Abstract
수초가 뉴런 및 신경교 세포 미엘린 형성을 모두 포함 복잡한 과정이며, 말초 신경계 (PNS)의 중추 신경계 (CNS) 및 희소 돌기 아교 세포에 슈반 세포. 우리는 시험 관내 수초 분석, 시험 관내에서 중추 신경계 수초를 연구하기위한 설립 된 모델을 사용하고 있습니다. 이를 위해서는, 희소 돌기 아교 세포 전구 세포 (개 OPC)는 myelinating 공동 배양을 형성하는 정제 된 차 설치류 후근 신경절 (DRG) 뉴런에 추가된다. 희소 돌기 아교 세포에 의해 발현 특정 단백질이 수초에 가하는 것을 구체적 역할을 심문하기 위해 우리는 선택적 DRG 뉴런 상에 파종 전에 야생형, 구성 적으로 활성 또는 우성 네거티브 단백질을 과발현하는 렌티 바이러스를 사용하여 OPC를 형질 도입 프로토콜을 개발했다. 이것은 우리가 구체적으로 수초를 조절하는 이러한 oligodendroglial 단백질의 역할을 심문 할 수 있습니다. 프로토콜은 또한 OT의 연구에 적용 할 수있다그녀의 세포 유형은, 이와 같은 시그널링 및 보상 메커니즘의 연구를위한 표적 올리고 덴드로 사이트 등의 원하는 세포 유형에 의해 발현 된 단백질의 선택적 조작을 허용하는 방법을 제공한다. 결론적으로, 렌티 바이러스 감염과 OPC에 수초 관내 분석을 결합하는 수초 형성에 관여하는 분자 메커니즘의 분석을위한 전략적인 도구를 제공한다.
Introduction
축삭 수초는 중추 신경계 및 말초 신경계에서 활동 전위의 신속하고 효율적인 전송을 위해 중요하다. 전문화 된 세포, 슈반 세포는 중추 신경계 및 말초 신경계에서 희소 돌기 아교 세포, 랩 어라운드 및 미엘린에 ensheathe 축삭 신경 효과적으로 절연막과 도약적인 도통 한 용이. 수초의 방법은 신경절 뉴런이 설계, 나노 파이버 3 또는 4 슈반 세포 또는 희소 돌기 아교 세포 중 5-7와 공 배양 후근 신경절 신경 세포를 사용하여 시험 관내에서 연구 될 수있다. 시험 관내 분석은 수초 신경계 수초 형성을 연구 확립 모델이며 생체 5-8에서 수초 동안 발생할 근본적인 많은 프로세스를 복제. 분석은 C에 대한 개 OPC와 등쪽 뿌리 신경절 (DRG) 뉴런의 정제 인구의 공 배양을, (포함NS의 수초) 또는 슈반 세포 (PNS의 수초 용). 특정 조건에서 이러한 myelinating 세포는 생체에 존재하는 수초 특정 단백질의 같은 보완을 표현 세포막을 절연의 주문, 매우 구조적으로 검증, 다중 층상 시트 DRG 축삭을 ensheathe.
시험관 내에서 CNS의 수초 형성을 연구하는 가장 일반적으로 사용되는 셀 모델이 성공적 뉴로 같은 외인성 인자는 체외 5,6에서 CNS의 수초 형성을 발휘한다는 효과를 연구하기 위해 사용되었다 DRG 뉴런 및 OPC에의 공동 배양한다. 이러한 성장 인자 또는 소분자 저해제로서 외인성 요인이 널리 DRG-OPC 공동 배양 모델을 사용하여 7,9 수초에서 신호 전달 경로의 역할을 연구하기 위해 사용되었다. 그러나, 뉴런 및 올리고 덴드로 사이트 모두 포함하는 혼합 된 공 배양 설정에서, 그것은 정식으로 남긴 것은 가능한 성장 인자 또는 하나의 Pharmacological 억제제는 DRG 신경 세포 및 희소 돌기 아교 세포 (OL) 모두에 따라 효과를 발휘 할 수 있었다. 이것은 특히 단백질 DRGs 의해서만 표현되거나 oligodendroglia 이중 셀이 시스템을 사용하는 것이 수초에 가하는 역할을 절개하는 능력을 제공한다. 명백하게 oligodendroglial의 신호 전달 경로가 직접 체외 수초 분석에 대한 DRG 뉴런에 파종하기 전에뿐만 아니라, 야생형과 돌연변이 단백질 모두를 과발현하는 우아한 방법이 될 입증되었습니다 수초, 개 OPC의 렌티 바이러스 전달, 조절되었는지 확인하려면 희소 돌기 아교 세포에 의해 항시 적으로 발현되는 단백질의 최저 식으로. 따라서이 방법은 특히 심문과 수초 9,10 공부 희소 돌기 아교 세포 내 신호 전달 경로 조작 할 수있는 수단을 제공합니다.
본 논문에서는, 우리는 우리가 렌티 바이러스를 통해 선택적으로 희소 돌기 아교 세포에 대한 관심의 단백질을 과발현하는 개발 방법을보고체외에서 수초를 연구하기위한 방법. 기술이 관심의 유전자를 포함하는 발현 벡터의 생성으로 시작하고 후속 pENTR 벡터 (L1-L2 pENTR pENTR4IRES2GFP) 내로 클로닝 야생형, 구성 적 활성 또는 우성 네거티브 형태로 될. (관심 유전자를 포함)이 벡터는, CMV 프로모터 공여체 (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) 및 2K7의 lentivector은 CMV 프로모터 함유 2K7 벡터, 관심있는 유전자를 생산하는 효소 반응으로 결합 내부 리보좀 진입 부위와 GFP (도 1). PMD2.G 바이러스 봉투 및 pBR8.91 바이러스 패키지와 결합이 게이트웨이 클로닝 2K7 구조체는이어서 OPC를 형질 도입하는데 사용될 수 렌티 바이러스를 생성하는 HEK293T 세포로 공동 형질 감염 될 수있다. 렌티 바이러스로 감염되면 OPC에 관심 단백질의 높은 레벨을 표현한다. 이 OPC를 다음 DRG 신경 세포 배양에 접종하고 그 효과를 발현 할 수있다목적 단백질의 높은 수준은 심문 수 수초화에 미치는. 공동 문화는 웨스턴 블롯 분석에 의해 수초 단백질 발현에 대한 평가 및 면역 세포에 의해 유수 축삭 세그먼트의 형성을 위해 시각입니다.
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Protocol
참고 : 본 연구에 사용 된 모든 동물 혼합 성별이었고, 해부학 및 병리과의 동물 시설 및 멜버른 대학에서 신경 과학 및 정신 건강 연구의 플로리 연구소에서 사육. 모든 동물의 절차는 멜버른 대학에서 동물 실험 윤리위원회에 의해 승인되었다.
2K7 Lentivector 1. 복제
- 2K7의 렌티 바이러스 벡터에 목적 유전자를 클로닝하기 전에 표준 분자 기법을 사용하여 11 pENTR 벡터 (3637 BP, 카나마이신 내성)로 유전자를 서브 클로닝. 서브 클로닝의 EcoRI 및 SacII 제한 사이트를 사용합니다.
