Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) embryon har använts i stor utsträckning som en modell för att studera njurutveckling och polycystisk njursjukdom. Det finns många fördelar med att använda zebrafisk som en djurmodell: möjligheten att studera genetiska interaktioner, förmågan att använda antisense morpholinos (MO) för proteinknockdown, en möjlighet att snabbt analysera ett stort antal embryon, och hur lätt visning fenotyper organ i levande larver 1. De pronephros är den första njuren att utvecklas hos ryggradsdjur och är funktionell i larvzebrafisk 2. Strukturen hos zebrafisk pronephros är relativt enkel jämfört med de däggdjurs metanefros, till den tredje och sista njure utvecklas i däggdjur. Nefronet är arbetsenheten i njuren, med varje människa njure innehåller mellan 500,000-1,000,000 nephrons 3,4 och varje mus njure har cirka 13.000 nephrons 5, vilket gör det svårt att observera enstaka nefronet struktur in mänskliga eller mus njurar. Den zebrafisk har bara två nephrons, och varje zebrafisk nefronet innehåller alla viktiga komponenter som finns i glomerulus och tubuli av möss och människor 6 och liknande specialiserade njurcelltyper. Jämfört med andra ryggradsdjur modeller såsom Xenopus, zebrafisk nephron mer liknar däggdjurs nefronet eftersom den har ett slutet system 7.
Under de senaste åren har den zebrafisk genomet sekvenserats, vilket gör den breda introduktionen av genetiska verktyg, omfattande resurser mutant, och samlingar av transgena reporter linjer i zebrafisk modeller. Zebrafisk pronephros bildas mellan 12-72 h efter befruktning (HPF) och kan visualiseras lätt i de transparenta embryon. Den Wilms tumör protein WT1 är en viktig faktor för njurutveckling. Transgena zebrafisk linjer som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av wt1b promotorn Tg (wt1b: GFP) visar GFP expression specifikt beläget i pronephric regioner zebrafiskembryon, från 17 HPF 8. Nephronophthisis (NPHP), en autosomal recessiv cystisk njursjukdom, orsakas av mutationer i NPHP gener 9. NPHP4 knockdown genom morfolino orsakade cystbildning i Tg (wt1b: GFP). Fisk 10 Därför är denna transgen fisk en lämplig modell för att observera njurstrukturer och cystbildning under njurutveckling. Viktigt kan studeras påverkan av modulatorer av njure utveckling med denna stam i ett tids- och arbetseffektivt sätt.
Vårt papper beskriver användningen av Tg (wt1b: GFP) fisk som en modell för att visualisera njur cystbildning efter gen modulation. Vi använde start- och skarv-site antisens MO att slå ner wnt5a genen i zebrafisk. Wnt5a är en icke-kanoniska utsöndrade glykoproteinet i Wnt familjen som spelar en viktig roll i utvecklingen av olika organ och postnatal cellulärfunktion 11. Wnt5a fungerar genom icke-kanoniska Wnt vägar, däribland den plana cellpolaritet (PCP) väg, vilket har visat sig spela en roll i orienterat celldelning under renal tubulär förlängning. Wnt5a reglerar Wnt / PCP-vägen genom att bilda ett komplex med receptorn liknande tyrosinkinas (Ryk), som ytterligare omvandlar Wnt5a signalering genom bildning av ett komplex med VANGL plana cellpolaritet protein 2 (Vangl2) och därigenom främja Vangl2 stabilitet 12. Defekter i PCP vägen kan resultera i slumpmässig celldelning och orsaka njur cystbildning. Vi använde Tg (wt1b: GFP) zebrafisk linje att observera njur cystbildning efter wnt5a knockdown. Tg (wt1b: GFP) zebrafisk modellen möjliggör levande avbildning och snabb observation av njurstrukturen. Efter wnt5a knockdown, var njur cystbildning hittat början vid 24 HPF; vid 72 HPF, kunde cystor hittas i glomeruli och proximala tubuli. Denna metod kan också användas för att sCreen andra gener som kan orsaka njur cystbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Etik Uttalande: Alla zebrafisk experiment har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Eastern Virginia Medical School.
1. Morfolino Framställning
- Design och syntetisera translation-blockerande (AUG-) och skarv hämmande (skarv-) antisens morfolino (MO) oligonukleotider för genen av intresse enligt tillverkarens anvisningar (Figur 1A). Vänligen se tillverkarens information i Tabell 1.
