Abstract
Atomic Force mikroskopi (AFM) bruger en pyramideformet spids fastgjort til et fremspring til at undersøge kraft reaktion en overflade. Kan måles fordrejning af spidsen til ~ 10 pN af en laser og sektoropdelt detektor, som kan omdannes til billedet topografi. Amplitudemodulation eller "trykke mode" AFM omfatter proben gør periodisk kontakt med overfladen, mens oscillerende ved sin resonansfrekvens til at producere et billede. Anvendes i forbindelse med en væske celle, trykke-mode AFM muliggør billeddannelse af biologiske makromolekyler, såsom proteiner i fysiologisk relevante betingelser. Tapping-mode AFM kræver manuel indstilling af sonden og hyppige justeringer af et væld af scanningsparametre, der kan være en udfordring for uerfarne brugere. For at opnå billeder af høj kvalitet, er disse justeringer er den mest tidskrævende.
PeakForce Kvantitativ nanomekaniske Ejendom Mapping (PF-QNM) frembringer et billede ved at måle en kraft ResponSE kurve for hvert punkt kontakt med prøven. Med ScanAsyst software, kan PF-QNM automatiseres. Denne software justerer setpunktet, drev frekvens scanning sats, gevinster og andre vigtige scanningsparametre automatisk for en given prøve. Ikke alene denne proces beskytte både skrøbelige sonder og prøver, det reducerer den tid, der kræves for at opnå billeder i høj opløsning. PF-QNM er kompatibel til AFM billeddannelse i væske; derfor, det har omfattende ansøgning til billeddannelse biologisk relevante materialer.
Den præsenteres i dette papir metode beskriver anvendelsen af PF-QNM at få billeder af en bakteriel rødt lys fotoreceptor, RpBphP3 (P3), fra fotosyntetiske R. palustris i dens lys tilpasset tilstand. Ved hjælp af denne metode, har de enkelte protein dimerer af P3 og aggregater dimerer blevet observeret på en glimmer overflade i nærværelse af en billeddannende buffer. Med passende justeringer for at overfladevand og / eller løsning koncentration, denne metodekan generelt anvendes på andre biologisk relevante makromolekyler og bløde materialer.
Introduction
Atomic force mikroskopi (AFM) er blevet et meget vigtigt redskab til at undersøge de strukturelle og mekaniske egenskaber af overflader, tynde film og enkelte molekyler siden sin opfindelse i 1986 (Figur 1). 1-3 Brug en væske-celle, metoden har blive særligt nyttige i studier af biologiske makromolekyler og endda levende celler i en fysiologisk relevant miljø. 4-10 Tapping-mode AFM har traditionelt været anvendt til billeddannelse af bløde materialer eller løst bundne molekyler til overfladen, idet kontakt-mode AFM er typisk uegnet på grund til skader forårsaget af de laterale kræfter på prøven ved cantilever. 11 Tapping-mode AFM reducerer disse kræfter betydeligt ved at have tippet intermitterende røre ved overfladen snarere end at være i konstant kontakt. I denne tilstand er cantilever oscilleres ved eller i nærheden af sin resonansfrekvens, vinkelret på overfladen. Ligeledes at kontakte-mode AFM, topografi er analyzed ved at plotte bevægelsen af z-piezo som en funktion af xy (afstand).
De udkragede dynamik kan være ganske ustabil ved eller nær resonans; derfor er de meget udfordrende at automatisere uden for en "steady state" situation. Specifikt disse dynamikker afhænger både af egenskaberne prøve og scanning miljø. For en blød molekyle adsorberet til en hård (ere) overflade, kan en godt tunet returkredsløbet til molekylet medføre tilbagekoblingsoscillation til overfladen. Drift i væske komplicerer yderligere tuning af cantilever. Ændringer i temperatur eller væskestande kræver konstant justering af setpunkt, gevinster, og andre billeddiagnostiske parametre. Disse justeringer tendens til at være meget tidskrævende og udfordrende for brugerne.
