Abstract
Miyelinasyon nöronlar ve glial hücreleri oluşturan miyelin iki içeren karmaşık bir süreçtir, periferal sinir sisteminin (PNS), merkezi sinir sisteminde (CNS) oligodendrositler ve Schwann hücreleri. Biz bir in vitro miyelinasyon deneyi, in vitro MSS miyelinasyonun eğitim için kurulmuş bir modeli kullanın. Bunu yapmak için, ön-madde oligodendrosit hücreleri (OPC) Myelinating ko-kültürler oluşturmak üzere saflaştırılmış primer, kemirgen Dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarının ilave edilir. Oligodendrositler tarafından ifade belirli proteinler miyelinasyona üzerine uygulamayın spesifik rolleri sorgulamak için biz seçici DRG nöronlar üzerine numaralı seribaşı önce yabani türü, yapısal olarak aktif veya dominant negatif proteinlerini aşın lentivirüs kullanarak OPC transduce protokolleri geliştirmiştir. Bu bize özellikle miyelinasyonun düzenleyen bu oligodendroglial proteinlerin rollerini sorgulamak için izin verir. protokolleri de ot çalışmaya uygulanabilirher hücre tipi, böylece bu tip bir sinyal ve dengeleme mekanizmaları arasında hedef çalışma için oligodendrositler gibi arzu edilen bir hücre tipi ile ifade edilen proteinlerin, seçici manipülasyonuna olanak veren bir yaklaşım sağlar. Sonuç olarak, lentiviral enfekte OPC ile in vitro miyelinasyon tahlil birleştirerek miyelinasyona yer alan moleküler mekanizmaların analizi için stratejik bir araç sağlar.
Introduction
Aksonların myelinizasyonuna hem merkezi hem periferik sinir sisteminde aksiyon potansiyeli hızlı ve etkin iletimi için çok önemlidir. İhtisas hücreler, Schwann hücreleri, merkezi sinir sisteminde periferik sinir sistemi ve oligodendrositler olarak, etrafında sarın ve miyelin de ensheathe aksonlar, etkin bir sinir yalıtım ve saltatory iletimini 1 kolaylaştırılması. miyelinasyon işlemi, retinal ganglion nöronlarının 2, mühendislik nanolifler 3 ya da Schwann hücrelerinin 4 veya oligodendrosit 5-7 ya da birlikte kültürlenmiş Dorsal kök ganglion nöronlarının kullanılarak in vitro incelenebilir. in vitro miyelinasyon tahlil sinir sistemi miyelinasyonun eğitim için kurulmuş bir modeldir ve in vivo 5-8 miyelinasyona sırasında meydana temel süreçlerin birçok çoğaltır. Tahlil C OPC ile dorsal kök ganglion (DRG) nöronların saflaştırılmış popülasyonlarının kokültürü, (içerirNS myelinasyon) veya Schwann hücreleri (PNS miyelinasyona için). Belirli koşullar altında bu myelinating hücrelerin in vivo mevcut miyelin spesifik proteinlerin aynı tamamlayıcısı ifade plazma zarı yalıtım sipariş ultra yapısal doğrulanmış, çok katmanlı levha DRG aksonlar ensheathe.