OBS: MO levereras som frystorkade bestånd i glasflaskor. - Lägg högvärdigt sterilt vatten på glasflaskor för att återsuspendera MO till en slutlig koncentration av 25 ug / ul. Kontrollera att oligonukleotiden är helt upplöst. Om några fasta lämningar, värma flaskan med aktie oligonukleotidlösningen vid 65 ° C under 5 till 10 min och skaka en kort stund.
- Förvara MO stamlösning vid RT. Förvara dem inte vid 4 ° C eller -20 °; C eftersom lägre temperaturer kan leda till att MO oligonukleotid att binda till behållarväggen. Mät koncentration av stamlösningen med användning av en spektrofotometer (se tabell 1) varje gång en ny MO stamlösning beredes.
- Bered MO arbetslösning på dagen för injektion genom utspädning av stamlösningen med höggradig sterilt vatten till den önskade dosen. Lägg 0,5% fenol-rött för att nå en koncentration av 0,05%. Till exempel, för att göra 5 pl arbetslösning med en koncentration av 15 ng / nL, tillsätt 3 l MO stamlösning och 0,5 l 0,5% fenol-rött till 1,5 l vatten.
OBS: Med detta arbetskoncentration, varje droppe (500 pl) injektions innehåller 7,5 ng MO och två droppar innehåller 15 ng MO.
2. Framställning av injektionsanordningen
- Inköps glas pre-drog nålar (se tabell 1 för detaljerad information). Alternativt dra glasinjektionsnålen with en nål avdragare.
- Slå på luftkompressorn och justera trycket inställningen till 50 psi. Slå på dissekera mikroskop ljuskälla och Pico mikroinsprutningspumpen och justera inställningarna enligt följande: Håll trycket 20 psi, mata trycket 10 psi, period värde på 2,5 och 100 ^ sek utbud av gating.
- Fyll på glaset före drog nål med 5 pl av injektionslösningen och placera nålen i en vertikal position med spetsen pekande nedåt. Vänta tills all lösningen når nålspetsen med inga synliga luftbubblor. Placera nålhållaren i ett lämpligt läge intill mikroskopet och sätt glaset nålen i hållaren. Justera insprutningsvinkeln till 45 grader.
- Ta nålspetsen i sikte under mikroskop, högt från scenen, och fokusera på det tunnaste regionen i spetsen. Bryt av nålspetsen med fin spets pincett.
- Placera en linjal och ett kapillärrör med innerdiameter 0,15 mm sida vid sida under mikroskop;injicera lösningen in i en ände av kapillärröret för att göra en vätskepelare. Justera eject tid att nå varje 17 droppar per 1 mm längd vätskepelare, då volymen av varje droppe är 1 nl (drop volym = π x radie 2 x längd (i vätskepelare) / count (droppar).
ANMÄRKNING: En droppe med en diameter av 0,1 mm ger en injektionsvolym av cirka 500 pl (droppvolym = 4/3 x π x radien 3).
3. Beredning av befruktade Zebrafish embryon och Injektion med Morpholinos
- Ställ in Tg (wt1b: GFP) transgena zebrafisk häckande par enligt publicerade protokoll för standard zebrafisk djurhållning och underhåll. Samla embryon efter naturliga spawn, och förvara dem på en 10 cm petriskål fylld med E3 vatten (5 mM NaCl, 0,17 mm KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO 4). Starta MO injektion direkt 13. Övervaka embryo morfologi under mikroskop och kontrollera MO injektion är vid den en-cellstadiet, eller senast fyra cellstadiet.
- Överför embryon till en 10 cm petriskål med kilformad agar tråg. Sug extra E3 vatten och tryck försiktigt embryon i trågen.
- Manipulera embryon med mikropipett att visualisera 1-cellstadiet embryon under dissekera mikroskop. Penetrera chorion och sedan gulan att injicera en eller två droppar MO in äggulan (1 droppe = 500 pl). Överför injicerade embryon till en 10 cm petriskål med E3 vatten och inkubera vid 28,5 ° C.
- Efter injektionerna, ta bort döda embryon och registrera antalet injicerade embryon. Ersätt E3 vatten i skålen varje 24-48 h.
4. Fenotyp Räddnings Experiment
- Välj ett ortologen från en annan art som har en annan primär baspar struktur (vanligtvis 3-7 basparfelpassningar) och är därför resistent mot MO, för räddning. Till exempel, i detta experiment, vi valdemus eftersom musen Wnt5a mRNA-sekvensen skiljer sig från zebrafisk sekvens.
