30 ° С. - Спин вниз клетки и промывают 10% глицерина в 3 раза, как описано выше в стадии 3.1.5.
- Добавить 600-1,000 нг каждого из субклонирования плазмиды и кассету (ы) для вставки в реакции recombineering. Включите только вектором и вектором плюс отдельные элементы управления вставки для проверки рекомбинации знания и целостность вектора и кассет.
- Получение суспензии отдельных клеток с помощью пипетки вверх и вниз. Выполнение электропорации, как описано выше в стадии 3.1.7 и последующего восстановления в 1 мл LB при 37 ° С в течение 1 часа для нескольких копий плазмид или в 10 мл LB при 37 ° С в течение 3 ч для ВАС векторов.
- Пластинчатые различные разведения восстановленного культуры, например, 90%, 10%, 1% по двойной выбор чашки с агаром и расти при 37 ° C в течение 16 часов.
6. Анализ Рекомбинанты
- Дополнительно: Выберите от 6 до 12 колоний и выполнять ПЦР колоний с использованием HA фланговый праймера и указать конкретные грунтовки. Включите Пересев плазмиды и вставки CASSette плазмиду, а также родитель ВАС-клон в качестве отрицательных контролей.
- Выполните агарозном анализ геля колонии ПЦР. Определение положительных клонов в присутствии светлой полосы на ожидаемого размера.
ПРИМЕЧАНИЕ: высокая эффективность процесса клонирования SPI генерирует в основном правильные рекомбинанты.
- Выполните агарозном анализ геля колонии ПЦР. Определение положительных клонов в присутствии светлой полосы на ожидаемого размера.
- Выбор колонии в 5 мл LB рН 8, содержащую селективный антибиотик и расти O / N при 37 ° С.
- Подготовка минипрепараты ДНК с использованием Очистка на колонке комплект в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Подготовка ВАС ДНК минипрепаративную с использованием стандартного изоляции фенол-хлороформ или аналогичный протокол.
- Выполните RE дайджестов на минипрепаративную ДНК. Отдельные ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле. Анализ RE моделей для выявления клонов, содержащих ожидаемые фрагменты размеры правильный вектор ориентации. Выберите RE, который четко различает вектора отсутствует Вставка (и) и вектора, содержащего вставку (ы).
- OptioNAL: для получения клеток, которые лишены БАК, который все еще присутствует в Е. палочка после recombineering, используйте Минипрепарат ДНК плазмиды для трансформации DH5alpha или DH10B Е. палочки клетки.
- Выполните последовательность ДНК по ГК и вставки кассеты, чтобы проверить ошибки синтеза олиго.
Representative Results
Достучаться до Векторы
Достучаться направленные векторы отражают необходимость введения функции новой последовательности в геноме, включая замену одной базовой пары в области кодирующей белок, слияния флуоресцентным маркером или тегом сродства к белку или интеграции кассеты экспрессии генов. Чтобы проверить применение SPI в Достучаться векторных стратегии строительства, два различных случая испытаний были рассмотрены. Dnttip1 кодирует deoxynucleotidyltransferase, терминал, взаимодействующий белок 1A (TDIF1), что вместе с классом я гистондеацетилазы (HDAC) образуют митотический дезацетилазы комплекс (MIDAC) 28. Для изучения роли Dnttip1 в делении клеток, тандем сродством пометки подход был принят, чтобы изолировать TDIF1 взаимодействующих белков. Предыдущие попытки субклонирования часть гена Dnttip1 использованием вектора, содержащего p15A длинные участки гомологии в результате низкого зазора эффективности ремонтай частые аберрантные продукты рекомбинации (данные не показаны). Таким образом, строительство Достучаться вектора в локусе Dnttip1 при условии, сложные recombineering упражнения. Стратегия SPI был разработан, чтобы субклонировать раздел 12 кб гена Dnttip1 охватывающих последний экзон (экзон 13) в низкой вектора копия p15A и одновременно вставить двойной аффинной метки выбора кассету в экзоне 13, заменяя стоп-кодон (3А ). 2X связывания FLAG-калмодулин белок (ТПС) связано FRT-ПГК-EM7-Неомицин (Neo) -BGhpA-FRT кассеты (2,0 кб) был усилен с электр линеаризованной плазмиды с помощью двойного карданного модифицированных олигонуклеотидов, содержащих 120 б.п. HA фланговые Dnttip1 стоп-кодона. P15A Zeo Dnttip1 субклонирование вектор (1,7 кб), который был построен содержал 200 п.о. области, гомологичные концах последовательности Dnttip1 быть субклонировали. Dnttip1 субклонированием плазмиду RE линеаризуется и ПЦР-амплификации с использованием 20 б.п. изменены олигонуклеотидовчто вызвало ведущей нити защищенный вектор. Продукты ПЦР DpnI обработали, очистили и со-электропорации в recombineering компетентным Dnttip1 BAC Е. палочки клетки, а также неиндуцированные контрольные клетки. Реакции SPI высевали на зеоцина (Zeo) и канамицин (Kan), содержащей агаром (рис 3б). SPI произвела правильно модифицированный Dnttip1 Достучаться вектор во всех 12 рекомбинантами анализируемых (3С). Секвенирование ДНК проверены на отсутствие каких-либо ошибок в результате синтеза олиго или ПЦР-амплификации.
