Abstract
Atomic force microscopy (AFM) bruker en pyramideformet spiss festet til en konsoll for å undersøke styrken respons av en overflate. De nedbøyninger av spissen kan måles til ~ 10 pN av en laser og sectored detektor, som kan omdannes til bilde topografi. Amplitudemodulasjon eller "tappe mode" AFM omfatter sonden slik intermitterende kontakt med overflaten samtidig som oscillerer med sin resonans frekvens for å frembringe et bilde. Brukt i forbindelse med en fluidcelle, gjør det mulig å tappe-modus AFM avbildning av biologiske makromolekyler, for eksempel proteiner i fysiologisk relevante betingelser. Tappe-modus AFM krever manuell innstilling av sonden og hyppige justeringer av et mangfold av skanningsparametere som kan være utfordrende for uerfarne brukere. For å få bilder av høy kvalitet, disse justeringene er den mest tidkrevende.
PeakForce Kvantitativ Nanomechanical Eiendom Mapping (PF-QNM) produserer et bilde ved å måle en kraft response kurve for hvert kontaktpunkt med prøven. Med ScanAsyst programvare, kan PF-QNM være automatisert. Denne programvaren justerer set-point, drive frekvens, scan rate, gevinster, og andre viktige skanningsparametere automatisk for en gitt prøve. Ikke bare gjør dette prosessen beskytte både skjøre prober og prøver, reduserer den tiden som kreves for å få bilder med høy oppløsning. PF-QNM er kompatibel for AFM bildebehandling i væsken; Det har derfor bred anvendelse for avbilding av biologisk relevante materialer.
Metoden som presenteres i dette notatet beskriver anvendelsen av PF-QNM å få bilder av en bakteriell red-light fotoreseptoren, RpBphP3 (P3), fra fotosyntese R. palustris i sitt lys-tilpasset tilstand. Ved hjelp av denne metode, har individuelle protein dimerer av P3 og aggregater av dimerer er observert på et mica overflate i nærvær av en bildebuffer. Med nødvendige justeringer til overflaten og / eller løsning konsentrasjon, denne metodenkan generelt anvendes på andre biologisk relevante makromolekyler og myke materialer.
Introduction
Atomic force microscopy (AFM) er blitt et meget viktig hjelpemiddel for å undersøke de strukturelle og mekaniske egenskaper av overflater, tynne filmer, og enkle molekyler siden den foreliggende oppfinnelse i 1986 (figur 1). 1-3 Ved hjelp av en væske-celle, har metoden blir spesielt nyttig for studier av biologiske makromolekyler og med levende celler i et fysiologisk relevant miljø. 4-10 Tapping-modus AFM har tradisjonelt blitt brukt for å avbilde myke materialer eller løst bundne molekyler til overflaten, ettersom kontakt-modus AFM er vanligvis uegnet på grunn til skaden forårsaket av sidekrefter som virker på prøven ved cantilever. 11 Tapping-modus AFM reduserer vesentlig disse kreftene ved å ha spissen periodevis berøre overflaten heller enn å være i konstant kontakt. I denne modus blir cantilever oscilleres ved eller nær dens resonansfrekvens normalt til overflaten. Tilsvar å kontakte-modus AFM, er topografi analyzed ved å plotte bevegelse av z-piezo som en funksjon av xy (avstand).
De uthengende dynamikk kan være ganske ustabile ved eller i nærheten av resonans; derfor er de svært utfordrende å automatisere utenfor en "steady-state" situasjon. Nærmere bestemt er disse dynamikken avhenge både av de eksempel egenskaper og scanning miljø. For en myk molekyl adsorbert til en hard (eh) overflate, kan et godt avstemt tilbakekoblingssløyfe for molekylet fører til tilbakesvingningen til overflaten. Drift i væske ytterligere kompliserer tuning av cantilever. Endringer i temperatur eller væskenivåer krever konstant omstilling av settpunkt, gevinster, og andre bildebehandlingsparametere. Disse justeringene har en tendens til å være svært tidkrevende og utfordrende for brukerne.