- Design en primeruppsättning med den framåtriktade primern börjar vid translationsstället och den omvända primern vid nära den änden av mRNA-kodningsregionen. Lägg en T7-promotor-sekvens vid 5'-änden av den främre primersekvensen. I detta experiment använde vi följande primersekvensema; framåt: 5'taa tac GAC tca cta tagg GGA CTA tga tgc tgc tga agc tga a- 3 'och omvända: 5'TCA CTT GCA GAC gta CTG gtc- 3'.
- Utför en 50 | il polymeraskedjereaktion (PCR) med primeruppsättning (0,5 ^ M av varje primer) konstruerad ovan och 0,1 ^ g mall-DNA innehållande mus Wnt5a cDNA-sekvensen med följande PCR-program: 1 cykel vid 95 ° C under 5 min; 35 cykler av 95 ° C (30 sek), 58,5 ° C (30 sek), 72 ° C (1 min); och slutligt förlängningssteg vid 72 ° C under 7 min.
- Efter avslutad tHan cyklar, springer 2 pl av PCR-produkten på 1% agarosgel för att se bandet är rätt storlek. Rena PCR-produkten med ett PCR-reningskit enligt tillverkarens instruktioner. Kontrollera DNA-koncentration med en spektrofotometer. Förvara den renade PCR-produkten vid -20 ° C eller direkt användning i capped RNA-transkription i nästa steg.
- Syntetisera in vitro utjämnade mRNA med ett tak RNA-syntes kit enligt tillverkarens anvisningar. Späd mRNA i 20 ul RNas-fritt vatten och bestämma koncentrationen. Alikvotera RNA och förvara vid -80 ° C.
- På dagen för injektionen, förbereda en arbetslösning av mRNA med RNas-fritt sterilt vatten. Observera att 40 pg är i allmänhet den högsta RNA dos vid vilken ospecifika eller toxiska effekter av RNA inte uppstår. Håll arbets lösningen på is. Injicera embryo med MO och sedan räddnings mRNA, eller samar injicera båda tillsammans. Till exempel, om koncentrationen av mRNA prepared i steg 4,5 är 0,6 mikrogram / l, till 0,67 pl mRNA (0,4 mikrogram) till 4.33 pl RNas fritt vatten för att göra en slutlig koncentration av 0,08 mikrogram / l, då en droppe (500 pl) av varje injektion innehåller 40 pg av mRNA. Förbered MO som beskrivs i steg 3.
5. Beredning av Injicerade embryon för Fluorescent Imaging
- Efter inkubation vid 28,5 ° CO / N, lägga 0,003% N-fenyltiokarbamid (PTU) till E3 vatten för att förhindra melanin, vilket påverkar observation av pronephros struktur med hjälp fluorescensmikroskopi. Dock inte lägga PTU före gastrulation, eftersom det påverkar tidig embryonal utveckling.
- Vid 48 HPF, manuellt dechorionate embryona med fin pincett. Ta bilder av 48 och 72 HPF embryon under ett ljus dissektion mikroskop.
OBS: Dessa bilder kan tas utan bedövning. - Cirka 10 min före avbildning under fluorescensmikroskop, söva embryona genom att placera dem ien 10 cm petriskål innehållande 160 ug / ml buffrat Tricaine. Vänta 5-10 minuter, och sedan lätt röra zebrafisk för att bekräfta att de inte rör sig och därför anestesi fungerar.
- Efter embryona bedövas, montera dem i 3% metylcellulosa och orientera dem i liggande ställning under ett dissekera mikroskop (se tabell 1).