Другой пример SPI участие в в рамке вставки расширенной желтого флуоресцентного белка (EYFP) связаны селективную кассету в геном P2rx1. Ген P2rx1 кодирует рецептор G-белком, который функционирует как АТФ-ионный канал 29. Связь с флуоресценции YFP позволяет отслеживать в P2x1 рецептора на поверхности клетки в ВАнасколько серьезными функциональные пробы. P2rx1 является еще одним трудным локус, который представил значительные проблемы с общепринятыми методологиями recombineering (данные не показаны). Использование SPI, 12 кб сегмент гена P2rx1 охватывающей терминала экзон (экзон 12), субклонировали в вектор p15A Zeo и модифицированы с согласованным вставки в EYFP -LoxP бокам Neo кассеты с заменой кодона в экзоне 12 построить P2rx1-EYFP Достучаться вектор (рис 3D). В этом примере, отстающей нити защищены p15A вектор (1,7 кб) содержится 230 п.о. HA и кассета EYFP содержал 50 п.о. HA и также изменены. Кассету EYFP (2,7 кб) был собран путем сплайсинга перекрытия ПЦР гена EYFP, ПЦР-амплификации с pEYFP-C1, и LoxP- ПГК-EM7-Neo-BGhpA-LoxP кассеты, ПЦР-амплификации с pL452 (NCI, Frederick) , Реакционную SPI получают сотни колоний (данные не показаны). RE анализа ДНКминипрепараты, приготовленные из 11 клонов показал, большинство содержали правильно собранный P2rx1-EYFP Достучаться вектор (рис 3E). Дополнительные проверки путем секвенирования ДНК показали, безошибочную вставку кассеты EYFP. Тем не менее, некоторые из клонов показал, профили немаркированной щели восстановлены и меченых щелевых ремонт плазмид в одной и той же клетке (дорожки 6-9). Несколько образцов также содержали неправильно разрыв ремонт (дорожка 2) или mistargeted плазмиды (дорожки 4 и 5). Отказ от одновременного субклонировании и ориентации в некоторых SPI рекомбинантами подчеркивает пределы эффективного SPI клонирования при использовании больших кассет (> 3 КБ), которые вытекают из ограничений на Красной процессивности длинных фрагментов ДНК 30, или при использовании короткого га. В самом деле, увеличение га кассеты EYFP до 200 п.н. повышение эффективности SPI и правильное нацеливание кассеты (данные не показаны). Джин ориентации с P2rx1 - EYFP Достучаться вектора в JM8.N4ЭС клетки мыши (C57BL / 6 деформации), создаваемых 6 положительных клонов из 96, в котором содержится правильно целевой P2rx1-EYFP последовательность (рис 3F).