Peak Force Kvantitativ Nanomechanical Eiendom Mapping (PF-QNM), som å banke modus AFM, unngår lateral interaksjoner ved periodisk kontakte prøven (figur 2). 12-15 </ Sup> Men opererer PF-QNM i ikke-resonant modus og frekvenser mye lavere enn å tappe-modus AFM. Dette eliminerer innstiller utfordringene ved å tappe-modus AFM, spesielt de som er forsterket av tilstedeværelsen av fluid. Med PF-QNM, vil bildene samlet ved å ta en kraft responskurve på hvert kontaktpunkt. Med tillegg av ScanAsyst programvare, kan 15 justering av skanneparametere automatiseres og et bilde med høy oppløsning oppnådd i løpet av minutter etter selv uerfarne brukere. Når brukeren blir mer kjent med AFM, kan noen eller alle av de automatiserte parametere deaktiveres til enhver tid som tillater experimentalist å fininnstille bildekvaliteten manuelt. Siden begynnelsen, har PF-QNM blitt brukt for å kartlegge bacteriorhodopsin, en membran protein, og andre innfødte proteiner på submolecular nivå. 16-18 For bacteriorhodopsin, det er en direkte sammenheng mellom protein fleksibilitet og X-ray krystallografiske strukturer. 12 PF -QNM blitt anvendt for å undersøke levende celler med høy oppløsning. 19,20 Videre er PF-QNM data belyst viktige forbindelser mellom struktur og mekanikken i erytrocytt-membran som er kritisk for celleintegritet og funksjon. 21.
Vi har ansatt scanning probe mikroskopi (SPM) metoder, 22 inkludert AFM, 23 til å studere strukturen av red-light fotoreseptorer kalt bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 De består av en lys sensing modul kovalent bundet til et signal-effektor modul slik som histidin kinase (HK). 26. Lyset følermodulen inneholder typisk en Bilin kromofor som gjennomgår en strukturell transformasjon ved absorpsjon av et foton med en rekke strukturelle endringer som når signale-effektor-modul og som fører til en global transformasjon av hele proteinet . 24,27-29 Basert på denne transformasjonen, er det to distinkte lysabsorberende sTates av BphPs, en rød og langt rødt lys absorberende tilstand, betegnet som Pr og PFR. Pr er termisk stabile, mørk-tilpasset tilstand for de fleste BphPs. 28 Den molekylære grunnlaget for Pr / PFR photoconversion er ikke helt forstått på grunn av begrenset strukturell kunnskap om disse proteinene. Med unntak av en struktur fra D. radiodurans, 30 alle publiserte røntgen krystallografiske strukturer av disse proteinene er i mørket-innrettet tilstand, og mangler effektor domenet. De intakte BphPs er for store til å være effektivt undersøkt ved kjernemagnetisk resonans (NMR) og er notorisk vanskelig å krystallisere i sin intakte form (særlig i lys-innrettet tilstand) for røntgenkrystallografi. BphPs har nylig blitt utviklet som infrarød fluorescerende protein markører (IFP-tallet). 31 strukturell karakterisering av disse proteinene kan ytterligere hjelp i effektiv IFP design. 32-36
Fokus for denne artikkelen er å presentere en prosedyre foravbildning av BphPs med flytende-celle AFM via PF-QNM. Fremgangsmåten er vist ved studier av lys-innrettet tilstand av bacteriophytochrome RpBphP3 (P3) fra den fotosyntetiske bakterien R. palustris. AFM prosedyren som presenteres her er praktisk og grei tilnærming for avbildning av proteiner samt andre biologiske makromolekyler. Med denne metoden kan strukturelle detaljer av individuelle molekyler samles i en kort tid, tilsvarende et øvre nivå science selvfølgelig laboratorie sesjon. Gjennom måling av tverrsnitt og fullføre ytterligere dimensjonale analyser, kan eksperimentelle data sammenlignes med nyttige beregningsmodeller. 37-42
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Datamaskin og mikroskop Set Up
- Åpne ventilen på N 2 sylinder og justere knottene for å sikre luft tabellen er flytende og nivå.