- Observera pronephros strukturen under ett fluorescensmikroskop (se tabell 1) och ta bilder på olika förstoringar (10X och 20X).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wnt5a riva uppnåddes genom att införa translation blockera MO (AUG-MO) eller exon / intron gräns skarv MO (skarv-MO) till zebrafisk embryon vid en cellstadiet. Den augusti-MO riktar startkodonet och följaktligen hämmar både maternal och zygotisk wnt5a meddelande. Skarven-MO riktar den tredje splitsningsdonatorställe och hämmar endast den zygotiska transkript av wnt5a (Figur 1A). Den AUG- och skarv- morphants phenocopied varandra med flera defekter, inklusive lockig svans ner kroppsaxeln och perikardiell ödem (Figur 1B). Mus Wnt5a mRNA räddar delvis morphant fenotypen (Figur 4B), vilket visar att fenotypen inte beror på off-mål effekter. Tg (wt1b: GFP) transgen zebrafisk som uttrycker GFP drivs av wt1b promotorn så att GFP rekapitulerar endogent uttryck av wt1b, användes för att beskriva den pronephric strukturen. Tg (WT1b: GFP) fisk visade glomerulär cystbildning efter wnt5a knockdown vid 48 HPF, medan embryon kontroll injiceras med fenol-röd ensam visas normal pronephric utveckling, bildar en sammansmält glomerulus i en "U" -form med tubuli som sträcker sig i sidled (figur 2). Vid 72 HPF, glomerulär struktur vidareutvecklas med lätt visualiseras vaskulära loopar, med både AUG- och skarv-MO utvecklade cystor i glomeruli och proximala tubuli (Figur 3). H & E-färgning av de tvärgående histologiska sektioner av 72 HPF morphant embryon avslöjade cystbildning, störde glomerulära strukturer och vidgade njurtubuli (Figur 4A).
Figur 1: Morpholino design och lätta mikroskopiska utseende zebrafisk embryon vid 72 timmar efter befruktning (HPF) efter injektionmed fenol-röd kontroll, Aug-MO, eller skarv-MO. (A) Diagram som visar zebrafisk wnt5a genen, den kodande regionen, och de regioner som åsyftas med AUG- och skarv- MO. Den wnt5a augusti-MO var utformad för att rikta in sig på ATG-startkodonet för att blockera proteintranslation; skarven-MO var utformad för att rikta gränsen exon 3 och 4. Skarv-MO oligo riktade mot någon skarv korsningen förväntas generera antingen en fullständig eller partiell enstaka exon radering eller en fullständig eller partiell enda intron insättning. Vi valde att slå ner wnt5a med både en Aug-MO, vilket påverkar mödrars och zygotiskt budskap, och en skarv-MO, vilket endast påverkar zygotiska avskriften, i syfte att öka specificiteten. (B) Embryot injicerade med fenol-röd ( insprutningskontroll) visade normal kropps krökning, längd och hjärtsäcken. Embryot injiceras med AUG-MO visade nedåt lockigt svans struktur och perikardiell ödem, och embryot injiceras med skarven-MO phenocopied denutseende av embryot som injicerats med augusti-MO. Bar = 2mm.
Figur 2: Fluorescens mikroskopiska utseende Tg (wt1b: GFP). Zebrafisk embryon vid 48 HPF efter injektion med fenol-röd kontroll, wnt5a Aug-MO eller wnt5a Skarv-MO I fenolröda insprutningskontroll, pronephros utvecklingen var avslutad vid 48 HPF. Två fuserade glomeruli och de proximala tubuli kan ses. Cystbildning kan observeras i glomeruli i både AUG- och splits-MO embryon vid 48 HPF vid slutet av zebrafisk pronephros utveckling (bar = 100 | am).
Figur 3: Fluorescens mikroskopiska utseende Tg (wt1b: GFP) zebrafisk embryon vid 72 HPF efter injektion med fenol-rödkontroll, wnt5a Aug-MO eller wnt5a skarv-MO. Vid 72 HPF, glomerulär struktur kan tydligt visualiseras. I fenolröda insprutningsstyrning, kan observeras två fuserade glomeruli och vaskulära slingor. Wnt5a knockdown gav cystbildning i alla nefronet strukturer som kunde särskiljas, inklusive glomeruli och proximala rörformiga regionen (bar = 100 | am).
Figur 4: (A) H & E-färgning av de tvärgående histologiska sektioner av 72 HPF morphant embryon avslöjade cystbildning, störde glomerulära strukturer och vidgade njurtubuli. Pil: pronephric glomeruli; pilspets: vidgade renala tubuli. Bar = 20 pm. (B) AUG-MO fenotyp skulle delvis räddas med mus Wnt5a, resistent mot MO på grund av en skillnad i primär baspar struktur, Vilket visar att fenotypen inte berodde på off-mål effekter. Skillnaden var statistiskt signifikant vid p <0,05 (* P <0,05 vs Fenol-rött grupp; # P <0,05 vs augusti-MO 15 ng-gruppen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polycystisk njursjukdom (PKD) är en av de främsta orsakerna till slutstadiet njursjukdom hos människor och kännetecknas av progressiv cystbildning, njur utvidgningen, och onormal tubuli utveckling 14. Autosomalt dominant PKD (ADPKD) är en genetisk sjukdom där mutation av antingen PKD1, kodning polycystin-1 (PC1), eller PKD2, kodning polycystin-2 (PC2), resulterar i polycystiska njurar. Många andra gener, särskilt de som kodar för proteiner som finns i den primära cilium, tros vara inblandade i utvecklingen av njurcystor, och hittills finns det inget idealiskt verktyg för att screena dessa gener. Vi beskriver ett snabbt och enkelt sätt att observera njur cystbildning efter gen knockdown i zebrafisk. Denna metod kan sannolikt användas för att screena andra kandidat PKD gener.