BAC Репортер Векторы
ВАС-клон гена-мишени часто содержит все необходимые вверх и вниз по регуляторные элементы, например, усилители, UTRs т.д., а эндогенный промотор для управления экспрессией гена естественных уровней 31. BAC репортер вектор Поэтому предпочтительным носителем резюмировать эндогенный характер экспрессии гена 32. Тем не менее, большой размер из ВАС плазмиды (до 200 кб) представляет значительные практические проблемы с трансфекции нетронутыми BAC в клетки 33. Уменьшение размера геномной вставкой BAC через ВАС обрезки 34,35, сохраняя при этом необходимые регуляторные элементы гена, позволяет легче обработку BAC и приводит к более эффективному transfectiна. Современная технология BAC инженерно включает в себя несколько раундов recombineering для достижения этой цели 35. Чтобы продемонстрировать полезность SPI в ВАС обрезки, вектор pBeloBAC11 ВАС использовали для субклонирования 30 кб геномной последовательности, включая полноразмерный ген P2rx1 от 168 кб P2rx1 BAC вместе с одновременным введением в EYFP кассеты в геном P2rx1 (фиг 4А). PBeloBAC11 Zeo вектор основой (6,5 кб), содержащий 180 б.п. га ПЦР-амплификации с измененными олигонуклеотидов, которая формировала отстающей нити защищенный вектор. Же кассета EYFP Neo (3 кб), используемый в предыдущем P2rx1 Достучаться построении вектора, был ПЦР-амплификации с использованием отстающей нити защищенных олигонуклеотидов, содержащих 180 б.п. га и ориентирована на P2rx1 экзон 12 замене стоп-кодон. После комбинированного электропорации EYFP кассеты и ZEO вектора pBeloBAC11 в P2rx1 ВАС клеток выражэссинга в gbaA recombineering белков, культура была восстановлена в 10 мл LB рН 8 в течение 3 ч при 37 ° С, чтобы отделить БАК плазмиды. Чистые рекомбинанты отбирают на Zeo и Kan агаром и наблюдались на частоте 2 х 10 -6. Колония ПЦР-анализ генотипа показали успешное BAC обрезки в 3-х из 6 клонов, которые были проанализированы (рис 4б). Длинный диапазон ПЦР-амплификации по месте вставки EYFP подтвердил правильность кассеты включение в трех положительных клонов (рис 4б). Три клона, лишенные EYFP вставки были неправильно разрыв отремонтированы на 5'-конце, при том, что причиной mistargeting кассеты EYFP в этих клонах, могут быть разделены на правильный закрытия 5'BAC конце. Три EYFP положительный ВАС клоны дополнительно анализировали с РЗ сборников и показал ожидаемую картину правильно обрезанного EYFP рекомбинантного BAC (рис 4C </ STRONG>). Анализ последовательности показал отсутствие ошибок в кассете EYFP только один клон из 3 срабатываний.
Условный нокаут (CKO) Векторы
Условное устранение экспрессии генов является важным инструментом для исследования процессов развития или для изучения биологических систем в конкретной точке времени. Условное ген стратегия нокаут, как правило, включает в себя размещение LoxP рекомбинации сайтов, окружающих критически экзон (CE). Удаление СЕ при экспрессии Cre или активации производит сдвиг рамки считывания и преждевременный стоп-кодон, что приводит к деградации мРНК из-за ерунды, опосредованного распада (ПРО). Строительство условного генного таргетинга вектора сложной задачей и включает в себя несколько шагов субклонирования, адресности и преобразование 22. SPI предлагает удобный маршрут, чтобы упростить этот процесс. В качестве тестовой случае, условное аллель гена Zrsr2 был построенс использованием методологии SPI (рис 5А). Ген Zrsr2 кодирует фактор сплайсинга и одна копия находится на Х-хромосоме. Условный статус делеции гена особенно важно в данном случае, чтобы управлять для возможности адаптации клеток с отсутствием Zrsr2 при выборе ЭС клеток в конститутивной таргетинга делеции гена стратегии. SPI проводили субклонировать 10 кб часть гена ZrSr2 в с одновременным включением двух разных LoxP фланкированных кассет отбора. FRT-ПГК-EM7-Neo-FRT-LoxP кассеты (2 кб) был ПЦР-амплификации с электр переваривается pL451 помощью отстает защищены прядь олигонуклеотидов, содержащих 180 б.п. HA ориентированных на ZrSr2 интрон 2. Вторая кассетой, содержащей Rox-ПГК-em7- бластицидин (BSD) -Rox-LoxP (2 кб) был ПЦР-амплификации из плазмиды R6K с отстающей нити охраняемых олигонуклеотидов, содержащих 180 б.п. HA идентичен ходу области в интрона 3. два LoxP сайты фланкированные экзонов 3, CE, чьи deletion на условных Cre активации приводит к сдвигу рамки и вводит преждевременный стоп-кодон. Субклонированием плазмиды Zrsr2 (1,6 кб) был ПЦР-амплификации с RE линеариз p15A ZEO плазмиды с помощью отстает защищены прядь олигонуклеотидов, содержащих 180 б.п. HA, соответствующие концы 10 кб Zrsr2 последовательности. SPI реакции проводили, как описано выше, и высевали на Zeo + Neo + BSD пластин. ZrSr2 условно адресным переносчиком успешно собран в большинстве исследованных 12 рекомбинантов (фиг.5В). Дальнейший анализ последовательности ДНК показал, правильность установки как при отборе, маркеров в векторе ZrSr2 СКО.