- Slå på datamaskinen, controller, og fiberoptisk lys i denne rekkefølgen.
- Sett skanneren til AFM / LFM modus og sentrere kameraet over AFM hodet.
- Åpen programvare. Velg eksperiment kategorien "Nanomechanical Properties", "Quantitative Nanomechanical Mapping" under eksperiment gruppe, og "PeakForce QNM i Fluid" under eksperimentet. Klikk Load Eksperimenter og deretter Oppsett.
- Fokuser kameraet ved hjelp av Z mål å se overflaten av scenen. Ved hjelp av den grove opp / ned piezos bevege stadium omtrent 1 mm under overflaten av AFM hodeåpningen.
2. Utarbeidelse av Mica Surface
- Trykk en selvklebende klistremerke på ansiktet av en ren prøve støtte disk (15 mm diameter, 0,8 mm tykk). Skyv en glimmer V-4grade skiven (25 x 25 x 26 mm) inn på klebemidlet inntil den sitter fast.
- Gni et stykke klar tape på glimmer slik at den er fullt levd uten luftbobler. Trekk tape av glimmer fra den ene siden til jevnt kløyve den. Gjenta om nødvendig for å sikre at glimmer er flat.
- Grip støtte disk, rent glimmer siden opp, med et par sirkulære pinsett (disk grippers), og plasser den på skanneren. Den glimmer bør være under nivået for AFM hodeåpningen.
3. Fluid Cell Montering og Imaging av Mica Surface
- Skyll væsken celle, O-ring, adapter sprøyte, slange adapter, og utstøting slangen i 100% etanol. Skyll fluidcellen i DI-vann. La alle deler luft tørke helt.
- Skyv slangeadapteren inn i porten på ren væske celle. Trykker du på O-ringen forsiktig inn til sentrum innrykk av væsken cellen ved hjelp av flat ledet pinsett.
- Trykk på våren lett på sonden holderklemmen og vri den bort fra GROOVe for tipset.
- Ta tak i sonde på den lange enden bort fra spissen med flate ledet pinsett. Plasser sonden inn i sporet med den som vender mot sentrum av cellen spissen. Skyv våren inn og justere festeholderen over sonden for å sikre det (figur 1B).
- Sjekk klemmen på AFM å sikre at det er helt tilbaketrukket (figur 1C).
- Plasser fluidcelle, O-ringen og sonden vender nedover, på toppen av mica utvalget. La væsken cellen til å hvile på stenderne i AFM. Senk klemmen å stabilisere væske celle på scenen. Trykk ned bryteren på mikroskopet til en visuell inspeksjon viser O-ring fast komprimert mellom støtte disk og væsken cellen.
- Mens ser på skjermen, fokusere grovjusteringsknotten for å visualisere toppen av fluidcellen på skjermen.
- Flytt mikroskop til det er et klart bilde av spissen ved hjelp av X / Y justeringsknapper Z målet. Spissen vil appøret som en metallisk, gylne triangel. Beveg spissen nærmere prøvens overflate ved hjelp av ned piezo spaken på mikroskop. Fokus på refleksjon av spissen. Hold orden på selve cantilever i forhold til sin refleksjon. På dette stadiet, bør de ligge nært opp, men ikke helt overlappende.
- Fest sprøyten adapteren til en steril 1 ml sprøyte. Fest en ende av utkastslangen til sprøyten adapter og plasserer den andre enden av slangen i beholderen av bufferløsning. Fullt forlenge stempelet på sprøyten.
- Feste slangen til slangeadapteren på væske celle. Trykk forsiktig på stempelet inntil væsken fullt fyller kammeret. Kontroller mobil å sikre det ikke er luftbobler. Sjekk for å se det ikke er noen fluid søle ut fra fluidcellen på mikroskop. Plasser sprøyten på en hevet fast bærer.
- Bruk kameraet fôr og X / Y oversettings knotter for å finne laseren på skjermen (en diffus rød prikk). Ved hjelp av laser movement kontroll knotter, flytte laseren på spissen.