En av styrkorna med denna teknik är dess enkelhet. I Tg (wt1b: GFP) zebrafisk, är ett uttryck för GFP i glomeruli, tubuli och kanaler, vilket gör det till en vissly lämplig modell för att studera hela pronephric njurstrukturen. Tg (wt1b: GFP) zebrafisk möjliggör direkt visualisering av pronephric struktur och njure cystbildning efter gen slå ner. Man misstänkte att Wnt5a knockdown kan orsaka PCP pathway defekter och njure cystbildning i möss. Emellertid är postnatal dödlig för möss globala knockout av Wnt5a och kunde inte användas för att observera njure cystbildning efter födseln. Genom att använda den metod som beskrivs här, i en kort tid det bestämdes att wnt5a knockdown i zebrafisk gav njur cystbildning. Med detta resultat, kommer nästa steg vara att generera njur specifika Wnt5a knockoutmöss.
Denna teknik har också några begränsningar. Det är svårt att uppskatta effekten av MO utan en bra antikropp, och för att utesluta möjligheten att den MO skulle kunna hämma funktionen av en irrelevant gen att bringa fenotypen. Omfattande kontroll experimeNTS krävs för att övervinna dessa problem. Två distinkta MO, AUG-MO och skarv- MO användes för att utvärdera wnt5a knockdown. Båda morphants phenocopied varandra, och injektion av mus Wnt5a mRNA, resistent mot MO på grund av en skillnad i primär baspar struktur, räddade den onormala fenotypen, vilket visar att fenotypen inte berodde på "off-mål" effekterna av MO.
Vår modell visar att wnt5a knockdown orsakar njur cystbildning i zebrafiskembryon. Denna metod kan användas för att testa många andra gener som är misstänkta för att orsaka njur cystbildning, som den är enkel och mindre tidskrävande. När det kan visas att de gen mutation resulterar i njur cystbildning i zebrafisk, kan ytterligare försök utföras för att undersöka de detaljerade mekanismerna för njur cystbildning. I detta experiment, eftersom de Wnt5a globala knockoutmöss är postnatal letala och kan inte användas för att observera njure cystbildning efter födseln, kommer nästa steg vara att generera njurspecifik Wnt5a knockoutmöss använder Cre-lox-systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH (DK093625 till LH och DK069909 och DK047757 till JHL) och VA (Merit Award I01BX000820 till JHL). Vi vill tacka Dr Michael Pack och Dr Jie Han vid University of Pennsylvania Zebrafish Kärna för att ge viktigt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Color indicator for injection |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (customized) | Customized designed to the gene of interest |
| Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | For prevention of melanization |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia |
| Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | For position of zebrafish |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For purification of PCR product for cap RNA synthesis. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | For PCR |
| Tag DNA Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | For PCR |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | For measure morpholino and RNA concentration |
| Air Compressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Air source for injection |
| Pico micro-injection pump | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Other types of microinjection system can be used. |
| Micro-manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Right-handed (MMJL for left handed) |
| Needle holder | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | To hold needle for micromanipulation |
| Dumont Tweezers | Fine Surgical Tools | 11253-20 | For breaking off the needle tip |
| Dissecting microscope | Leica M205C | For observing and imaging zebrafish embryos | |
| Fluorscence microscope | Zeiss Axio Obserer D1m | For imaging zebrafish pronephros | |
| Capillary tube (I.D. 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | For measure the volume of each injected drop |
References
- Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
- Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Igarashi, P. Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Liu, S., et al. A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish. Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).
- Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish. Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).
- Huang, L., et al. The role of Wnt5a in prostate gland development. Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).
- Andre, P., et al. The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2. J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