Topkraft Kvantitativ nanomekaniske Ejendom Mapping (PF-QNM), ligesom aflytning tilstand AFM, undgår laterale interaktioner ved intermitterende kontakt mellem prøven (figur 2). 12-15 </ Sup> Men PF-QNM opererer i ikke-resonante mode og frekvenser meget lavere end at trykke-mode AFM. Dette eliminerer tuning udfordringer i tappe-mode AFM, især dem forværres ved tilstedeværelsen af væske. Med PF-QNM, billederne indsamles ved at tage en kraft respons kurve ved hver kontaktpunkt. Med tilføjelsen af ScanAsyst software, kan 15 justering af scanningsparametrene automatiseres og et billede i høj opløsning opnået i løbet af få minutter ved selv uerfarne brugere. Når brugeren bliver mere fortrolig med AFM, kan enhver af eller alle de automatiske parametre deaktiveres når som helst, der tillader experimentalist at finjustere billedkvaliteten manuelt. Siden starten har PF-QNM blevet anvendt til at kortlægge bacteriorhodopsin, en membran protein og andre native proteiner på submolecular niveau. 16-18 For bacteriorhodopsin, er der en direkte sammenhæng mellem protein fleksibilitet og røntgenkrystallografiske strukturer. 12 PF -QNM er blevet anvendt til at undersøge levende celler med høj opløsning. 19,20 Desuden har PF-QNM data belyst vigtige forbindelser mellem struktur og mekanik i erythrocytmembranen, der er afgørende for celle integritet og funktion. 21.
Vi har ansat scanning probe mikroskopi (SPM) metoder, 22 herunder AFM, 23 for at studere strukturen af røde lys fotoreceptorer kaldet bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 De består af en lys sensing modul kovalent bundet til en signalering-effektor modul sådan som histidin kinase (HK). 26 lys-sensing modul indeholder typisk en Bilin chromofor som undergår strukturelle omlægning efter absorption af en foton, med en række strukturelle ændringer nåede signaleringen-effektor-modul og fører til en global omdannelse af hele proteinet . 24,27-29 Baseret på denne forandring, er der to særskilte lysabsorberende sTates af BphPs, en rød og langt rødt lys absorberende tilstand, betegnet Pr og Pfr. Pr er termisk stabil, mørke-tilpassede tilstand for de fleste BphPs. 28 molekylære grundlag for Pr / Pfr fotoomdannelse er ikke helt forstået på grund af begrænset strukturel viden om disse proteiner. Med undtagelse af en struktur fra D. radiodurans, 30 alle offentliggjorte røntgenkrystallografiske strukturer af disse proteiner er i den mørke-tilpassede tilstand og mangler effektordomæne. De intakte BphPs er for store til at blive effektivt undersøgt ved kernemagnetisk resonans (NMR) og er notorisk vanskelige at krystallisere i deres intakte form (især i lyset tilpasset tilstand) til røntgenkrystallografi. BphPs er for nylig blevet manipuleret med infrarød fluorescerende protein markører (IFP) 's. 31 Strukturel karakterisering af disse proteiner kan yderligere støtte i effektiv IFP design. 32-36
Fokus i denne artikel er at præsentere en procedure forbilleddannelse af BphPs anvender flydende-celle AFM fra PF-QNM. Fremgangsmåden er påvist ved undersøgelser af lys tilpasset tilstand bacteriophytochrome RpBphP3 (P3) fra den fotosyntetiske bakterie R. palustris. AFM procedure, der præsenteres her er praktisk og enkel tilgang til afbildning af proteiner samt andre biologiske makromolekyler. Med denne fremgangsmåde kan strukturelle detaljer af de enkelte molekyler blive samlet i en kort periode, svarende til en øvre niveau videnskab naturligvis laboratorium session. Gennem måling tværsnit og færdiggøre yderligere dimensionelle analyser, kan eksperimentelle data sammenlignes med anvendelige beregningsmodeller. 37-42
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Computer og Mikroskop Set Up
- Åbn ventilen af N 2 cylinderen og justere drejeknapper at sikre luftbordet er variabel og niveau.