Рисунок 1. SPI клонирования. Обзор клонирования процессе комбинирования SPI ввода кассеты и субклонирования в одну стадию. () BAC клон Transformed плазмидой pSC101 BADgbaA и выращивали при 30oC. (B) После арабинозой индукции чтобы выразить Красные белки, асимметричный изменены в кассету и Пересев плазмиды вводятся в клона ВАС и выбирается с обеих вставки и субклонирования маркеров для генерации итогового вектора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этот показатель.
Рисунок 2. Схема, иллюстрирующая конструкцию SPI recombineering олигонуклеотидов. Субклонирование плазмиду и вставки кассеты и при помощи ПЦР с использованием комбинации терминала ВОМ и фосфата модифицированные олигонуклеотидов. ПЦР-фрагмент на Красной пищеварения в естественных условиях, производит онДНК промежуточное соединение, которое отжигов на отстающей нити вилки репликации. Genе конкретной ГК 50-180 п.о. включен в каждого олигонуклеотида, как показано. Стрелка указывает направление репликации ДНК через гена-кандидата. Пунктирная линия представляет Пересев последовательность плазмиды не включены в продукт ПЦР. RE сайт, Рестриктаза сайт линеаризации конечный вектор; F, вперед последовательность (на 20 б.п.), специфичные для субклонирование плазмиды или вставки кассеты; R, обратная последовательность, комплементарную (20 п.н.) плазмиды или кассеты; см, селективный маркер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. SPI позволяет создать конструкцию сложных векторов Достучаться. () Схема стратегии SPI используется в строительстве Dnttip1 Dual тегами вектор. Стрелка индивает, направление репликации на клона ВАС. Результаты (B) плакировке неиндуцированных и образцами индуцированной эксперимента Dnttip1 SPI. (C) EcoRI-дайджест Dnttip1 SPI клонов. М, 1 кб лестница (NEB); С p15A Dnttip1 разрыв ремонт плазмиды, в которых отсутствует кассету с двойной тегов. Фрагмент размеры: Tagged, 9,2 + 4,4 + 2,2 кб; управления; 9,2 + 4,6 кб. (D) SPI на основе P2rx1-EYFP Достучаться вектор строительства. (E) EcoRI-дайджест P2rx1-EYFP SPI клонов. М, 1 кб + лестница (Invitrogen); С p15A P2rx1 разрыв ремонт плазмиды, лишенного кассеты EYFP. Фрагмент размеры: Tagged 8,3 + 4,4 + 3,1 + 0,03 кб; управления; 8,3 + 3,1 + 1,8 + 0,03 кб (F) Южный блот-анализ P2rx1 -. Гена EYFP таргетирования в клеточных элементов JM8.N4 ES. Верхняя панель, блот с 3 'конца зонда с использованием PshAI дайджест. Показана результат скрининга клонов 5. Нижняя панель, Южный промокните с помощью5 'конца зонда и SpeI дайджест срабатываний, определенных на основе 3' конца проверки. Сайт PshAI RE; S, сайт SpeI RE. Пунктирная линия показывает конец вектора ГК. Черный ящик обозначает южную зонд. Ожидаемые фрагменты рестрикции, PshAI: WT, 8,9 КБ; EYFP-нео, 11,5 КБ; SpeI:. WT, 6,9 КБ; EYFP-нео, 7,6 кб Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4. Упрощенная ВАС обрезки с помощью SPI. (А) Схема, иллюстрирующая концепцию BAC обрезки с помощью SPI. Условные обозначения описано на фиг.1. (Б) ПЦР-амплификации по 5 'и 3' концы субклонированных вставки и по insertio P2rx1-EYFPп сайт. Стратегия скрининга показали, для каждого типа ПЦР. M (верхняя панель), Hyperladder 25 б.