- Fint justere laseren og speilkontroller til sum-signalet vist på mikroskopet er maksimert (verdi = 4 - 6).
- Juster vinkelen på kvadranten diode å bruke knottene på siden venstre bak og øverst på venstre side av skannerhodet å senke de vertikale og horisontale nedbøyninger vises på mikroskopet så nær null som mulig (± 0,1).
- I programvaren, velger oppkjøpsmuligheter. På et minimum, velg høyde (spor og retrace), peak force feil, og deformasjon. De andre alternativene er brukeravhengig og kan skreddersys basert på den spesifikke informasjonen ønsket av experimentalist.
- Velg "line" for RT Plane Fit i hvert kjøp vinduet. Velg "Ingen" på OT Plane passe i høyde vinduer. Sett X og Y-forskyvning og skannevinkelen til null hvis det ikke allerede er gjort.
- Sett skannehastighet til 1 Hz, prøven per linje til 256, den ScanAsyst automatisk kontrolltil person, og ScanAsyst auto Z grensen til off. Endre Z grensen til 500 nm. Sett skannestørrelse til 1 mikrometer.
- Klikk engasjere. På dette tidspunkt nærmer seg spissen overflaten. Mens spissen nærmer seg, observere Z piezo spenningsendring i nedre venstre hjørne av skjermen. Hvis spissen går utenfor rekkevidde, trekke spissen og re-tilnærming. Dersom dette ikke lykkes, kan spissen må endres for å få en vellykket tilnærming. Når spissen er engasjert, vil linjene begynner å vises på hver av oppkjøpet vinduer som vil komponere et bilde.
- Ta bilder av glimmer ved 1 x 1 mikrometer og zoome inn langsomt for å sikre at glimmer overflaten er ren og flat. Klikk kontinuerlig fangst til å lagre bilder som de dukker opp. Zoome inn og flytte rundt på overflaten som ønsket.
4. Protein Nedfall og Fremstilling av prøve for Imaging
- Oppnå renset protein prøven 38 og holde på is. Hvis den lagres i en fryser, tine prøven påis i 5 min.
- Fortynn protein til 0,0010 mg / ml ved anvendelse av nedkjølt bildebufferløsning. Den bildebufferen brukt her er 15 mM Tris-HCl (pH = 8,0), 150 mM NaCl og 15 mM MgCl2.
- Fyll en fire kammer (100 x 15 mm) petriskål med nedkjølt bildebufferløsning. Fyll hvert kammer med minst 5 ml oppløsning. Bland forsiktig den fortynnede protein løsningen med festet til mikropipette tips.
- Sett 200 ul av den fortynnede proteinoppløsningen til overflaten av glimmer som allerede er fremstilt. Etter 30 sek, plukke opp protein / glimmer overflate med de sirkulære pinsett (disk grippers). Hold prøven parallelt med laboratoriebenken.
- Ved å holde i prøven, umiddelbart dyppe prøven i bufferløsningen inneholdt i den første kvadrant av petriskål (trinn 4.2) og samtidig sikre at prøven er parallell med bassenget av petriskålen. Etter 1 sek, fjern prøven.
- Fortsetter å holde prøven parallelt med bassengetav petriskål, gjenta trinn 4.5 for de resterende tre kvadranter.
- Plasser disken på en tørr støvfri klut til å suge opp fuktighet og overføre disken på scenen av mikroskopet. Ikke ta på selve overflaten med kluten. Ikke la prøven tørke.
- Gjenta trinn 03.06 til 03.16.
5. Imaging Proteiner på Mica
- Klikk på sjekk parametere boksen på venstre side av skjermen. Fjær størrelse og neseradius bør settes basert på spissen som brukes.
- Klikk engasjere. På samme måte som mica bildeprosessen (trinn 3.17), observere z-piezo vindu idet tuppen tilnærminger.
- Tillat skanneren til bildet det samme området i minst to etterfølgende passeringer. Klikk kontinuerlig fangst for å lagre hvert bilde samlet.
- Flytt skanneren til en ny region og / eller endre bildestørrelsen som ønsket.