in vitro olarak merkezi sinir sistemi miyelin okuyan en yaygın olarak kullanılan hücre modeli başarılı bir şekilde bu nörotrofinlerin gibi dış faktörler, in vitro 5,6 CNS miyelinasyon üzerinde uyguladığı etkilerini incelemek için kullanılmıştır DRG nöronlarının ve OPC, ko-kültürler bir. Bu gibi büyüme faktörlerinin veya küçük molekül farmakolojik inhibitörleri olarak, dış faktörlerin yaygın DRG'ye OPC kokültürünün modeli 7,9 ile miyelinasyon yolaklarını rolünü incelemek için kullanılmıştır. Ancak, nöronlar ve oligodendrositlerin hem de içeren karma ko-kültür ortamlarında, resmen mümkün kaldığını büyüme faktörleri veya phar yamacological inhibitörleri DRG nöronlar ve oligodendrosit (OL) hem üzerine etkileri sarf olabilirdi. Bu, özellikle proteinler DRG'lerin sadece ifade veya oligodendroglia bu ikili hücre sistemini kullanarak miyelinasyona üzerine uyguladığı bu rolleri incelemek için yeteneği sunuyor. Tümden oligodendroglial sinyalizasyon yolunun doğrudan, in vitro miyelinasyon deneyi için DRG nöronlarının üzerine konmadan önce, yanı sıra, yabani tip ve mutant proteinlerin her ikisini fazla sentezleyen bir zarif bir yolu olduğu kanıtlanmıştır miyelinasyon, OPC lentiviral transdüksiyon düzenleyen olduğunu doğrulamak için oligodendrositler tarafından kurucu olarak ifade proteinlerin demonte ifadesi olarak. Böylece bu yaklaşım, özellikle sorguya ve miyelinasyonun 9,10 çalışmak için oligodendrositler içinde sinyal yolları işlemek için bir cadde sunuyor.
Bu yazıda, biz bir lentiviral aracılığıyla seçici oligodendrositlerin ilgi bir protein aşın geliştirdik yöntemleri raporin vitro miyelinasyonun incelemek için yaklaşım. teknikler ilgi alanı dahilindeki geni içeren sentezleme vektörlerinin üretimi ile başlar, daha sonra daha sonra pENTR vektörü (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP) klonlanır bir vahşi tipli, yapısal olarak aktif bir veya baskın negatif formunda olsun. (Ilgili geni içeren) Bu vektör, CMV yükselticisi verici (pENTR L4-R1, pENTR-pDNOR CMV) ve 2K7 Lentivector CMV promotörünü içeren bir 2K7 vektör yapılandırmak için söz konusu genin bir üretilmesi için bir enzim reaksiyonu birleştirilir ensefalomiyokarditis ve GFP (Şekil 1). PMD2.G virüs kılıfının ve pBR8.91 virüs paketi ile birlikte, bu ağ klonlanmış 2K7 yapısı daha sonra OPC nakletmek için kullanılabilir lentivirüs oluşturmak için HEK293T hücrelerine ko-transfekte edilirler. Lentivirüs ile enfekte sonra OPC ilgi protein yüksek düzeyde ifade. Bu OPC sonra DRG nöron kültürleri üzerine ekilmiş ve etkisi ifadesi olduğunu edilebiliristenen proteinin yüksek düzeyde sorguya olabilir miyelinasyona üzerinde uygular. ko-kültürler Western blot analizi ile miyelin protein ifadesi için değerlendirilir ve immünositokimya miyelinli aksonal segmentlerin oluşumu için görünür hale getirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu çalışma için kullanılan tüm hayvanlar karışık seks ve Anatomi ve Patoloji Anabilim Dalı Hayvan Tesisleri ve Melbourne Üniversitesi Nörobilim ve Ruh Sağlığı Araştırma Enstitüsü'nde yetiştirilen Florey. Tüm hayvan prosedürleri Melbourne Üniversitesi'nde Hayvan Deneyleri Etik Kurullarının tarafından kabul edildi.
2K7 Lentivector 1. Klonlama
- 2K7 lentiviral vektör içine ilgili genin klonlanmasına önce, standart moleküler teknikler kullanılarak 11 pENTR vektörü (3637 bp Kanamisin dirençli) içine gen alt-klonlanmıştır. Alt-klonlama için EcoRI ve Sacll sınırlama sitesi kullanın.
- 2K7 Lentivector amplifikasyonu
- Hafifçe yetkin hücre ile plazmid DNA, 100 ng karıştırılarak 2K7 Lentivector DNA Dönüşümü ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
- Isı şoku, DNA / kompetan hücreler 90 sn için 42 ° C sıcaklıkta karıştırmak ve ampici her ikisini de içeren LB-Agar plakalar üzerine bunları plakallin (100 ug / ml) ve 16-18 saat süre ile 37 ° C 'de, kloramfenikol (15 ug / ml).