- Tænd for computeren, controller, og fiberoptiske lys i denne rækkefølge.
- Indstil scanneren til AFM / LFM mode og centrere kameraet over AFM hovedet.
- Åben software. Vælg eksperiment kategorien "nanomekaniske Egenskaber", "Quantitative nanomekaniske Mapping" under eksperiment gruppe, og "PeakForce QNM i Fluid" under eksperimentet. Klik på Load Eksperiment og derefter Opsætning.
- Fokus kameraet ved hjælp af Z-mål, for at se overfladen af scenen. Brug af grove op / ned piezos flytte scenen ca. 1 mm under overfladen af AFM hovedet blænde.
2. Fremstilling af glimmeroverflade
- Tryk en selvklæbende mærkat på ansigtet af en ren prøve støtte disk (15 mm i diameter, 0,8 mm tyk). Skub en glimmer V-4klasse disk (25 x 25 x 26 mm) på klæbemidlet indtil solidt fastgjort.
- Gnid et stykke klar tape på glimmer sikre, at den overholdes fuldt ud uden luftbobler. Træk tapen af glimmer fra den ene side til jævnt at spalte det. Gentag om nødvendigt at forsikre glimmer er flad.
- Grip støtte disken, ren glimmer side op, med et par cirkulære pincet (disk gribere), og placer på scanneren. Den glimmer skal være under niveauet for AFM hoved åbning.
3. fluidumcelle Montering og Imaging af Mica Surface
- Skyl fluidumcelle, O-ring, sprøjte-adapter, slange adapter og udstødning slange i 100% ethanol. Skyl fluidumcelle i DI-vand. Lad alle dele lufttørre helt.
- Skub slangen adapteren i porten på ren væske celle. Tryk forsigtigt O-ringen i midten indrykning af væsken celle ved hjælp af flad ledes pincet.
- Tryk fjederen let på sonden fastholdelsesklemme og drej den væk fra GROOVe til spidsen.
- Tag fat i sonden på den lange ende væk fra spidsen med flade ledes pincet. Placer sonden ind i rillen med spidsen vendende centrum af cellen. Skub fjederen og justere fastholdelsesklemmen over sonden for at sikre det (figur 1B).
- Kontroller klemmen på AFM til at sikre, at det er fuldt tilbagetrukket (figur 1C).
- Placer fluidumcelle, O-ring og sonde nedad, på toppen af glimmer prøven. Lad fluidumcelle at hvile på piggene af AFM. Sænk klemme til at stabilisere fluidumcelle på scenen. Tryk på ned-knappen på mikroskopet indtil en visuel inspektion viser O-ringen fast sammenpresset mellem støtte disken og væsken celle.
- Mens du ser skærmen, fokus grovskruen at visualisere toppen af fluidumcelle på skærmen.
- Flyt mikroskop, indtil der er et klart billede af spidsen ved hjælp af X / Y justeringsgrebene og Z mål. Spidsen vil appøre som en metallisk, gyldne trekant. Flyt spidsen tættere på prøvens overflade ved hjælp af ned piezo håndtaget på mikroskopet. Fokus på refleksion af drikkepenge. Hold styr på de faktiske cantilever i forhold til sine overvejelser. På dette stadium, bør de nøje afstemt, men ikke helt overlappende.
- Sæt sprøjten adapteren til en steril 1 ml sprøjte. Sæt den ene ende af udstødning slange til sprøjten adapteren og placer den anden ende af slangen i beholderen bufferopløsning. Helt ud stemplet af sprøjten.
- Fastgør slangen til slangeadapteren på væsken celle. Tryk forsigtigt på stemplet, indtil væsken fylder helt center kammer. Kontroller cellen for at sikre at der ikke er luftbobler. Kontroller der er ingen væske løber ud fra væsken celle på mikroskopet. Anbring sprøjten på en hævet fast bærer.
- Brug kameraet foder og X / Y oversættelse drejeknapper at finde laseren på skærmen (en diffus rød prik). Ved hjælp af laser movemskellige drejeknapper, flytte laseren på spidsen.