- 2K7 Lentivector의 증폭
- 부드럽게 적격 세포와 플라스미드 DNA 100 ng를 혼합함으로써 2K7의 lentivector의 DNA를 변화시키고, 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
- 열 충격은 DNA / 적격 세포를 90 초 동안 42 ° C에서 혼합 ampici 모두 포함하는 LB 한천 플레이트에 그 판형LLIN (100 ㎍ / ㎖), 16 ~ 18 시간 동안 37 ° C에서 클로람페니콜 (15 ㎍ / ㎖).
주 : 클로람페니콜이 긴 말단 반복간에 재결합을 방지하기 위해 사용된다. - 다음날, 16-18 시간 동안 37 ℃에서 암피실린 (100 ㎍ / ㎖) 및 클로람페니콜 (15 ㎍ / ㎖)를 모두 함유하는 LB 배지에서 세균 클론을 선택 성장. 제조업체의 지침에 따라 상업용 플라스미드 DNA Maxiprep 키트를 사용하여 DNA를 추출합니다.
- 2K7 Lentivector에 pENTR 벡터에서 서브 클로닝 (그림 1)
그림 1 :. 게이트웨이 재조합 과정의 도식 표현 관심의 유전자, 여기에 플래그-ERK1로 표현이 pENTR L1-L2 벡터에 복제됩니다. 이 CMV 프로모터 백본 2K7 벡터를 함유 pENTR L4-R1 벡터에 추가된다. 이 세 벡터는에 LR Clonase II 플러스 효소에 의해 재결합바이러스 준비 2K7 벡터에의 관심 유전자 및 프로모터를 삽입합니다.- 1.5 ML 튜브에 다음을 추가하고 부드럽게 혼합 :
L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (프로모터) (60 BNG) 1-2.5 μL
(80 BNG) 1-2.5 μL (관심의 유전자와) L1-L2 pENTR4IRES2GFP
K7의 lentivector (80 NG / μL) 1 μL
TE 버퍼, pH가 82-5 μL
총 8 μL - -80 ° C에서 clonase 효소 믹스를 제거하고 2 분 동안 얼음에 해동. 효소가 실질적으로 반복 동결 - 해동 사이클 효율을 복제 줄였다로이 효소는 -80 ° C에서 신선한 나누어지는이 있는지 확인
- 반응 당 효소 2 μl를 추가하고 소용돌이를 통해 잘 혼합하고, 6-24 시간 동안 23 ~ 25 ℃에서 clonase 반응 혼합물을 배양한다.
- clonase 반응 혼합물에 (효소 키트와 함께 제공) 단백질 분해 효소 K 용액 1 μL를 추가하고 37 ° C에서 10 분 동안 품어.
- 유능한 세포로 clonase 반응 혼합물을 변환하고, 선택 성장16-18 시간 동안 37 ℃에서 암피실린 (100 ㎍ / ㎖) 함유하는 LB 배지에서 콜로니.
- 추출 및 제조 업체의 지침에 따라 상업용 플라스미드 DNA 미니 프렙 키트를 사용하여 DNA를 정화.
- SPE I 및 II 골목 관심 프로모터와 유전자를 함유하는 단편을 제거하기 위해, 제조업체의 지시에 따라, 적절한 버퍼를 이용하여 제한 효소 분해를 통해 DNA를 확인한다.
참고 :이 단계는 서브 클로닝 DNA가 오른쪽 벡터 백본 관심의 정확한 삽입 유전자를 가지고 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 삽입 단편이없는 벡터 자체의 크기는 6.7 이하이다. 풀어 삽입 단편의 크기는 프로모터 및 관심있는 삽입 유전자를 모두 포함한다. 플라스미드 편집기 - 예를 들어 DNA 시퀀스 편집 프로그램, APE를 통해 특정 유전자의 다이제스트에서 예상 단편 크기를 계산합니다. - DNA 벡터 골격 및 1 % 아가 로스 겔을 실행하여 출시 양쪽 단편의 크기를 확인1X TAE 버퍼에 100 V.에서 (재고 솔루션의 표 참조)
- 16-18 시간 동안 37 ℃에서 암피실린 (100 ㎍ / ㎖) 함유 LB 미디어 500ml에 박테리아의 성장을 확인하여 DNA를 증폭.
- 추출 및 제조 업체의 지침에 따라 상업용 플라스미드 DNA Maxiprep 키트를 사용하여 DNA를 정화.
참고 : Maxiprep은 일반적으로 바이러스 생산에 필요한 DNA의 충분한 양을 생성합니다.
- 1.5 ML 튜브에 다음을 추가하고 부드럽게 혼합 :
- 반복 렌티 바이러스 제제에 다음과 같은 DNA를 증폭하는 1.3.9-1.3.10 단계 : 제어와 같은 봉투 벡터 (PMD2.G, 6.1 KB), 패키지 벡터 (pBR8.91, 12.5 KB), 그리고 빈 렌티 바이러스 벡터를 (GFP -CMV-2K7, 8.7 킬로바이트).
2. 2K7 바이러스 생산
참고 : 1 일 :
- 트랜 스펙 션 당일, 25 ㎖ HEK293 T 세포를 포함하는 미디어 T175 플라스크 접시 32,000,000 HEK293 T 세포 (원액의 도표 참조). 대안 적으로, 16 만 세포 일 판형형질 전환하기 전에 시간이 형질의 날에 꽉 실행하는 경우.
참고 : 형질이 형질 전환 일 또는 그 이전에 하루에 세포를 도금하여 동일하게 성공할 수 있습니다. 두 가지 대안 중 하나를 사용하여, 여기에서 중요한 점은 확실 세포가 이전에 형질 전환에 배양 접시 표면에 갇혀 수 있도록하는 것입니다.
참고 : 제 2 일 : - 형질
- 형질 전환 이전에, 10 mM 트리스 pH가 8, 탈 이온수에 1 mM의 EDTA 산도 (8)를 포함 TE 버퍼 1 ㎍ / μL로 DNA를 희석.
- 50 ㎖ 튜브에, T175 플라스크에 형질 감염을위한 마스터 믹스 (표 1)을 제조 하였다. DNA를 추가하는 것은 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM)를 예열가 미리와 소용돌이에 의해 잘 혼합 한 후 조기 침전을 방지하기 위해 멸균 폴리에틸렌 이민 (PEI)를 (주 솔루션의 표 참조) 추가.
표 1 : 2K7 바이러스에 대한 준비 형질 믹스.벡터 trong> 집중 체적 pMDG.2 / μL 1 μg의 5 μL pBR8.91 / μL 1 μg의 15 μL GFP + 관심의 유전자와 2K7 벡터 / μL 1 μg의 22 μL 무균 폴리에틸렌 이민 (PEI) 1g / L 500 μL DMEM 2,100 μL - 튜브를 3-4 배 반전시켜 잘 혼합하고 실온에서 15 분 (RT) 동안 배양.
- HEK293T 세포에 대한 전체 미디어의 변화를 수행합니다. 기음 완전 세포로부터 배양 배지 오프 예열 HEK293T 세포 배양 배지 (T175 플라스크 당 25 ml)로 피드.
- 형질 전환 혼합물 (DNA / PEI 혼합물) 단층 세포에 적가를 추가합니다. 하룻밤, 37 ° C, 5 % CO 2에서 형질 감염된 세포를 잘 혼합 배양 부드럽게 이동합니다.