- Etter automatisert programvare har ferdig med å justereskanningsparametere for et bestemt bilde størrelse, slår programvaren av.
- Justere manuelt scan rate z grense, antall linjer, og spenning for å finjustere fokus i bildet. Hvis bildet blir for langt ut av fokus, slår programvare på igjen for å returnere den opprinnelige startposisjon. For å øke bildeoppløsningen mens du zoomer inn på et protein, redusere skannehastighet og øke antall linjer proporsjonalt.
- Etter forsøket rense væske-celle med 100% etanol og skyll med DI H 2 O. La væsken cellen til helt tørre.
- Åpne data programvare for å behandle rådata bilder. Først flate ut biletet ved å klikke på Flatten ikonet. Velg Zero th orden og klikk utføre. Avhengig av bildet, kan en plan form være nødvendig for å oppnå en hensiktsmessig flatt bilde. I dette tilfellet velger flyet passform ikonet og tegne et fly av et flatt område av bildet ved hjelp av markøren. Klikk utføre. Gjenta etter behov
- Select kategorien tverrsnitt å måle dimensjonene på protein. Trekke en linje med markøren beveger den over molekyl eller et område som skal analyseres. Gjenta for flere områder og programvaren vil generere et overlegg. Eksportere bildet eller de data som brukes til å generere bildet i et format som er kompatibelt med andre programvare og tegneprogrammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative AFM-bilder av en fotoreseptoren protein, P3 i sin lys-innrettet tilstand er vist i figurene 3 og 4. En fersk-spaltet glimmer substrat (figur 3A) er et egnet, flat overflate for protein adsorpsjon. Innhenting av et bilde av rent glimmer som en negativ kontroll er viktig av flere grunner. For det første sikrer den flytende cellen er rent og foreligger restmaterialer fra tidligere eksperimenter vil forurense overflaten. For det andre tester det kvaliteten av sonden. Hvis sonden er skitten eller deformert, vil dette vises i bildet som streker eller presentere seg som støy. Til slutt, bekrefter en ren glimmer bilde sonden kan være hensiktsmessig tuned for fremtidige eksperimenter.
Enkeltfotoreseptoren protein dimerer kan observeres ved hjelp av PeakForce QNM hvis overflatedekning er passende (figur 3B, C). Piler signal individuelle dimer; stjernene betegner et protein aggregat. DenKonsentrasjonen av proteinprøven, deponering tid, og den ioniske styrke av bildebufferen påvirke overflatedekning. 23. For en høy fordeling av enkle molekyler, meget fortynnede løsninger med korte avsetningstider er nødvendig. For eksempel dobling deponerings tid gir en høy fordeling av enda større aggregater. Hvis proteinkonsentra-sjonen økes til 0,100 mg / ml, en tynn film av fotoreseptorene er observert uten å endre deponerings tid eller buffer ionestyrke.
Ved hjelp av bildeanalyse-programvare, kan de tverrsnitt av proteiner måles etter at bildet er avflatet (figur 4). De tverrsnitt gi xy-data med tilsvarende høydemålinger. Disse målingene kan brukes til å tilveiebringe strukturelle detaljer, protein / overflate interaksjoner, mekanisk styrke, etc. xy-dataene kan bli convoluted av AFM sonde; Imidlertid, kan denne effekten bli minimalisert ved å bruke en skarpere probe. Faktisk chois av proben er en delikat balanse mellom en akseptabel mengde av konvolusjon og motstanden av den avbildede materialet til skade ved en skarp probe. Tip konvolusjon kan også bli subtrahert fra bildet, om nødvendig, ved hjelp av egnet programvare.
Disse bildene kan være direkte i forhold til tidligere publiserte bilder samlet inn ved hjelp tappe-modus AFM. 20 De målte dimensjonene P3 på glimmer bruker PeakForce QNM er innenfor 5% av verdiene oppnådd med tappe-modus AFM.