- Finjustere laseren og spejl kontrol, indtil sumsignal vises på mikroskopet er maksimeret (værdi = 4 - 6).
- Juster vinklen på kvadrant diode ved hjælp af knapperne på venstre bageste side og øverste venstre side af scanningen hovedet at sænke de lodrette og vandrette nedbøjninger vises på mikroskopet så tæt på nul som muligt (± 0,1).
- I softwaren, skal du vælge optioner på køb. På et minimum, skal du vælge højde (spor og tilbageløb), spidskraften fejl, og deformation. De andre muligheder er bruger afhængige og kan skræddersys på grundlag af specifikke oplysninger ønsket af experimentalist.
- Vælg "line" for RT-Plane Fit i hvert vindue erhvervelse. Vælg "ingen" for OT Plane Fit i højden vinduer. Sæt X og Y offset og scan vinkel til nul, hvis det ikke allerede er gjort.
- Indstil scanning sats på 1 Hz, prøven per linie til 256, den ScanAsyst automatisk styringtil individ, og ScanAsyst auto Z grænse til off. Skift Z grænse til 500 nm. Indstil scan-størrelse til 1 um.
- Klik på indgreb. På dette tidspunkt spidsen nærmer overfladen. Mens spidsen nærmer sig, observere Z-piezo spænding ændring i nederste venstre hjørne af skærmen. Hvis spidsen går uden for rækkevidde, trække spidsen og re-tilgang. Hvis dette ikke lykkes, kan spidsen skal ændres for at opnå en succesfuld strategi. Når spidsen er aktiveret, vil linjerne begynde at vises på hver af købet vinduer, der vil komponere et billede.
- Tag billeder af glimmer på 1 x 1 um og ind i langsomt at sikre, at glimmer overflade er ren og flad. Klik på kontinuerlig optagelse at gemme billeder, som de vises. Zoom ind og bevæge sig rundt i overfladen som ønsket.
4. Protein Deposition og Klargøring af prøven for Imaging
- Opnå renset protein prøve 38 og holde på is. Hvis den opbevares i en fryser, optø prøven påis i 5 minutter.
- Fortyndes proteinet til 0,0010 mg / ml ved hjælp af nedkølet billeddannelse pufferopløsning. Den billeddannende puffer bruges her er 15 mM Tris-HCI (pH = 8,0), 150 mM NaCI og 15 mM MgCl2.
- Fyld en 4 kammer (100 x 15 mm) petriskål med nedkølet billedbehandling bufferopløsning. Fyld hvert kammer med mindst 5 ml opløsning. Bland forsigtigt fortyndet proteinopløsning med spidsen knyttet til mikropipette.
- Påfør 200 pi af fortyndet proteinopløsning til overfladen af glimmer allerede forberedt. Efter 30 sek, afhente protein / glimmer overflade med de cirkulære pincet (disk gribere). Hold prøven parallelt laboratoriearbejdet.
- Mens du holder prøven straks nedsænke prøven i bufferopløsning indeholdt i den første kvadrant af petriskålen (trin 4.2) og samtidig sikre, at prøven er parallel med bassin af petriskålen. Efter 1 sek, skal du fjerne prøven.
- Fortsat at holde prøven parallelt bassinetaf petriskålen, gentag trin 4.5 for de resterende tre kvadranter.
- Placer pladen på et tørt støv fri klud til at opsuge overskydende fugt og overføre disken ind på scenen af mikroskopet. Rør ikke ved den faktiske med kluden. Lad ikke prøve at tørre.
- Gentag trin 3,6-3,16.
5. Imaging proteiner på Mica
- Klik på Kontroller parametre boksen på venstre side af skærmen. Spring størrelse og drikkepenge radius skal fastsættes ud på spidsen, der anvendes.
- Klik på indgreb. I lighed med glimmer billeddannende proces (trin 3.17), observere z-piezo vinduet, da spidsen tilgange.