п., (нижние панели), 1 КБ +; P, P2rx1 BAC; . S, pBeloBAC11 Zeo субклонированием плазмиды (C) HindIII переварить из трех EYFP положительных клонов SPI ВАС от (В); E, как ожидается HindIII ограничение модель обрезанного EYFP BAC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5. Условная поколения нокаутом вектор, использующий SPI клонирования. () Схема одновременного введения двух различных LoxP бокам отбора кассет во время субклонировании аллеля Zrsr2. Условные обозначения описано на фиг.1. (В) </ STRONG> EcoRI дайджесты Zrsr2 SPI клонов. L, 1 кб лестница (NEB); C1, p15A ZrSr2 разрыв ремонт плазмиды, C2, p15A ZrSr2 разрыв ремонт плазмиды, содержащей нео вставки; C3, p15A ZrSr2 разрыв ремонт плазмиды, содержащие BSD вставки. Фрагмент размеры: СКО, 7,7 + 2,9 + 2,6 + 1,6 кб; C1, 7,7 + 4,0 кб; C2, 7,7 + 4,3 + 1,6 кб; C3, 7,7 + 2,9 + 2,3 кб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
| Нет шагов | Обычные recombineering трубопровод | Мультиплекс recombineering б |
| Шаг 1 | Трансформация recombineering плазмиды в хозяина ВАС | Трансформация recombineering плазмиды в хозяина ВАС. Подготовка, направленных на кассеты и Пересев векторов. |
| Шаг2 | Вставка R1 / R2 шлюза кассеты | Мультиплекс разрыв ремонт клонирование |
| Шаг 3 | Размещение floxed Кан кассеты | O / N культура из отдельных колоний |
| Шаг 4 | Gap ремонт в R3 / R4 плазмиды | Плазмидной ДНК и проверка |
| Шаг 5 | Преобразование в Cre + E. палочки | |
| Шаг 6 | Плазмидной ДНК и проверка | |
| Шаг 7 | O / N трехходовой реакция шлюз | |
| Шаг 8 | Трансформация трехходового реакции шлюза в DH10B Е. палочки клетки | |
| Шаг 9 | Ночь культуры из отдельных колоний | |
| Шаг 10 | Плазмидной ДНК и проверка последовательности | |
| б Среднее время 4 дней проверяется клона | ||
Таблица 1: Сравнение обычного recombineering с SPI в строительстве условных векторов нокаут.
| RE буфер | 5 мкл |
| ДНК | 1 мкг плазмиды или очищенные продукты ПЦР |
| RE | 1 мкл (5 и более) блоков |
| TE | до 50 мкл |
| Инкубируют при 37 ° С в течение по меньшей мере 1 ч. Нагрейте inacitvate в соответствии с инструкциями завода-изготовителя | |
Таблица 2: RE дайджеста.
| ПЦР материалы | Конечная концентрация |
| ПЦР буфер | 1x |
| дНТФ | 200 нМ |
| MgSO 4 | 1,5 мм |
| Бетаин | 1,3 М |
| ДМСО | 1% |
| Прямой праймер | 200 нМ |
| Обратный праймер | 200 нМ |
| ДНК-полимераза | 1 U |
| Шаблон | 10 нг многокопийных плазмид или 2,5 мкл ДНК минипрепаративную для генотипирования ПЦР |
| Вода | до 50 мкл |
| Для стандартного 50 мкл ПЦР-реакции с многокопийных плазмид. Генотипирования ПЦР дальнего радиуса действия были созданы в 25 мкл ПЦР-реакций. | |
| Условия ПЦР | |
| 95 ° С | 2 мин |
| 92 ° С | 10 сек |
| 55 ° С | 30 сек |
| 72 ° С | 30 сек |
| 30 циклов б | |
| не б цикл не может быть продлен до 35 для ВАС ПЦР генотипирование | |
Таблица 3: ПЦР Установка и условия.
| Антибиотики | Концентрация (мкг мл -1) |
| Ampicllin | 50 |
| Бластицидин б | 40 |
| Хлорамфеникол | 12,5 |
| Гентамицин | 2 |
| Гигромицин с | 30 |
| Канамицин б | 15 |
| Тетрациклин | 4 |
| Trimethoprim с | 10 |
| Zeocin | 5 |
| Рекомендуется для использования с БАС и многокопийных плазмид при использовании в комбинации мультиплекса recombineering | |
| б бластицидин (35 мкг мл-1) и канамицин (6 мкг мл-1), когда вместе используются в сочетании | |
| С Гигромицин и триметоприм не рекомендуется для отбора с одиночными БАС копирования. | |
Таблица 4. Рекомендуем концентрации антибиотиков для использования в SPI экспериментов.