Figur 1. Væske-Cell Atomic Force Mikroskopi. (A) Laser, konsoll, probe, og overflate innretting. Sonden og utkragingen er festet inne i væskecelle (B). Flytende celle. Sonden, konsoll, og prøven er fullstendig nedsenket i væsken. (C) Komplete montering. Væsken cellen er festet til et mikrometer. Bildet viser optiske hodet og skanner i forhold til flytende celle. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. PeakForce Kvantitativ Nanomechanical Eiendom Mapping Dette er en illustrasjon for en liten topp kraft (A) Approach (B) Hopp til kontaktinformasjon (C) Peak Force (D) Heft (E) Trekk tilbake.. Figuren ble reprodusert og tilpasset med tillatelse. 15
Figur 3. Atomic Force Mikroskopi av P3 på Mica. (A) Bilde av rent glimmer (1 x 1 mm) (B). Image (1 um x 1 mm) av P3 brukt til glimmer. Pilene viser eksempler på enkelt protein dimer. Stjernen angir et aggregat av protein dimerer. (C) Bilde (170 x 170 nm) av to protein dimerer med en tre-dimensjonal nedfelling av en enkelt dimer. Cirkumflekstegnet utpeker hvilke protein dimer er til stede i det innfelte. Alle bildene ble tatt i nærvær av bildebuffer (protein konsentrasjon = 0,0010 mg / ml for deponering). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Tverrsnitt Analyse av P3 på Mica. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AFM er et skanning mikrosonde metode fullt ut i stand til å avbilde proteiner og andre biologiske makromolekyler i fysiologisk relevante betingelser. I forhold til røntgen-krystallografi og NMR, er en begrensning av AFM sin manglende evne til å oppnå den samme oppløsning, spesielt lateral oppløsning. Ved bruk av AFM å analysere et molekyl på en hvilken som helst overflate, må virkningen av overflaten og sonden på bildet av molekylet også tas i betraktning når data analyseres. Deconvoluting av sonden innvirkning på ervervet bildet kan bli avsluttet med nødvendig programvare. Utvikle teoretiske modeller å sammenligne med eksperimentelle utfallet kan også vise seg å være ganske nyttig.
I denne utredningen, AFM bilder av en bakteriell red-light fotoreseptoren, RpBphP3 (P3), blir presentert (figur 3). Mens beskrivelsen av mikroskopet montering og programvareoperasjon er spesifikke for den spesielle instrument modell anvendes, glimmerog proteinprøvefremstillings-prosedyrer er generelt og kan bli brukt på en hvilken som helst AFM eksperiment.
Noen få kritiske trinn av denne protokollen må følges for å oppnå det ønskede protein dekning på glimmer overflate. For det første må den fortynnede proteinoppløsningen være forsiktig blandet før den påføres på overflaten glimmer (trinn 4.3). På grunn av den høye molekylvekten til P3, er deponering løsningen ganske kolloidalt; Derfor legger seg P3 til bunnen av røret over tid å innstille oppløsningen til ikke-homogen. En mild oppstuss remedier dette problemet. For det andre, når proteinet blir anvendt, på overflaten, må vaskes for å fjerne eventuelle løst bundne molekyler (trinn 4.5 til 4.6). Dersom løst bundet P3 forblir på overflaten, vil molekylene enten slippes ut i løsning når den flytende cellen er fylt med bufferløsning og / eller plukket opp av AFM probe i løpet av eksperimentet. Begge disse hendelsene hindre en vellykket bildebehandling eksperiment. Hvisdet væske-cellen blir forurenset med P3, må den demonteres og rengjøres grundig. Hvis AFM probe plukker opp et molekyl, det vanligvis må skiftes eller bekostning av bildekvaliteten. Endelig er fremgangsmåten for å skylle proteinprøven kritisk for oppnåelse av gode bilder. Glimmer er et ikke-selektiv flate til P3; derfor bør molekylene bli funnet å være orientert tilfeldig. Fremgangsmåten for skylling beskrevet i protokollen er en måte for å unngå å rearrangere de molekyler på overflaten i en enkelt retning. Nøkkelen er å alltid holde prøven våt og for å unngå å holde overflaten i vinkel og bokstavelig talt å sprøyte overflaten med buffer. Hvis prøven blir skylt ved dypping, mens den holdes parallell med bassenget av en petriskål, er forvrengningen av P3 på overflaten av styrke strømninger av bufferløsningen minimert.