- Lad scanneren til billedet det samme område i mindst to på hinanden følgende omgange. Klik på kontinuerlig optagelse for at gemme hvert billede indsamles.
- Flyt scanneren til en ny region og / eller ændre billedets størrelse som ønsket.
- Efter automatiseret software er færdig med at justerescanning parametre for en bestemt billede størrelse, slå softwaren fra.
- Manuel justering scanningshastighed, z grænse antallet af linjer, og spændingen for at finjustere billedets fokus. Hvis billedet bliver for langt ude af fokus, drej software igen for at returnere originalen startposition. For at øge opløsningen på et billede, mens du zoomer ind på et protein, mindske scanningen sats og øge antallet af linjer proportionalt.
- Efter eksperimentet, rense væske-celle med 100% ethanol og skyl med DI H 2 O. Lad væsken celle at tørre helt.
- Åbn data software til at behandle rådata billeder. Først flade billedet ved at klikke på ikonet fladere. Vælg Zero th orden og klik på eksekvere. Afhængigt af billedet, kan en plan pasform være nødvendigt at opnå en passende fladt billede. I dette tilfælde skal du vælge den pasform ikon planet og tegne en plan af et fladt område af billedet ved hjælp af markøren. Klik på udfør. Gentag om nødvendigt
- Select fanen tværsnit til at måle dimensionerne af proteinet. Tegn en linje med markøren flytte det over molekyle eller område, der skal analyseres. Gentag for flere områder, og softwaren vil generere et overlay. Eksporter billede eller de data, der anvendes til at generere billedet i et format kompatibelt med anden software og tegneprogrammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative AFM billeder af en fotoreceptor protein, P3 i dens lys-tilpassede tilstand er vist i figur 3 og 4. En frisk kløvet glimmer substrat (figur 3A) er en egnet, plan overflade for proteinadsorption. Indsamling et billede af ren glimmer som en negativ kontrol er vigtig af flere grunde. For det første sikrer det flydende celle er ren og ingen reststoffer fra tidligere eksperimenter vil forurene overfladen. For det andet tester kvaliteten af sonden. Hvis sonden er snavset eller deformeret, vil dette vises i billedet som striber eller præsentere sig som støj. Endelig en ren glimmer billede bekræfter sonden kan passende indstilles til fremtidige forsøg.
Enkelt fotoreceptor protein dimerer kan observeres ved hjælp af PeakForce QNM hvis overfladen dækning er passende (figur 3B, C). Pile signalere individuelle dimerer; stjernen betegner et proteinaggregat. Denkoncentration af proteinet prøven, aflejring tid og ionstyrke billeddannelse bufferen påvirke overfladedækning. 23. For en høj fordeling af enkelte molekyler, meget fortyndet opløsning med korte deposition tider er påkrævet. For eksempel fordobles deposition tid giver en høj fordeling af endnu større aggregater. Hvis proteinkoncentrationen forøges til 0,100 mg / ml, der observeres en tynd film af fotoreceptorer uden at ændre Nedsmeltningstiden eller buffer ionstyrke.
Brug billede analyse software kan måles, tværsnit af proteinerne efter billedet er fladtrykt (Figur 4). Tværsnitsarealet giver xy-data med tilsvarende højdemålinger. Disse målinger kan bruges til at give strukturelle detaljer, protein / overfladevand interaktioner, mekanisk styrke mv xy-data kan indviklede ved AFM sonde; imidlertid kan denne virkning minimeres ved anvendelse af en skarpere probe. Faktisk chois probe er en delikat balance mellem en acceptabel mængde af foldning og modstanden af det afbildede materiale til skade ved en skarp sonde. Tip foldning kan også trækkes fra det billede, hvis det er nødvendigt, ved hjælp af passende software.
Disse billeder kan være direkte i forhold til tidligere offentliggjorte billeder opsamlet ved hjælp af tappe-mode AFM. 20 De målte dimensioner af P3 på glimmer ved hjælp PeakForce QNM er inden for 5% af værdierne opnået med tappe-mode AFM.