참고 : 주 3 : - 형질 전환에 성공 보장하기 위해, 형광 현미경을 통해 GFP 발현 24 시간 후 형질을 확인합니다.
주 : GFP를 발현하는 세포의 50 %는 일반적으로 좋은 형질을 나타낸다.
참고 : 주 4 : - 48 시간 게시물 형질에서 바이러스 상층 액을 수집하고 신선한 HEK293 T 미디어 (T175 플라스크 당 25 ml)로 교체합니다.
- 상층 액에서 세포 파편을 취소 4 ° C에서 10 분 동안 1,140 XG에 바이러스 뜨는을 원심 분리기. 전송은 4 ℃에서 50 ML 튜브 및 저장소에 뜨는을 삭제.
참고 : 제 5 일 :
- 상층 액에서 세포 파편을 취소 4 ° C에서 10 분 동안 1,140 XG에 바이러스 뜨는을 원심 분리기. 전송은 4 ℃에서 50 ML 튜브 및 저장소에 뜨는을 삭제.
- 72 시간 게시물 형질에서 바이러스 상층 액의 두 번째 배치를 수집합니다. 단계를 반복 2.3.1 수영장 (48)과 72 시간은 상층 액을 깨끗이 밀어 냈습니다.
- 30 ml의 초 원심 분리기 튜브를 사용하여 4 ℃에서 90 분 동안 17 XG에 바이러스, 원심 분리기 바이러스 상층 액을 집중합니다.
- 뜨는을 취소하고 모든 취소 상층 액이 바이러스의 (보이지 않는) 펠렛을 떠나 원심 분리를 더한 튜브의 바닥에 PEI를 침전 될 때까지 단계 2.6를 반복합니다.
- 바이러스를 재현 탁 초원 심 분리기 튜브에 500 μL SATO 미디어 (재고 솔루션의 표 참조) 추가합니다. 30 초에 대한 소용돌이차 기계적으로 바이러스를 느슨하게 피펫 팁과 튜브의 기반을 다 쳤어요. 바이러스 성 펠렛을 느슨하게하기 위해이 단계의 6 배를 반복합니다.
- 마이크로 원심 튜브에 재현 탁 바이러스를 풀 불용성 PEI를 제거하는 것이 매우 간단히 스핀. 단백질을 제거하기 위해 0.45 μm의 필터를 통해 뜨는을 필터링합니다.
- -80 ° C에서 20 μL, 50 μL, 100 μL 분주하고 저장소에 바이러스를 나누어지는.
HEK293T 세포 3. 바이러스 역가 결정
- 추가 바이러스 스톡의 희석액 시리즈를 관심있는 단백질의 발현을 확인하기 위하여 실험을위한 최적의 바이러스 농도를 결정하기 위해서 (예, 0, 5, 10, 20, 40, 80 μL)을 도금 된 HEK293 T 세포를 형질 도입하는 37 ° C에서 24 시간 동안 6 웰 플레이트, 문화, 5 % CO 2. 유전자의 강력한 발현을 달성하는 200 :이 프로토콜은 전형적 1시 50분 내지 1 범위의 농도에서 사용될 수 바이러스를 생성관심.
- 48 시간 게시물 바이러스 성 전달, 단백질 분해 효소 억제제와 TNE 버퍼를 Lyse HEK293T 세포 (원액의 표 참조).
- 냉장 DPBS로 두 번 우물을 씻어 다음 각 웰에 150 μL의 TNE 버퍼를 추가합니다.
- 최대 피펫 팅과 5-10x 아래로 용해 세포. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 전체 세포 용 해물을 전송하고 15 ~ 30 분 동안 얼음에 품어.
- 원심 분리기는 최대 속도 (20,000 XG) 및 전송에서 30 분 동안 4 ° C에서 해물을 브래드 포드에 의해 단백질 결정 이후 웨스턴 블롯 분석을위한 새로운 튜브에 뜨는을 삭제.
- 단백질 자체와 융착 태그 (즉, 플래그)에 대한 항체에 대해 프로빙 동안 표준 웨스턴 블롯 분석에 의해 관심있는 단백질의 발현 수준을 결정한다. > 95 % GFP + 세포와 실험에 대한 관심의 단백질의 강력한 표현을 산출 바이러스 희석을 사용합니다.
4. 분리 및 문화 DRGs의 (Figure 2는 1 & 2) 단계
그림 2 :. 체외 수초 분석 DRG 뉴런의 개략도 2 주 (1-2)를 통해 다음 정제 배양 P2-3 쥐 새끼, 해부한다. 개 OPC는 immunopanning를 사용 P7-9 쥐의 뇌에서 정제 (3). OPC를 다음 렌티 바이러스 및 48 시간 (4) 배양에 감염된다. OPC를 다음 DRGs에 시딩하고, BDNF 등 같은 임의의 관심있는 성장 인자 (5)을 첨가한다. 공동 문화 2 주 OPC를가 축삭을 차별화하고 myelinate 할 수 있도록하기위한 배양있다 (6). 마지막으로, 공동 문화는 중 서부 블로 팅을 위해 용해 또는 면역 세포 고정되어 있습니다 (7).참고 : 날 1-2 일 전에 해부 :
<OL> - 코트와 함께 22mm X 22mm 커버 슬립을 멸균 폴리 - L - 오르니 틴 (0.5 ㎎ / ㎖) 6 웰 플레이트에, 하룻밤 37 ℃에서 배양한다.
- 다음 날, 라미닌 다시 코트 된 커버 하룻밤 37 ° C에서 (MEM에서 20 μg의가 / ㎖)를 초과하는 대기음 및 조직 문화 후드에서 20 분 동안 건조.
참고 : DRGs의 해부 및 절연 : 2 일 : - 희생 P2-P3 쥐 새끼 자궁 절개하여 12 배.
- 동물의 뒷면에있는 근육을 덮는 피부를 제거합니다. 척추 뼈 구멍을 열고 부드럽게 척수을 퍼 집게를 사용하는 vannas 가위를 사용합니다.
- 척추 열 사이에 거짓말 DRGs을 튕기 3 ㎖ L-15 미디어를 포함하는 33mm 페트리 접시에 부착 한 후 척추 신경 섬유, 장소 DRGs를 잘라. 또한 척수의 각 측면에서 DRG 8과 12 사이를 수집하는 것이 가능하다
- 5 분 180 XG에 15 ML 튜브, 원심 분리기에 L-15 미디어와 함께 전송 수집 DRGs.
- 대기음상등액을 펠렛 DRG를 30 분 동안 37 ° C에서 배양 2ml의 0.25 % 트립신을 추가한다.
- 실온에서 3 분 동안 180 XG에 트립신, 원심 분리기를 중지 DRG 펠릿에 M1 매체 (원액의 표 참조) 5 ㎖를 추가합니다.
- 대기음 상청 (하지 성장 인자) 2 ㎖에 미리 예열 M1 매체 펠릿을 다시 일시. 50 배를 피펫 팅하거나 신경이 분산 될 때까지 신경 펠렛을 씹다. 3 분 180 XG에 원심 분리기 세포 현탁액.
- 재현 탁은 M1 미디어에서 신경 세포를 분해하고 잘 당 100 μL 당 5 신경절에서 6 웰 플레이트에서 아래로 판.