Alle delene til flytende celle, sonde, skanner, og optisk hode er svært delikat og må behandles med forsiktighet. Den springs som holder skanneren og optiske hodet sammen er veldig sterk. Det er viktig å holde en hånd på skanneren ved montering eller dissembling noen av stykkene. For PF-QNM med ScanAsyst programvare, som beskrevet i protokollen, er det viktig å slå av automatisert programvare kontroll av Z-grensen og sette denne verdien til minst 500 nm hvis den opprinnelige skannestørrelse er en mikrometer (trinn 3.16) . Dette beskytter skanneren hvis overflaten er blitt uventet ru eller er blitt forurenset. Når et enkelt bilde har blitt samlet inn og det er bekreftet at den avbildede området er glatt, kan den Z-grenseverdi justeres nedover manuelt for å oppnå bilder med høyere oppløsning. Det er avgjørende å omstille den Z-grense tilbake til minst 500 nm når skanneren er flyttet til et nytt område av overflaten, eller dersom spissen er trukket inn en eller annen grunn.
Mens dette papiret har vært fokusert på å bruke PF-QNM å oppnå høykvalitets topografiske bilder, kan selve metoden gir enbibliotek av tilleggsinformasjon om den mekaniske styrke og fleksibilitet av overflatestrukturer. Denne funksjonen kan føre til ytterligere innsikt om funksjonalitet ved ganske enkelt å velge de egnede kanaler i løpet av eksperimentet. 16,18 Med passende endringer i konsentrasjonen av innskudds-løsning og / eller på overflaten, kan denne fremgangsmåte være generelt for ved hjelp av PF-QNM å undersøke biologiske makromolekyler av væske-celle AFM. Med automatisert hjelp av programvare, kan elevene i videregående-nivå realfagene uten tidligere erfaring med AFM fullføre en væske-celle AFM eksperiment mye raskere enn med den tradisjonelle tappe-modus AFM. Studentene kan oppleve det grunnleggende AFM og få en smak av den tverrfaglige forskningen gjort mulig av denne kraftige teknikken innen en typisk 3 - 4 timers laboratorie delen tidsbegrensning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
NSF-MR program (CHE: 1229103) er anerkjent for å finansiere kjøp av nye styringselektronikk, programvare, flytende celler, og annet utstyr som trengs for å montere en dual AFM / STM. Vi erkjenner de felles fasilitetene på The University of Chicago NSF-MRSEC program (DMR-0820054) for å få hjelp med AFM instrumentering, opplæring og bildebehandling, og for instrument tid gjort tilgjengelig av Materials Research fasiliteter Network (DMR-0820054). Vi takker spesielt Dr. Qiti Guo, Dr. Justin Jureller, og professor Ka Yee Lee for våre studenter inn før finansieringen av NSF-MR forslag som brakte den nødvendige instrumentering til vår campus. Vi erkjenner midler fra en avdeling III STEM stipend (ID: P031C110157) tildelt Northeastern Illinois University som ga sommerforskningsstipend for studenter og lærere, samt støtte for forbruksartikler. Til slutt, vi erkjenner Bruker-Nano, Inc. for fortsatt instrumental støtte og for tillatelse til å reproduce et plott som viser mekanismen for PeakForce QNM og å bruke ordet ScanAsyst å beskrive den automatiserte programvare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
References
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, Available from: http://dx.doi.org/10.1103/PhysRevLett.56.930 930-933 (1986).
- Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (1986).
- Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
- Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
- Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
- Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
- Viani, M. B. Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time. Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).
- Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
- Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Poggi, M. A. Scanning Probe Microscopy. Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).
- Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
- Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
- Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
- Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
- Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
- Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
- Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
- Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
- Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
- Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
- Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
- Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
- Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
- Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
- Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
- Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
- Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
- Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
- Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
- Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
- Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
- Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
- Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
- Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
- The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , Schrodinger, LLC. Forthcoming.
- Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
- Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
- Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928 (2011).
- Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
- Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).