Figur 1. Flydende-Cell Atomarkraftmikroskopi. (A) Laser, cantilever, sonde og overflade tilpasning. Sonden og cantilever er fastgjort i flydende celle. (B) Flydende celle. Sonden, cantilever, og prøve er fuldstændig nedsænket i væsken. (C) Complete forsamling. Den flydende celle er knyttet til en mikrometer. Billedet viser det optiske hoved og scanner i forhold til den flydende celle. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. PeakForce Kvantitativ nanomekaniske Ejendom Mapping Dette er en illustration til en lille top kraft (A) metode (B) Gå til Kontakt (C) Peak Kraft (D) Vedhæftning (Ø) Kør.. Figuren blev gengivet og tilpasset med tilladelse. 15
Figur 3. Atomarkraftmikroskopi P3 på Mica. (A) Billede af ren glimmer (1 x 1 um) (B) Billede (1 um x 1 um) P3. Anvendes på glimmer. Pilene angiver eksempler på enkelt protein-dimerer. Stjernen angiver en samling af protein-dimerer. (C) Billede (170 x 170 nm) af to protein-dimerer med en tredimensional indsat en enkelt dimer. Indsætningstegn betegner hvilket protein dimer er til stede i det indsatte. Alle billeder blev taget i overværelse af den billeddannende buffer (proteinkoncentration = 0,0010 mg / ml til deponering). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. tværgående analyse af P3 på Mica. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AFM er et scanning probe mikroskopi metode fuldt ud i stand til billeddannelse proteiner og andre biologiske makromolekyler i fysiologisk relevante betingelser. I sammenligning med røntgenkrystallografi og NMR-, en begrænsning af AFM er dens manglende evne til at opnå den samme opløsning, især lateral opløsning. Når du bruger AFM til at analysere et molekyle på enhver overflade, skal virkningen af overfladen og sonden på billedet af molekylet også overvejes, når data analyseres. Deconvoluting af sonden indflydelse på den overtagne billede kan suppleres med passende software. Udvikling af teoretiske modeller at sammenligne med eksperimentelle resultat kan også vise sig at være ganske nyttigt.
I dette papir, AFM billeder af en bakteriel rødt lys fotoreceptor, RpBphP3 (P3), præsenteres (Figur 3). Mens beskrivelserne af mikroskopet montage og softwaren drift er specifikke for den pågældende model af instrumentet, der anvendes, glimmerog protein procedurer for prøveforberedelse er generelle og kan anvendes på enhver AFM eksperiment.
Et par kritiske trin i denne protokol skal følges for at opnå det ønskede protein dækning på glimmer overflade. For det første skal den fortyndede proteinopløsning være forsigtigt blandet, før det påføres glimmer overflade (trin 4.3). På grund af den høje molekylvægt P3 deponering løsning er ganske kolloid; derfor P3 afregner til bunden af røret over tid gør uhomogen opløsningen. En blid røre afhjælper dette problem. Det andet, når proteinet anvendes, skal overfladen skylles for at fjerne løst bundne molekyler (trin 4,5-4,6). Hvis løst bundet P3 forbliver på overfladen, vil molekylerne enten frigives i opløsningen, når væsken celle er fyldt med pufferopløsning og / eller afhentes af AFM probe under eksperimentet. Begge disse begivenheder hindrer en vellykket billeddannelse eksperiment. Hvisvæske-celle bliver kontamineret med P3, må det skilles ad og rengøres grundigt. Hvis AFM sonden opfanger et molekyle, det typisk skal udskiftes eller billede der slækkes på kvaliteten. Endelig har den metode skylning proteinprøven er kritisk for at opnå fremragende billeder. Glimmer er et ikke-selektivt overflade til P3; Derfor bør de molekyler, der findes at være orienteret tilfældigt. Fremgangsmåden til skylning beskrevet i protokollen er en måde at undgå omarrangere molekylerne på overfladen i en enkelt orientering. Det centrale er at altid at holde prøven våd og at undgå at holde overfladen i en vinkel og bogstaveligt sprøjtning overfladen med buffer. Hvis prøven skylles ved at dyppe, mens du holder den parallelt med det bækken en petriskål, er forvridningen af P3 på overfladen ved kraft strømme i pufferopløsning minimeret.