Not: Kloramfenikol uzun terminal tekrarı arasındaki rekombinasyonu önlemek için kullanılır. - Bir sonraki gün, 16-18 saat boyunca 37 ° C'de ampisilin (100 ug / ml) ve kloramfenikol (15 ug / ml) her ikisini de içeren LB ortamında bakteri seçilmiş klondaki büyür. Üreticinin talimatlarına göre bir ticari plazmid DNA Maksiprep kiti kullanılarak DNA ekstrakte edin.
- 2K7 Lentivector için pENTR vektöründen alt-klonlama (Şekil 1)
Şekil 1:. Ağ Geçidi yeniden birleştirme işleminin şematik gösterimi, söz konusu genin, burada Flag-ERK1 olarak temsil pENTR L1-L2 vektörü içine klonlanır. Bu, CMV promotörü ve omurga 2K7 vektörü içeren pENTR L4-R1, vektörüne eklenir. Bu üç vektörler LR Clonase II Plus enzim ile yeniden birleştirilirVirüs hazır 2K7 vektörü içine bir çıkar geni-ve promotör yerleştirin.- 1.5 ml tüp Aşağıdaki ekleyin ve hafifçe karıştırın:
L4-R1, pENTR-pDNOR CMV (yükseltici) (60 bng) 1-2.5 ul
(80 bng) 1-2.5 ul (ilgi dahilindeki gen ile birlikte) L1-L2 pENTR4IRES2GFP
K7 Lentivector (80 ng / ul) 1 ul
TE-tamponu, pH 82-5 ul
Toplam 8 ul - -80 ° C ila Clonase enzim karışımı çıkarın ve 2 dakika boyunca buz üzerinde eritin. Enzim hemen hemen tekrarlanan donma-çözme döngüsü verimliliği klonlama azalttı olarak, bu enzim, -80 ° C arasında bir miktar daha taze olduğundan emin olun
- Reaksiyon başına enzimin 2 ul ekleyin ve vorteks yoluyla iyice karıştırılır ve 6-24 saat boyunca 23-25 ° C'de Clonase tepkime karışımı inkübe edilir.
- Clonase Reaksiyon karışımına (enzim kitiyle birlikte verilen), proteinaz K çözeltisi 1 ul ilave edin ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edilir.
- Yetkili hücrelere Clonase reaksiyon karışımı Transform ve seçin büyümek16-18 saat boyunca 37 ° C'de ampisilin (100 ug / ml) içeren LB ortamında kolonileri.
- Özü ve üretici talimatlarına göre bir ticari miniprep kiti kullanılarak DNA'nın arıtılması.
- Spe I ve Sac II ve ilgi promoteri ve gen içeren parçasını çıkarmak için üreticinin talimatlarına göre uygun bir tampon enzimleri kısıtlama ile sindirimi yoluyla DNA teyit edin.
Not: Bu adım alt klonlanmış DNA sağ vektör omurgası ile ilgi doğru eklemek geni olup olmadığını kontrol etmek önemlidir. Bu eklenen parça olmadan vektör kendisinin büyüklüğü 6.7 kb'dir. serbest yerleştirilen fragmanının boyutu, promotörü ve ilgili geni uç içerir. Bir Plazmid Editor - örneğin DNA dizisi düzenleme programı, APE üzerinden belirli gen için sindirilmiş beklenen fragman boyutları hesaplayın. - DNA vektörü omurgası ve bir% 1 agaroz jeli yürütülerek serbest fragmanının her iki boyutta Giriş1x TAE tamponu 100 V'de (stok çözümleri Tablo bakınız)
- 16-18 saat boyunca 37 ° C'de ampisilin (100 ug / ml) ihtiva eden LB ortamı, 500 ml bakteri büyüme ile teyit DNA yükseltin.