- , 첨부 파일을 촉진 M1 미디어를 제거하고 M2 매체와 신경 세포를 공급하는 4 시간 배양 최소 한 후, 비 신경 세포 증식 제거하려면 (원액의 표 참조). NGF (100 NG / ㎖)의 존재 하에서 배양 DRG 뉴런 NGF 의존적의 TrkA 발현 DRGs의 배양 물을 정제한다. 대안 적으로, BDNF 의존적 TrkB-EXPRES를 정화 BDNF (NG 100 / ㎖)를 사용하여DRGs 노래.
- 아래 2 주간 유사 분열 M2 미디어 교대 (100 NG / ㎖에서 + NGF 또는 BDNF) M1 미디어에서 뉴런을 유지한다.
- 일에 매체 M1 (+ 100 NG / ㎖에서 NGF 나 BDNF)를 유지 : 4-6, 8-10, 일 (1)에 12 ~ 14과 M2의 FDU와 미디어 (100 NG / ㎖에서 NGF 또는 BDNF +)와 딘에 4, 6-8, 10-12. M2 미디어 정화의 3주기의 최소 필요합니다.
- 이주의 유사 분열주기를 완료 한 후 추가로 일주일 M1에 DRGs 혼자 유지한다. 2-3 일마다 M1 미디어를 변경합니다.
5. 분리 및 개 OPC의 문화 (그림 2 단계 3)
참고 : 날 1-2 일 전에 해부 :
- 폴리 - D - 라이신 (PDL, 멸균 탈 이온수 10 ㎍ / ㎖)을 밤새 4 ° C에서와 코트 10cm 조직 배양 플레이트.
참고 : 주 2 : 해부하기 전에 일일 : - 배에 대한 멸균 탈 이온수로 PDL 판을 씻으십시오. 조직 문화 후드에 ~ 6 시간 동안 건조시킵니다. 바로 사용하지 않을 경우, 포장 및 저장4 ° C에서 최대 4 주 동안.
- immunopanning 2 차 항체 판을 준비합니다. 1 뇌 해부를 들어, 2 배의 IgG 판을 준비 (대한 RAN2 희소 돌기 아교 세포를 premyelinating 제거하는 성상 세포와 O1 항체를 제거하는 항체) 10cm 페트리 접시 당 DPBS 45 μL 염소 α 마우스의 IgG (15 ml)로,; (희소 돌기 아교 세포 전구 세포를 선택하기위한 O4 항체) 대 IgM의 1X 판 DPBS 45 μL 염소 α 마우스 IgM이 10cm 페트리 접시 당 15 ㎖.
참고 : 주 3 : 해부의 날 : - 파파인 버퍼 (표 2) 10ml에 파파인의 200 단위를 추가하고, 버퍼가 분명 될 때까지 37 ℃에서 예열.
표 2 : 파파인 완충액의 제조.집중 250 ml의 용 최종 농도 EBSS 재고 10 배 25 ml의 1 배 황산 100 mM의 2.5 ml의 1 ㎜ 포도당 30 % 3 ㎖ 0.46 % EGTA 0.5 M 1 ml의 2 mM의 의 NaHCO3 1 M 6.5 ml의 26 mM의 탈 이온수 및 필터 소독 250 ml의 볼륨을 가져와 - DP 모든 차 항체 판을 씻으십시오배를위한 BS.
- IgG의 판과 정부 간 회의 플레이트에 O4 하이 브리 도마에 RAN2과 O1 항체를 따르십시오. 실온에서 2 이상의 시간 동안 모든 차 항체 번호판을 품어.
- P7 쥐에서 뇌의 해부. 날카로운 가위로 강아지 목을 벨과 가위로 머리를 덮는 피부를 제거합니다.
- 후두엽, 측두엽에서와 전두엽에 두개골 주위를 잘라. 1 ML의 DPBS로 35 mm 페트리 접시로 전송 부드럽게 집게를 사용하여 두개골에서 뇌를 제거하고.
- 대략 가위 또는 멸균 블레이드와 작은 조각으로 뇌를 주사위.
- L 시스테인의 몇 그레인을 포함하는 새로운 15 ml의 필터 튜브에 미리 가온 파파인 완충액 (10 ml)을 다음 여과 파파인 완충액 200 μL의 DNAase (12,500 U / ㎖)을 추가한다.
- 다이 싱 뇌 조직 상 파파인 버퍼를 붓고; 90 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
- Gentlly 전송이 25 ㎖ 피펫을 사용하여 50 ㎖ 튜브에 뇌 조직을 해리정착 할 수 있습니다.
- 파파인 버퍼를 제거 뇌 조직의 덩어리를 깨는 피펫 팅에 의해 뇌 조직과 titurate 5-10x 2 ml의 소호 비켜 (오보)를 추가, 정착 및 새로운 튜브에 뜨는의 상위 2 ㎖를 제거 할 수 있습니다.
- 조직의 어떤 덩어리가 남아 있지 않을 때까지 뇌 조직 단계를 반복 5.11로 다른 2 ml의 소호 비켜을 추가합니다. Tituration는 점점 더 공격적으로 얻을 수 있습니다.
- 원심 분리는 200 × g으로 15 분 동안 세포 현탁액 해리. 기음 오프 상층 액을 10 ml의 안녕 비켜에서 재현 탁 세포 펠렛 200 x g에서 15 분 동안 원심 분리기.
- 배에 대한 DPBS 먼저 immunopanning 판 (RAN 2 판)를 씻으십시오. 대기음 상등액 10ml에 재현 탁 된 세포를 완충액 (표 2)를 패닝 및 제 immunopanning 플레이트 (RAN 2 판)에 붓는다. 실온에서 15 분 동안 세포를 품어.
- 배에 대한 DPBS와 두 번째 immunopanning 판 (O1 판)를 씻으십시오.
- 첫 번째 immunopanning 접시에 배양 한 후, 두 번째 상 세포 현탁액 팁immunopanning 판 (O1 판), O1 판에 피펫으로 버퍼 및 전송 패닝의 1-3 ml로 판의 표면에서 느슨하게 세포를 씻어. 실온에서 15 분 동안 세포를 품어.
- 세 번째 immunopanning 판 (O4 판)를 씻으십시오. 이 판은 OPC를 그 표면을 결합하는 긍정적 인 선택 접시입니다. 배에 대한 DPBS로 O4 판을 씻으십시오.
- 두 번째 immunopanning 접시에 배양 한 후, 실온에서 45 분 동안 세포를 최종 immunopanning 판 (O4 판)에 세포를 전송 품어. 이 단계는 O4 + 개 OPC를 선택합니다.
- 마지막 immunopanning 판 (O4 판)에서 뜨는을 대기음 6 배에 대한 EBSS와 함께 접시를 씻어.
- 의 접시 개 OPC를 제거하려면 따뜻한 0.05 % 트립신 - EDTA의 5 ml의 세포를 배양은 8 분 37 ° C에서 EBSS로 1:10 희석.
- 트립신을 중화 (EBSS 제) 30 % FBS 5 ML을 추가합니다. 약 50 배에 대한 피펫으로 판의 표면 떨어져 세포를 제거합니다.
- 모든 세포로 이동200 x g에서 15 분 동안 새로운 튜브와 원심 분리기에 정지.