Alle dele til flydende celle, sonde, scanner og optiske hoved er meget sarte og skal håndteres med forsigtighed. Det springs, der holder scanneren og optiske hoved sammen er meget stærk. Det er bydende nødvendigt at holde en hånd på scanneren, når du samler eller forstille nogen af brikkerne. Til PF-QNM med ScanAsyst software, som beskrevet i protokollen, er det vigtigt at slukke for automatiseret software kontrol af Z-limit og sætte denne værdi til mindst 500 nm, hvis den oprindelige scanning størrelse er 1 um (trin 3.16) . Dette beskytter scanneren, hvis overfladen er blevet uventet ru eller er blevet forurenet. Når et enkelt billede er blevet indsamlet og det bekræftes, at det afbildede område er glat, kan Z-grænse justeres nedad manuelt for at opnå billeder i højere opløsning. Det er afgørende at justere Z-grænsen tilbage til mindst 500 nm, når scanneren er flyttet til et nyt område af overfladen eller hvis spidsen trækkes tilbage, uanset årsagen.
Mens dette papir har været fokuseret på at bruge PF-QNM at opnå en høj kvalitet topografiske billeder, kan selve metoden giver etbibliotek af yderligere oplysninger om den mekaniske styrke og fleksibilitet af overfladestrukturer. Denne funktion kan føre til yderligere indsigt i funktionalitet ved blot at vælge de rette kanaler under eksperimentet. 16,18 Med hensigtsmæssige ændringer til koncentrationen af deponering opløsningen og / eller overfladen, kan denne metode være generelt for at bruge PF-QNM at undersøge biologiske makromolekyler af væske-celle AFM. Med den automatiserede hjælp af software, kan eleverne i øverste niveau videnskab kurser med nogen forudgående erfaring med AFM fuldføre en væske-celle AFM eksperiment langt hurtigere end med den traditionelle aflytning-mode AFM. Eleverne kan opleve det grundlæggende i AFM og få en smagsprøve på den tværfaglige forskning muliggjort af denne kraftfulde teknik inden en typisk 3 - 4 timers laboratorium sektion tidspres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
NSF-MRI-programmet (CHE: 1229103) er anerkendt for at finansiere køb af nye styringselektronik, software, flydende celler og andet nødvendigt udstyr til at samle en dobbelt AFM / STM. Vi anerkender de delte faciliteter på The University of Chicago NSF-MRSEC programmet (DMR-0.820.054) for at få hjælp med AFM instrumentering, uddannelse og billedbehandling, og instrumentet tid stilles til rådighed af Materials Research Facilities Network (DMR-0.820.054). Vi især takke Dr. Qiti Guo, dr Justin Jureller, og professor Ka Yee Lee til byde vores studerende, før finansieringen af NSF-MRI forslag, der bragte den nødvendige instrumentering til vores campus. Vi anerkender finansiering fra et afsnit III STEM tilskud (ID: P031C110157) udstedt på Northeastern Illinois University, leveres sommer forsknings-stipendier for studerende og fakultet samt støtte til forbrugsstoffer. Endelig har vi erkende Bruker-Nano, Inc. for fortsat instrumentel støtte og om tilladelse til reproduce et plot, der viser mekanismen i PeakForce QNM og at bruge ordet ScanAsyst at beskrive automatiseret software.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
References
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C.
- Sonnenfeld, R., Hansma, P. K.
- Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
- Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
- Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
- Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
- Viani, M. B.
- Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
- Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Poggi, M. A.
- Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
- Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
- Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
- Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
- Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
- Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
- Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
- Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
- Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
- Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
- Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
- Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
- Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
- Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
- Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
- Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
- Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
- Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
- Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
- Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
- Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
- Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
- Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
- Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
- The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , Schrodinger, LLC. Forthcoming.
- Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
- Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
- Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928 (2011).
- Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
- Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).