- Özü ve üreticinin talimatlarına göre bir ticari plazmid DNA Maksiprep kiti kullanılarak DNA arındırmak.
Not: Maksiprep tipik haliyle, viral üretimi için gerekli olan DNA yeterli miktarda üretir.
- 1.5 ml tüp Aşağıdaki ekleyin ve hafifçe karıştırın:
- Tekrar lentiviral hazırlıkları için aşağıdaki DNA'lar yükseltmek için 1.3.9-1.3.10 adımları: Bir kontrol olarak Zarf vektörü (PMD2.G, 6.1 kb), Paket vektörü (pBR8.91, 12.5 kb), ve boş bir lentiviral vektör (GFP -CMV-2K7, 8.7 kb),.
2. 2K7 Virüs Üretimi
NOT: 1. Gün:
- Transfeksiyondan bir gün, 25 mi HEK293 T hücre ortamı içeren T175 şişesi içinde plaka 32000000 HEK293 T hücreleri (stok çözeltilerinin Tablo). Seçenek olarak ise, günün 16000000 hücreleri plakatransfeksiyondan önceki zaman transfeksiyonunun gününde sıkı çalışır eğer.
NOT: Transfeksiyon transfeksiyon gün önce veya bir gün için hücreleri kaplama ile aynı derecede başarılı olabilir. Iki alternatiften birini kullanarak, burada kritik nokta emin hücreler transfeksiyondan önce kültür çanak yüzeyinden aşağı sıkışmış yapmaktır.
NOT: Gün 2: - Transfeksiyon
- Transfeksiyondan önce, 10 mM Tris pH 8, deiyonize su içinde 1 mM EDTA, pH 8 ihtiva TE Tamponu içinde 1 ug / ul DNA seyreltin.
- 50 ml'lik bir tüp içinde, T175 şişesi içinde transfeksiyon için bir ana karışımı (Tablo 1) hazırlanması. DNA ekleme Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) ısıtılmış ön ve vorteks yoluyla iyice karıştırın, daha sonra erken çökelmesini önlemek için steril bir polietilenimin (PEI) (stok çözeltilerinin Tablo) ekleyin.
Tablo 1: 2K7 Virüs için hazırlık transfeksiyon karışımı.Vektör trong> Konsantrasyon Hacim pMDG.2 1 ug / ul 5 ul pBR8.91 1 ug / ul 15 ul GFP + söz konusu gen ile 2K7 vektör 1 ug / ul 22 ul Steril Polietileniminin (PEI) 1 g / l 500 ul DMEM 2.100 ul - Tüp 3-4x çevrilmesi ile iyice karıştırıldıktan sonra, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (RT) enkübe edilir.
- HEK293T hücreleri üzerinde tam bir medya değişiklik yapın. Aspire tamamen hücrelerin kültür ortamı dışında ve önceden ısıtılmış HEK293T hücre kültür ortamı (T175 şişesi başına 25 mL) ile beslenir.
- Transfeksiyon karışımı (DNA / PEI karışımı) tek tabakalı hücrelere damla damla ekleyin. Gece boyunca, 37 ° C'de,% 5 CO2 de transfekte edilmiş hücreler, iyice karıştırın ve inkübe yavaşça hareket ettirin.
NOT: Gün 3: - Transfeksiyon başarılı sağlamak için, bir floresan mikroskobu ile GFP 24 saat sonrası transfeksiyon kontrol edin.
NOT: GFP ifade hücrelerin% 50'den fazlası, genellikle iyi bir transfeksiyona gösterir.
NOT: Gün 4: - 48 saat sonra, transfeksiyondan de viral supernatant toplamak ve taze HEK293 T ortamı (T175 şişesi başına 25 mL) ile değiştirin.
- Yüzer hücre artıkları temizlemek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1140 x g'de, viral süpernatan santrifüjleyin. Aktarım, 4 ° C'de, 50 ml tüp ve saklamak için süpernatan temizlenir.