- 셀 카운팅 다음 예열 SATO 미디어 1 ml의에 뜨는에 resuspend 세포 펠렛을 폐기하십시오. 한 뇌의 해부 1.5-2000000 개 OPC를 얻을 수 있습니다.
- 섬모 신경 영양 인자를 함유 SATO 배지에서 1 × 105 5 × 105 10 ㎝에 플레이트 사이의 밀도로 건조 PDL 코팅 된 플레이트 상 접시 셀 (10 ㎖) (CNTF, 10 NG / ㎖), 혈소판 유래 성장 인자 3 (NT3 1 NG / ㎖) 뉴로 (PDGF, 10, / ㎖ 겨), 및 포스 콜린 (4.2 ㎍ / ㎖) 2,12. 37 ° C에서 문화 OPC를, 8 % CO 2.
6. 열 변환 OPC를
- CNTF와 SATO 매체 (10 ㎖ / 10cm 플레이트) 문화 일차 개 OPC (10 NG / ㎖), PDGF (10 NG / ㎖), NT3 (1ng / mL)로 및 포스 콜린 (4.2 ㎍ / mL)을 37 ° C에서, 절개 후 24 시간 동안 8 % CO 2.
- 완전 (10 ㎖를 OPC 배양액 갓 SATO 미디어를 피드 세포 대기음) 성장 인자와 () 단계 6.1 위 참조.
- 추가로 48 시간 동안 3 단계 (그림 2, 4 단계), 문화 OPC에 의해 결정되는 최적의 농도로 개 OPC에 바이러스를 추가합니다.
공동 문화를 Myelinating 7. OPC의 시드 (그림 2, 5 단계와 6)
- 두 번 8 ml의 EBSS와 표면 오프 OPC를 먼저 린스 OPC 판을 제거하려면 다음 따뜻한 0.05 % 트립신 - EDTA의 5 ml를 2 분 동안 37 ° C에서 EBSS에 1:10으로 희석하여 세포를 배양한다.
- EBSS 30 % FBS와 트립신 (5 ㎖) 중화 및 피펫 팅에 의해 판에서 세포를 제거합니다. RT에서 15 분 동안 180 XG에 15ml의 튜브, 원심 분리로 세포 현탁액을 전송.
- 기음 세포 수에 따라 예열 SATO 미디어 1 용액에 뜨는에 resuspend 세포 펠렛을 끕니다.
- OPC 뿌리기에 앞서, DRG 문화 판에서 완전히 흡인 미디어. 조심스럽게 20 개 OPC는 DRG 뉴런에 적가 시드 앞서 4-6을 설명했다.
참고 :총 OPC 시드 볼륨은 22mm 커버 슬립 미만 200 μL해야합니다. - 부드럽게 1 ml의 예열 SATO 미디어와 맨 당은 물론, 조직 문화 후드에서 10 분 동안 접시를 이동하지 않고 정착 세포를 남겨주세요.
- 성장 인자와 SATO 미디어와 나머지 자매 개 OPC를 Replate (단계 6.1 참조). 관심있는 단백질의 발현을 확인하기 위해 이들 자매 OPC를 사용.
- 24 시간 후, 1 % B27와 공동 배양 배지 (2 ㎖ /도)를 포함 SATO 미디어 (NO 요인)과로 Neurobasal (V / V)와 SATO 미디어를 교체합니다. 미디어 변화에 십사일 2 ~ 3 일 동안 공동 문화를 유지한다.
- 웨스턴 블롯 분석에 의해 수초 단백질 발현에 대한 공동 문화를 평가하고 미엘린 염기성 단백질 마커와 신경 세포 마커 4-6에 대한 항체와 함께 더블 - 면역 염색에 의한 유수 축삭 세그먼트의 형성을 시각화.
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Representative Results
플래그 태그가 세포 외 신호 관련 키나제 1 (플래그-ERK1) 효소 2K7의 구조와 바이러스 생산에 필요한 포장 및 액세서리 구조를 모두 포함하여 사용하는 구조,의 소화 제한에 의해 확인 렌티 바이러스 생산에 사용되는 구조 (그림 3) .
그림 3 : DNA 구조 확인. 렌티 바이러스 생산을 위해 필요한 모든 DNA 작 제물은 세균 Stbl3 정제하고 제한 효소 다이제스트에 의해 확인되었다. 액세서리 및 패키징 벡터를 표시하고, 도련 플라스미드 (A)에 비하여,을 NcoI 및 EcoRI로 분해 하였다. 2K7-GFP를 SpeI와 SacII은 (A)로 절단 하였다. 2K7 - 플래그-ERK1 DNA 혼자를 SpeI 또는 SacII 중 하나와 소화에 의해 확인 또는 더블 다이제스트 (B)로 하였다. 밴딩 패턴이었다APE 소프트웨어를 사용하여 구조물의 가상 서열 소화로부터 생성 된 기대 패턴과 비교 하였다.
개 OPC에 사용할 수있는 최적의 희석을 확인하려면, ERK 1 렌티 바이러스는 HEK293T 세포 (그림 4)에서 적정 하였다. 이 바이러스 HEK293T 세포에 희석의 범위를 추가하면 (도 4A, 4C, 그리고 4D) 또는 OPC를 (그림 4B)로 하였다. 시간 (그림 4D)와 유전자의 이익 증가의 발현 수준. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : HEK293T 세포와 개 OPC의 국기-ERK1 바이러스의 적정. 깃발 ERK1 바이러스 HEK293T 세포에서 적정 하였다 (A, C, D) 또는 OPC를 (B). HEK293T 세포 (A) 또는 OPC를 (B)가 깃발 ERK1 바이러스 감염 후 GFP 발현을 48 시간 동안 묘화 하였다. HEK293T 세포 용 해물은 ERK1 또는 감염의 총 ERK1 / 2 48 시간 후 (C)의 존재를 프로빙 하였다. HEK293T 세포 용 해물을 부하 제어부 (48) 또는 플래그 HR-ERK1 바이러스 (D)로 감염 후에 96 시간 중 하나로 플래그의 존재, ERK1 / 2 및 액틴 위해 프로빙 하였다. 이 말은 모든 도말과 두 시간 점 (D)에서의 발현 수준의 직접적인 비교를 용이하게하기 위해 함께 이미지화 하였다. (A)에 대한 스케일 바는 100 μm의 =. (B)에 대한 스케일 바는 50 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
최적의 바이러스 희석 결정되면, 정제는 OPC를 도입 유전자가 발현 suff 도달 할 수 있도록 48 시간 이상 동안 배양 하였다 감염된icient 수준은 그들의 수초 전위 (도 5) 평가 DRG 뉴런 상에 시딩. DRG 신경 세포에 접종하면, 개 OPC는 희소 돌기 아교 세포로 분화 및 서부 블로 팅 (그림 5C)에 의해 평가 될 수있다 수초 단백질을 표현하기 시작합니다. 일부 희소 돌기 아교 세포는 성숙한 myelinate 것이며, 이것은 MBP 염색법 (도 5d)를 통해 가시화 될 수있다. 축삭은 수초 수준을 분석 할 때 축삭 밀도를 고려하기 위해 같은 신경 미세 섬유 또는 βIII - 튜 불린 (그림 5D)와 같은 마커로 염색 할 필요가있다.