Discussion
Строительство ЭС клеточных линий и моделей мышей исторически вовлечен ген целей с помощью плазмиды конструкций, которые содержали модифицированный аллель 4. Тем не менее, строительство этих сложных ген, направленных векторов оказалось значительное узким местом в своевременном изготовлении таких моделей. Развитие recombineering стратегий, основанных на вектор строительных позволило улучшенные векторных и более эффективным вектором сборки. Тем не менее, настоящие протоколы recombineering еще включать в себя несколько шагов, нуждающихся в промежуточных очистки плазмидной и использовать различные штаммы бактерий. Субклонирование плюс введение предлагает новый подход к вектору конструкции, которая может быть выполнена в одном случае электропорации в BAC принимающей житель напряжения. Полезность SPI в планировании гена был испытан здесь в различных векторных строительства. Во всех случаях, рассмотренных здесь, SPI оказалась эффективной и правильной рекомбинантную плазмиду получали.В большинстве случаев, нескольких различных кассеты были правильно вставлены в направл ющего вектора. Большие кассеты ДНК и векторы легко размещается в протоколе SPI и продемонстрировали гибкость этой системы.
SPI основана на использовании длинных последовательностей гомологии и фосфоротиоат (ВОМ) защиты линейных кассеты ДНК. Модификация ВОМ обеспечивает защиту от экзонуклеазами линейной ДНК 20,21 и долго HA увеличивает эффективность рекомбинации, чтобы позволить мультиплексирование. Тем не менее, синтез длинных последовательностей олигонуклеотидов повышает шансы накопления ошибка позиционирования особенно удаления. Мутации в олиго может быть особенно вредно, если они охватывают кодирующей белок области. Секвенирование ДНК по ГК и покрытия полной длины вставленной кассете настоятельно рекомендуется устранить клонов с каких-либо изменений последовательностей. Использование системы ДНК-полимеразы высокой точности также предложил, чтобы избежать введенияОшибки у ПЦР. Длина и состав ГК субклонирования плазмиды является более важным по отношению к тому, что кассеты вставки (данные не показаны). Для особо чувствительных к задержкам приложений, таких как строительство Достучаться векторов, где любые мутации в экзоне регионов не допускаются, HA кассеты вставки может быть сокращен (50-120 б.п.), чтобы избежать проблем, связанных с длинными олиго. Кассету можно также будут изменены или двойной phosphorothioated (где знания о направлении репликации не доступен). Но мультиплексирования в этих случаях по-прежнему требует длительного защищены HA Пересев плазмиды. Предостережение данном стратегии снижения мультиплексирования эффективности, которые потенциально могут повлиять на SPI клонирование в разных локусах.
Длина вставки кассеты и субклонирования плазмиды является еще одним важным параметром в SPI клонирования. Большие молекулы ДНК электропорации менее эффективно, а эффект носит кумулятивный характер, учитывая Reбованием ввести все кассеты в одной и той же клетке (данные не показаны). Мультиплексирование является наиболее эффективным при меньших кассет для вставки. Фрагментов ДНК больше, чем 3 кб также устанавливают предел Красный опосредованного обработки оцДНК, который является наиболее эффективным до 3 т.п.н. 30. Вставка кассеты, превышающие 3 Кб двойной Резецированная и рекомбинируют менее эффективно с помощью бета-независимого пути 20. Таким образом, скрининг достаточных колоний Для определения правильного клон становится важным в этих случаях. Большая продолжительность рекомбинации после электропорации также увеличивает шансы на выздоровление правильного клона в сложных SPI упражнений. До четырех небольших кассет (<1,5 кб) могут быть вставлены одновременно с процессом SPI, хотя эффективность уплотнения уменьшается с каждым дополнительным кассеты (данные не показаны). Тем не менее, это отражает результат оптимального эксперимента SPI и желательно обратить внимание на ограничения мультиплексирования при использовании многих крупных кассет. Разработка инструментов редактирования генома как кластерных регулярно interspaced коротких палиндромных повторов (CRISPR) -cas9 эндонуклеазы система позволила создания новых модификаций генома, что привело к более эффективному генной инженерии 36. Тем не менее, эти новые технологии дополняются генного таргетинга векторы, а не вытеснили их. Предполагается, что система CRISPR-CAS может заменить выбор антибиотиков и дальнейшего совершенствования протокола мультиплексирования recombineering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
|
| Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
| C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
| KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
| L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
| Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
| QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
| Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |
References
- Dovey, O. M., Foster, C. T., Cowley, S. M. Histone deacetylase 1 (HDAC1), but not HDAC2, controls embryonic stem cell differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 8242-8247 (2010).