NOT: Gün 5:
- Yüzer hücre artıkları temizlemek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1140 x g'de, viral süpernatan santrifüjleyin. Aktarım, 4 ° C'de, 50 ml tüp ve saklamak için süpernatan temizlenir.
- 72 saat sonrası transfeksiyon anda, viral süpernatant ikinci parti toplamak. Adımı yineleyin 2.3.1 ve havuz 48 ve 72 saat süpernatanlan temizledi.
- 30 ml'lik bir ultra santrifüj tüpleri kullanılarak 4 ° C'de 90 dakika boyunca 170,000 x g'de virüsü, santrifüj, viral süpernatan yoğunlaştırmak.
- Süpernatantı atın ve tüm süpernatant virüsünün (görünmez) pelet bırakarak santrifüj artı tüp tabanında PEI çöktürülmüş kadar adımı 2.6 tekrarlayın.
- , Virüs tekrar süspansiyon ultrasantrifüjdeki tüplerine 500 ul SATO medya (stok çözümleri Tabloya bakınız) ekleyin. 30 sn a için Vortexnd mekanik virüs gevşetmek için bir pipet ile tüpün tabanını kazıyın. Viral pelet gevşek için bu adımı tekrarlayın 6x.
- Mikrosantrifüj tüpler içine yeniden süspanse virüs Havuz ve çözünmeyen PEI kaldırmak için çok kısa bir süre döndürün. Proteinleri uzaklaştırmak için 0.45 um'lik bir filtre ile süpernatant filtre.
- -80 ° C'de 20 ul, 50 ul ve 100 ul hacimde ve deposuna virüs alikosu.
HEK293T Hücreleri 3. viral titre tesbiti
- Eklemek viral stoklar seri seyreltileri, bir dizi ilgili proteinin ekspresyonunu kontrol etmek ve deneyler için uygun virüs konsantrasyonunu belirlemek için (örneğin, 0, 5, 10, 20, 40, 80 ul) kaplanmıştır HEK293, T hücreleri nakletmek için 37 ° C'de 24 saat boyunca 6-yuvalı plakalar ve kültür,% 5 CO2. Geninin güçlü bir ifadesini sağlamak bu 200: Bu protokol, tipik olarak 1:50 ila 1 arasında değişen konsantrasyonlarda kullanılabilir virüsü üretirFaiz.
- 48 saat sonra, viral transdüksiyon, proteaz önleyicileri ihtiva eden tampon maddesi içinde lize TNE HEK293T hücreleri (stok çözeltisi Tablo).
- Soğutulmuş DPBS ile iki kere yıkayın ve daha sonra her bir oyuğa 150 ul PLE tamponunda ekleyin.
- Yukarı pipetleme ve 5-10x aşağı lizleyin hücreleri. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne bütün hücre lizatları aktarın ve 15-30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
- Santrifüj maksimum hızda (20,000 xg) ve transfer, 30 dakika boyunca 4 ° C 'de lizatlar Bradford protein belirlenmesi ve daha sonra Western blot analizi için, yeni bir tüpe supernatant temizlenir.
- Proteinin kendi ve kaynaşık etiketi (örneğin, Bayrak) karşı antikorlar için tarama yaparken standart Batı benek analizi ile ilgili proteinin ekspresyon seviyesinin belirlenmesi. >% 95 GFP + hücreleri ve deneyler için ilgili proteinin güçlü bir ifadenin, viral seyreltme kullanın.