그림 5 : 개 OPC는 DRG 뉴런에 파종 전에 48 시간 동안 플래그-ERK1 바이러스에 감염되었다. 자매 OPC를 고정하고 플래그 및 GFP (A)에 대한 염색 또는 용해 및 확인 플래그 및 ERK1 조사해서 어느 쪽바이러스로 과발현되는 단백질 (C)의 식입니다. 공동 문화는 문화 2 주 후 고정 βIII - 튜 불린과 MBP DRG 축삭을 시각화하고 myelinating뿐만 아니라 비 myelinating 희소 돌기 아교 세포 (B)에 대한 염색 하였다. myelinating은 희소 돌기 아교 세포의 화살표 헤드 (B)로 표시되는 화살표와 비 myelinating 희소 돌기 아교 세포에 의해 표시된다. 병렬 동시 배양 용균 및 공 배양 (D)에서 트랜스 진 발현을 확인 미엘린 단백질 MBP 및 MAG뿐만 아니라 플래그 및 ERK1 / 2 프로빙 하였다. ERK1 수준의 증가로 인해 해물 스케일 바 = 20 μm의 존재 DRG 파생 ERK1의 대량으로 공동 문화에서 볼 수 없었다.
| 이름 | 성분 | 노트 |
| TE 완충액 pH 8 | 10 mM 트리스 산도 (8) 1 mM의 EDTA 산도 (8) | 탈 이온수에서 확인합니다. |
| 폴리에틸렌 이민 (PEI) | 1g / L | -20 ° C에서 탈 이온수, 필터 소독 및 저장 주식에 확인합니다. |
| LB 중간 | 20g 트립 톤 10g 효모 추출물 10g의 NaCl | 탈 이온수 2 L에 메이크업 |
| 50 % 글리세롤 재고 | 글리세린 | 오토 클레이브를 탈 이온수와 같은 부피 만회 |
| T HEK 293 세포 배지 | DMEM 10 % 소 태아 혈청 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 1 % L- 글루타민 | |
| TNE 용해 버퍼 | 10 mM 트리스 산도 (8) 150 mM의 NaCl을 1 mM의 EDTA 산도 (8) 1 % NP40 | 이 물과 접촉하므로 제 결정화 탈 이온수 작은 부피에서 NP40 녹인다. 탈 이온수의 최종 볼륨 메이크업 |
| M1 | MEM 10 % 소 태아 혈청 0.4 % 글루코스 D 2 nm의 L 글루타민산 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 | 쥐 DRG 뉴런과 함께 사용 |
| MM1 | 로 Neurobasal 매체 2 % B27 (SM1) 보충 0.4 % 글루코스 D 2 nm의 L 글루타민산 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 | 마우스 DRG 뉴런과 함께 사용 |
| M2 | DMEM 10 ㎎ / L 트랜스페린 5 ㎎ / L 인슐린 20 nm의 프로게스테론 100 μM 퓨 트레 10 μM FDU 10 μM 우리 딘 | 1~2개월 이상 사용하기 위해 더 큰 볼륨 FDU없이 DMEM과 딘에서 M2를 확인합니다. 이주 내에 완료 할 수 있습니다 작은 볼륨으로 FDU와 딘 추가 |
| MM2 | MM1 10 μM FDU 10 μM 우리 딘 | 이주 내에 완료 될 수 매체의 작은 볼륨으로 FDU과 딘을 추가합니다. |
| 10 배 MT-PBS 산도 7.4 | 28.48 g / L (160 mM)을 2 나 HPO 4 · 2H 2 O 5.52 g / L (40 mM의)의 NaH 2 PO 4 · H 2 O 87.66 g / L (1.5 M)의 NaCl | 탈 이온수에 추가 10 N NaOH로 pH 7.4까지를 조정 |
| 1X MT-PBS | 10 배 MT-PBS 탈 이온수 | 1X MT-PBS를 만들기 위해 탈 이온수에 10 배 MT-PBS 1:10 희석 |
| 10 배 붕산염 완충액 (1.5 M) | 18.55 g 붕산 1X MT-PBS | 150 ml의 1 배 MT-PBS에 붕산을 녹인다. 10 N NaOH로 pH를 8.56로 조정하고 1 배 MT-PBS 200 ml의 최종 부피를 가지고. 압력솥 |
| 1X 붕산염 버퍼 (0.15 M) | 배 보레이트 완충액 1X MT-PBS | 에 PLN을 용해 버퍼 100 ㎖를 준비합니다. 10 ml의 10 배 붕산 완충액 (pH 8.56)의 1 배 MT-PBS의 90 ml의 추가 |
| 0.5 ㎎ / ㎖ 폴리 -L- 오르니 틴 (PLN) | (50)MG 폴리 -L- 오르니 틴 하이드로 브로마이드 0.15 M 보레이트 완충액 (pH 8.56) | 1X 보레이트 완충액 100ml에 폴리 -L- 오르니 틴 하이드로 브로마이드 50mg을 녹인다. 최대 1 개월 4 ° C에서 필터 소독 (0.22 μm의 필터) 및 저장 |
| 100 배 폴리 D 라이신 (PDL) | 5 mg의 폴리 D 라이신 멸균, 탈 이온수 | 100 배 PDL 주식은 단일 사용 분량 씩 -20 ° C에서 동결 할 수 있습니다. 사용시, 멸균, 탈 이온수에 1 배 희석 |
| 파파인 버퍼 | 표 2 참조 | |
| DNase의 | 12,500 U의 DNase I 1 ml의 EBSS | 얼음에 냉장 EBSS 1 ㎖에서의 DNase I을 용해. 나누어지는 (예를 들어, 300 μL / 튜브) 및 -20 ° C에서 하룻밤 동결. -20 ° C에서 보관하십시오. |
| 4 % BSA | 8g BSA 200 ML의 DPBS | 37 ° C에서 150 ML의 DPBS에 BSA를 녹여. ~ 7.4로 pH를 조정1 N NaOH를 1 ㎖. 200 ml의에 볼륨을 가져와. 소독 0.22 μm의 필터를 통해 필터링합니다. -20 ° C에서 1 ml의 씩 저장을합니다. |
| 10 배 소호 오보 | 3g BSA 200 ML의 DPBS 3g 트립신 억제제 | 150 ML의 DPBS에 BSA를 넣고 잘 섞는다. 트립신 억제제를 추가하고 용해 혼합. 7.4 pH를 조정 한 N의 NaOH ~ 1 ML을 추가합니다. DPBS 200 ml의에 볼륨을 가져와. 0.22 μm의 필터를 통해 필터 소독. -20 ° C에서 1 ml의 씩 저장을합니다. |
| 6 배 안녕하세요 오보 | 6g BSA 200 ML의 DPBS 6g 트립신 억제제 | 150 ML의 DPBS에 BSA를 넣고 잘 섞는다. 트립신 억제제를 추가하고 용해 혼합. 7.4 pH를 조정 1N의 NaOH ~ 1 ML을 추가합니다. DPBS 200 ml의에 볼륨을 가져와. 0.22 μm의 필터를 통해 필터 소독. -20 ° C에서 1m 분주하고 저장을합니다. |