- Harvey, M., et al. Spontaneous and carcinogen-induced tumorigenesis in p53-deficient mice. Nat. Genet. 5, 225-229 (1993).
- Waterhouse, P., et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4. Science. 270, 985-988 (1995).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
- Hasty, P., Rivera-Pérez, J., Bradley, A. The length of homology required for gene targeting in embryonic stem cells. Mol. Cell. Biol. 11, 5586-5591 (1991).
- Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination. Nature. 317, 230-234 (1985).
- Hirata, R., Chamberlain, J., Dong, R., Russell, D. W. Targeted transgene insertion into human chromosomes by adeno-associated virus vectors. Nat. Biotechnol. 20, 735-738 (2002).
- Szostak, J. W., Orr-Weaver, T. L., Rothstein, R. J., Stahl, F. W. The double-strand-break repair model for recombination. Cell. 33, 25-35 (1983).
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309, 255-256 (1984).
- Fu, J., Teucher, M., Anastassiadis, K., Skarnes, W., Stewart, A. F. A recombineering pipeline to make conditional targeting constructs. Methods Enzymol. Soriano, P. M., Wassarman, P. M. 477, Academic Press. 125-144 (2010).
- Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J., Stewart, A. A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nat. Genet. 20, 123-128 (1998).
- Copeland, N., Jenkins, N., Court, D. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
- Muyrers, J., Zhang, Y., Testa, G., Stewart, A. Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination. Nucleic Acids Res. 27, 1555-1557 (1999).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5978-5983 (2000).
- Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nature Protoc. 4, 206-223 (2009).
- Wang, J., et al. An improved recombineering approach by adding RecA to λ red recombination. Mol. Biotechnol. 32, 43-53 (2006).
- Datta, S., Costantino, N., Court, D. L. A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria. Gene. 379, 109-115 (2006).
- Fu, J., et al. Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting. Nat. Biotechnol. 30, 440-446 (2012).
- Muyrers, J., Zhang, Y., Buchholz, F., Stewart, A. RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners. Genes Develop. 14, 1971-1982 (2000).
- Maresca, M., et al. Single-stranded heteroduplex intermediates in lambda Red homologous recombination. BMC Mol. Biol. 11, 54 (2010).
- Mosberg, J. A., Lajoie, M. J., Church, G. M. Lambda Red recombineering in Escherichia coli occurs through a fully single-stranded intermediate. Genetics. 186, 791-799 (2010).
- Liu, P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations. Genome Res. 13, 476-484 (2003).
- Chan, W., et al. A recombineering based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction. Nucleic Acids Res. 35, e64 (2007).
- Zhang, Y., Muyrers, J. P. P., Testa, G., Stewart, A. F. DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 18, 1314-1317 (2000).
- Lee, E. C., et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA. Genomics. 73, 56-65 (2001).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
- Valenzuela, D. M., et al. High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat. Biotechnol. 21, 652-659 (2003).
- Bantscheff, M., et al. Chemoproteomics profiling of HDAC inhibitors reveals selective targeting of HDAC complexes. Nat. Biotechnol. 29, 255-265 (2011).
- Mulryan, K., et al. Reduced vas deferens contraction and male infertility in mice lacking P2X1 receptors. Nature. 403, 86-89 (2000).
- Subramanian, K., Rutvisuttinunt, W., Scott, W., Myers, R. The enzymatic basis of processivity in lambda exonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 1585-1596 (2003).
- Antoch, M. P., et al. Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue. Cell. 89, 655-667 (1997).
- Rostovskaya, M., et al. Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells. Nucleic Acids Res. 40, e150 (2012).
- Giraldo, P., Montoliu, L. Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals. Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).
- Hill, F., et al. BAC trimming: minimizing clone overlaps. Genomics. 64, 111-113 (2000).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339, 819-823 (2013).