4. İzolasyon ve Kültür DRG'lerin (Figure 2 1 & 2) adımları
Şekil 2:. In vitro miyelinasyon tahlil DRG nöronların şematik iki hafta (1-2) üzerinden daha sonra saflaştırılmış ve kültüre P2-3 sıçan yavrularının, disseke edilir. OPC immunopanning kullanılarak P7-9 fare beyinlerinden saflaştırılır (3). OPC sonra lentivirüs ve 48 saat (4) kültürlendi ile enfekte edilir. OPC sonra DRG'ler üzerine ekilir ve bu BDNF gibi söz konusu herhangi bir büyüme faktörleri (5) ilave edilir. Eş-kültür 2 hafta OPC aksonlar ayırt etmek ve myelinate izin vermesi kültürlenir (6). Son olarak, ko-kültürler ya da batı lekeleme için lize edildi ve immünolojik hücre kimyası için sabittir (7).NOT: Gün 1- 2 gün önce diseksiyon için:
<ol> - Ceket 22 mm x 22 mm, lamelleri otoklava Poli-L-ornitin (0.5 mg / ml), 6-çukurlu plaka ve bir gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Bir sonraki gün, Laminin yeniden kat lamelleri gece boyunca 37 ° C'de (MEM içinde 20 ug / ml), fazla aspire ve doku kültürü kaputu 20 dakika boyunca kurutulur.
NOT: DRG'lerin Diseksiyon ve izolasyon: 2. Gün: - Kurban P2-P3 sıçan yavrular servikal transection tarafından 12x.
- Hayvanın arkasından kas örten cilt çıkarın. Vertebra foramen açın ve yavaşça omuriliği oymak için forseps kullanmak için Vannas makas kullanın.
- Vertebra sütunlar arasında yalan DRG'lerin dışarı koparmak ve 3 ml L-15 medya içeren bir 33 mm Petri kabındaki bağlı sonra spinal sinir liflerini, yer DRG'lerin kesti. Bu omurilik her taraftan DRG 8 ila 12 bir araya getirmenin mümkün olduğunu
- 5 dakika boyunca 180 x g'de 15 ml tüp, santrifüje L-15 ortamı ile birlikte Aktarım toplanan DRG'ler.
- SolukluSüpernatan, pelet DRG ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübasyona 2 mi,% 0.25 tiripsin ilave edin.
- Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 180 x g'de tripsin ve santrifüj durdurmak için DRG peletler M1 ortamında (stok çözeltisi Tabloya bakınız) 5 ml ilave edilir.
- Süpernatant aspire (değil büyüme faktörleri), 2 ml önceden ısıtılmış M1 orta pelet yeniden askıya. 50x pipetleme veya ganglion dağınık kadar ganglion pelet çiğnemek. 3 dakika boyunca 180 xg'de Santrifüj hücre süspansiyonu.
- Süspanse M1 medyada nöronlar ayrışmış ve iyi başına 100 ul başına 5 ganglionlar bir 6-plaka aşağı plaka.
- , Eki kolaylaştırmak M1 ortamı çıkarın ve M2 medya ile nöronların beslemek için 4 saat inkübasyon az sonra, nöronal olmayan hücrelerin çoğalan kaldırmak için (stok solüsyonu Tablo bakınız). NGF (100 ng / ml) varlığında kültür DRG nöronlarında NGF'sine bağlı, TrkA-sentezleyen DRG'ler bir kültür saflaştırmak için. Seçenek olarak ise, BDNF, bağımlı TrkB-Expres saflaştırmak için BDNF (100 ng / ml) kullanımıDRG'lerin şarkı.
- Aşağıdaki gibi 2 hafta içinde antimitotik M2 medya münavebeli (100 ng / ml'de + NGF ya da BDNF) M1 ortam nöronların koruyun.
- Günlerde ortam M1 (+, 100 ng / ml NGF ya da BDNF) muhafaza: 4-6, 8-10, sonra 1 12-14 ve M2'nin FDU ile ortam (100 ng / ml NGF ya da BDNF +) ve üridin için 4, 6-8, 10-12 ve. M2 medya arıtılmadan 3 kez en az gereklidir.
- 2 hafta antimitotik döngüsünü tamamladıktan sonra bir başka hafta M1 DRG yalnız koruyun. Her 2-3 günde M1 medya değiştirin.
5. İzolasyon ve OPC Kültür (Şekil 2 adım 3)
NOT: Gün 1- 2 gün önce diseksiyon için:
- Poli-D-lizin (PDL, steril iyondan arındırılmış su içinde 10 ug / ml), bir gece boyunca 4 ° C'de kaplayın 10 cm doku kültür plakaları.