| SATO베이스 | 표 3 참조 | |
| SATO 미디어 (쥐) | 1 % SATO베이스 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 1 %, 0.5 ㎎ / ㎖ 인슐린 1 % L- 글루타민 0.1 % NAC 0.1 % 비오틴 DMEM 및 필터 소독과 함께합니다. | |
| SATO 미디어 (마우스) | 1 % SATO베이스 1 %, 0.5 ㎎ / ㎖ 인슐린 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 1 % L- 글루타민 0.1 % NAC 0.1 % 비오틴 0.1 % 미량 원소 B 2 % B27 DMEM 및 필터 소독과 함께합니다. | |
| 인슐린 | 10 mg의 인슐린 20 ml의 멸균 deionzed 물 | 탈 이온수에 인슐린을 추가하고 인슐린이 용해 할 수 있도록 1 N 염산 100 ㎕를 추가합니다. 잘 섞는다. 4-6주 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 매장을 통해 필터 |
| NAC (N-L-아세틸 시스테인) | 5 ㎎ / ㎖ NAC DMEM | 5 MG를 만들기 위해 DMEM에 NAC를 녹여/ ㎖ -20 ° C에서 솔루션, 나누어지는 및 저장. |
| D-비오틴 | / ㎖ 비오틴 50 μg의 멸균, 탈 이온수 | -20 ℃에서 50 ㎍ / ml의 용액, 및 저장을 분취 물에 녹이고 비오틴. |
| CNTF (섬모 신경 영양 인자) | 10 ㎍ / ㎖의 CNTF DPBS에서 0.2 % BSA | DPBS 멸균 0.2 % BSA로 10 ㎍ / ml의 용액을 만들기 위해 희석 CNTF. 나누어지는, -80 ° C에서 액체 질소와 저장소에 플래시 동결. |
| PDGF (혈소판 유래 성장 인자) | 10 ㎍ / ㎖의 PDGF DPBS에서 0.2 % BSA | DPBS에서 멸균 0.2 % BSA 10 ㎍ / ml의 (제조업체의 지침에 따라 제조) PDGF 마스터 주식을 희석. 나누어지는, -80 ° C에서 액체 질소와 저장소에 플래시 동결. |
| NT3 (뉴로 트로 핀 -3) | 1 ㎍ / ㎖의 NT-3 DPBS에서 0.2 % BSA | NT3 마스터 STOC 희석K DPBS 멸균 0.2 % BSA로 1 ㎍ / ml의 (제조업 자의 지시에 따라 제조 됨). 나누어지는, -80 ° C에서 액체 질소와 저장소에 플래시 동결. |
| 포스 콜린 | 50 mg의 포스 콜린 무균 DMSO | 포스 콜린의 50 mg의 병에 1 ml의 무균 DMSO를 추가하고 완벽하게 재현 탁 잘 섞는다. 15 ML 튜브로 전송하고 4.2 ㎎ / ㎖의 농도에 도달하는 11 ml의 무균 DMSO를 추가합니다. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장. |
표 3. 주식 솔루션을 제공합니다.
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Discussion
축삭의 수초는 척추 동물의 중추 및 말초 신경계 양쪽의 최적의 기능을위한 중요한 과정이다. 유수 축삭의 생성 및 유지 보수와 세포 외 기질 단백질 (슈반 세포 나 희소 돌기 아교 세포)에서 분자 신경 세포 사이의 상호 작용, 아교를 포함하는 복잡하고 조정하는 과정입니다. 이 프로토콜의 의미 및 적용은 혼합 공 배양 설정 내의 하나의 특정 세포 유형에서 단백질의 조작을 허용한다는 것이다. 여러 세포 유형은 특정한 단백질의 활성을 차단하는 무딘 약리학 도구를 사용하여 생체 내 및 시험 관내 수초 분석에서 양쪽 수초에 관여 또는 신호 전달 경로 단백질은 하나의 연결에서 수초에 가하는 것을 영향에 대한 특정 정보를 제공 할 수없는 또는 신경교 관점 단백질 고유 한 세포 유형에 의해 발현되지 않는. 따라서, 시험 관내 수초로서oligodendroglial 단백질이 수초에 발휘하는 효과를 심문 할 수있게 해준다 구체적으로 OPC를 형질 도입하는 렌티 바이러스의 사용과 함께 말한다. 우리는 성공적으로 oligodendroglial 신호가 중추 신경계 수초 (9)에 가하는 효과를 해부하기 위해 특별히 체외 수초 분석에 대한 희소 돌기 아교 세포에 특정 단백질을 과발현 2K7의 Lentivirus를 사용했다.
체외 수초 분석에서 형질 OPC에서 재현 가능한 결과를 달성하기 위해, 최적화 해부 및 OPC 파종을 통해 복제에서 프로토콜의 각 단계가 필요합니다. 그것은 DNA의 수준에서, 이익 구조의 태그 유전자를 포함 pENTR 벡터 순서가되어,하는 것이 필수적이며, 관심있는 태그 유전자와 2K7의 DNA가 태그의 표현과 관심의 유전자 웨스턴 블롯에 의해 선택되어 있는지, 바이러스를 생성하는 DNA를 사용하기 전에. 그것은 하나 HEK293Tcells 또는 HEK293을 선택하는 것이 필수적입니다FT 세포는 바이러스를 생성 및 마이코 플라즈마가없는 환경 하에서 성장할. 렌티 바이러스를 생성 한 후이 개 OPC에 사용할 수있는 최적의 희석을 결정하기 위해 각각의 바이러스 배치를 적정하는 것이 중요합니다. 이것은 HEK293T 세포 또는 바이러스에 OPC를 희석 범위를 첨가함으로써 행해질 수있다. 2K7 구조가 모두 유전자의 관심과 GFP를 포함로, 전달의 효과는 형광 현미경에 의해 GFP의 발현에 의해 태그의 표현과 웨스턴 블롯 분석에 의한 관심의 유전자를 분석하기에 의해 평가 될 수있다. 그것이 가능한 한 다수의 바이러스 입자는 하나의 세포를 감염시키기위한 브라 GFP + 세포는 높은 바이러스 농도가 표시 될 것이다. 형광 현미경을 통해 GFP 발현 및 검증은 GFP의 발현하고 바이러스 역가의 유용한 지표이지만, 관심의 대상이되는 단백질의 발현을 확인하기위한 대용으로 사용할 수 없다. 그것은 두 HEK293T 세포에서 관심의 대상이되는 단백질의 발현 수준을 확인하는 것이 중요과 웨스턴 블롯 분석에 의해 개 OPC. 관심있는 단백질 공동 배양함으로써 뉴런 내생 표현하면 웨스턴 블롯 공 배양 용 해물을 분석 할 때, OPC에 / OLS 의해 과발현 마스킹 될 수있다; 따라서이 공동 문화에하지 않을 경우 관심의 단백질의 발현이 자매 OPC를 검증 할 수 있도록 파종 다음 관심이나 문화 자매 개 OPC의 단백질에 태그를 하나 중요하다.
실험이 성공한 경우 DRG 및 OPC 배양 모두의 품질을 직접 결정한다. 공 배양 설정에서 쥐 DRG 뉴런은 쥐 또는 마우스 중 하나에서 파생 개 OPC와 공 배양 할 수 있습니다. OPC를 부드럽게하고 신속한 처리가 필요합니다. 너무 작은 효과적으로 뉴런 상 씨앗에 너무 적은 세포가되도록 개 OPC에게 독성 관심 너무 많은 바이러스 단백질의 발현이 낮은 레벨로 이어지는 OPC를 형질 도입하는 데 실패로 개 OPC 용 바이러스 역가를 최적화하는 것이 중요하다. 이러한 하위 최적의 transductions 모두 resul 수 있습니다수초 또는 수초 단백질 발현에 unanalyzable 또는 사소한 변화 t. 그들 위에 합류되어 그들이 현지 조건에 최적화 될 배양 및 형질 OPC를 요구하므로 개수를 구별 한 후 시드 할 수없는 경우는 OPC를 구별. 그것은 여러 위에 실험 조건을 비교 될 유수 축색 세그먼트 수의 직접적인 비교를 가능하게 수초 각 분석에서 OPC를 동일한 수의 시드하는 것이 바람직하다.
이 기술의 잠재적 제한 수초화 세이 수초 간의 기저 수준 가변성이다. 바이러스 성 전달에 이어, 수초의 기초 수준은 바이러스로 감염된 개 OPC는 순진 (비 바이러스 성 감염) OPC를뿐만 아니라 myelinate하지 않는 것이 제안, 감소된다. 이는 각 분석에서의 기저 수초에 대하여 수초 정도를 정량함으로써 극복 될 수있다. 따라서, 단지 GFP를 발현 벡터는 빈 내부 제어 방식으로서 사용되어야OL. 수초뿐만 아니라, 관심있는 단백질의 발현은 수초에 간접적 인 효과로 이어지는 등의 생존, 증식 및 분화와 같은 개 OPC의 다른 측면에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 이러한 세포 생존 같은 OPC 동작의 분석은 수초 세이 평행 수행되어야한다.
여기에 설명 된 바이러스 형질 도입 방법은 희소 돌기 아교 세포의 수초화의 연구에 한정되지 않는다; 사실 그것은 일반화 및 최적화 개별 세포 유형에 대해 요구 될 수 있지만, 그러한 슈반 세포, 성상 교세포 및 신경 세포와 같은 다른 세포 유형을 연구에 적용될 수있다. 이 프로토콜은 혼합 된 세포 배양 시스템을 사용하는 경우에 특히 장점이 원하는 세포 유형에 대한 관심 (야생형 또는 돌연변이)의 단백질의 선택적 과발현 증식 및 분화와 같은 세포의 거동을 연구하기 큰 유연성을 제공한다. 형질 도입에 사용되는 세포는 쥐 또는 어느 하나로부터 단리 될 수있다마우스 (야생 형 또는 형질 전환은), 따라서 생체 내 유전자 변형 마우스 모델을 사용하는 것보다 소비 달성하기 위해 보통 어려운 형질 전환 동물의 신호 및 보상 메커니즘을 대상으로 연구, 그리고 훨씬 더 많은 시간을 허용. 최근의 증거는 렌티 기반 전략 성공적 생체 내 접근법 렌티 바이러스를 사용하여 세포를 형질 도입 oligodendroglial의 강한 가능성을 제안하는 동물 모델 (13)에 세포 형질 도입에 사용되었다는 것을 시사한다.
결론적으로, OPC를 렌티 바이러스의 감염 관내 수초 분석을 결합하는 수초 형성에 관여하는 분자 메커니즘의 분석을위한 전략적인 도구를 제공한다. 수초에서 특정 단백질의 역할은 심문하고 OPC를 렛트 DRG 공동 배양에 사용 쥐로부터 분리 될 수있는 바와 같이, 렌티 접근법은 또한 MECH 심문 다양한 마우스 선 녹아웃 기술을 조합하여 사용할 수있다수초의 과정에서 보상의 anisms.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2K7 lentivector | Kind gift from Dr Suter9 | ||
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100mg | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115545205 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11012 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518-5G | |
| B27 - NeuroCul SM1 Neuronal Supplement | Stem Cell Technologies | 5711 | |
| BDNF (Human) | Peprotech | PT450021000 | |
| Biotin (d-Biotin) | Sigma Aldrich | B4639 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4161 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-100G | |
| CNTF | Peprotech | 450-13020 | |
| DAKO fluoresence mounting media | DAKO | S302380-2 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Life Technologies | 10313039 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-375KU | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Life Technologies | 14040182 | |
| EBSS | Life Technologies | 14155063 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101 | |
| Entry vectors for promoter and gene of interest | Generate as per protocols 1-2 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886-50MG | |
| Glucose (D-glucose) | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycerol | Chem Supply | GL010-500M | See stock solutions |
| Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115005003 | |
| Goat Anti-Mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115005020 | |
| Goat Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 112005167 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Igepal | Sigma Aldrich | I3021-100ML | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Laminin | Life Technologies | 23017015 | |
| LB Medium | See stock solutions | ||
| LB-Agar | See stock solutions | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-7477 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415064 | |
| L-Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| L-Glutamine- 200 mM (100x) liquid | Life Technologies | 25030081 | |
| LR Clonase II Plus enzyme | Life Technologies | 12538-120 | |
| MEM, NEAA, no Glutamine | Life Technologies | 10370088 | |
| Mouse α βIII Tubulin | Promega | G7121 | |
| Mouse αMBP (monoclonal) | Millipore | MAB381 | |
| Na pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| NAC | Sigma Aldrich | A8199 | |
| NcoI-HF | NEB | R3193S | |
| NEBuffer 4 | NEB | B7004S | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| NGF (mouse) | Alomone Labs | N-100 | |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | |
| O1 antibody - Mouse anti-O1 | Millipore | MAB344 | Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable |
| O1 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning | ||
| O4 antibody - Mouse anti-O4 | Millipore | MAB345 | Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable |
| O4 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning | ||
| Competent cells | Life Technologies | A10460 | |
| One Shot Stbl competent cells | Life Technologies | C7373-03 | |
| Papain Suspension | Worthington/Cooper | LS003126 | |
| pBR8.91 | Kind gift from Dr Denham10 | ||
| PDGF-AA (Human) | Peprotech | PT10013A500 | |
| Penicillin-streptomycin 100x solution | Life Technologies | 15140122 | |
| pENTRY4IRES2GFP | Invitrogen | 11818-010 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727-100ML | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | |
| Protease inhibitor tablet (Complete mini) | Roche | 11836153001 | |
| Proteinase K | Supplied with Clonase enzyme | ||
| Putrescine | Sigma Aldrich | P-5780 | |
| Rabbit α neurofilament | Millipore | AB1987 | |
| Rabbit αMBP (polyclonal) | Millipore | AB980 | |
| Ran2 hybridoma cells | ATCC | TIB-119 | Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning |
| Rat anti CD140A/PDGFRa antibody | BD Pharmingen | 558774 | |
| SacII | NEB | R0157 | |
| SOC medium | Supplied with competent bacteria | ||
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| Spe I | NEB | R0133S | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Buffer | NEB | B0202S | |
| TE buffer pH8 | See stock solutions | ||
| TNE lysis buffer | |||
| Trace Elements B | Cellgro | 99-175-CI | |
| Transferrin (apo-Transferrin human) | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
| Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White | Roche | 10109878001 | |
| Trypsin-EDTA (1x), phenol red (0.05%) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 | Vector laboratories | L-1100 | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003-5G |
References
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).
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- Murai, K., et al. Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).