NOT: Gün 2: diseksiyon önce 1 gün: - 3x için sterilize deiyonize su ile PDL plakaları yıkayın. Doku kültürü kaputu ~ 6 saat kurumasını bekleyin. Hemen kullanılan değilse, şal ve mağaza4 ° C 'de 4 hafta için.
- Immunopanning için ikincil antikor tabak hazırlayın. 1 beyin diseksiyon için, 2x IgG plakaları hazırlamak için (ran2 oligodendrositlerin premyelinating kaldırmak için astrositleri ve A1 antikoru uzaklaştırmak için bir antikor) 10 cm'lik petri tabağı başına DPBS 45 ul Keçi α-fare IgG (15 mi) ile; (Oligodendrosit öncü hücrelerin seçilmesi için O4 antikor) 1x IgM levha, DPBS 45 ul Keçi α fare IgM 10 cm Petri çanağı başına (15 mi).
NOT: Gün 3: diseksiyon gün: - Papain tamponu (Tablo 2), 10 ml papain 200 adet ekleyin ve tampon açık olana kadar 37 ° C'de ısıtın.
Tablo 2: Papain tampon hazırlanması.Konsantrasyon 250 ml Nihai konsantrasyon EBSS stok 10x 25 mi 1x MgSO 4 100 mM 2.5 mi 1 mM Glikoz % 30 3 mi 0.46% EGTA 0.5 M 1 mi 2 mM NaHCO 3 1M 6.5 mi 26 mM Deiyonize su ve filtre sterilize ile 250 ml hacmi kadar getirin - DP ile tüm ikincil antikor plakaları yıkayın3x BS.
- IgG plakaları ve IgM plakasına O4 hibridoması üzerine ran2 ve O1 antikoru dökün. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca tüm bu birincil antikor inkübe.
- Bir P7 sıçan gelen bir beyin teşrih. Bilenmiş makas ile yavru başını kesmek ve makas ile kafatası örten deri kaldırmak.
- Oksipital lobda, temporal lob gelen ve frontal lob kafatası etrafında kesin. 1 ml DPBS ile 35 mm Petri kabı transfer hafifçe forseps kullanılarak kafatası beyin çıkarın ve.
- Kabaca makas veya steril bıçak ile küçük parçalar halinde beyin zar.
- L-sistein arasında bir kaç tane ihtiva eden yeni bir 15 ml tüp içine filtre önceden ısıtılmış papain tamponu (10 mi), daha sonra filtre edildi, papain tampon 200 ul, DNAaz (12,500 U / ml) ilave edilmektedir.
- Doğranmış beyin dokularında üzerine papain tampon dökün; 90 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Gentlly transferi 25 ml'lik bir pipet kullanılarak 50 ml tüp içine beyin dokuları ayrılmış veyerleşmek için izin verir.
- , Papain tamponu çıkarın beyin dokularının parçalarını kırmak için pipetle beyin dokularında ve titurate 5-10x 2 ml Lo OVO (ovomukoid) ekleyin, yerleşmek ve yeni bir tüp süpernatant üst 2 ml kaldırmak için izin verir.
- Dokusunda hiçbir topakları kalmayacak beyin dokularında ve tekrar adım 5.11 başka 2 ml Lo OVO ekleyin. Toz haline getirme giderek agresif alabilirsiniz.
- Santrifüj 200 x g'de 15 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu ayrışmış. Aspire süpernatan ve 10 ml Hi Ovo içinde tekrar süspansiyon hücre topağı, 200 x g'de 15 dakika boyunca santrifüje tabi tutun.
- 3x için DPBS ilk immunopanning plakasını (Ran 2 tabak) yıkayın. Süpernatant aspire, 10 ml tekrar süspansiyon hücreleri tampon (Tablo 2) kaydırma ve ilk immunopanning plaka (Ran 2 plaka) üzerine dökün. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe hücreleri.
- 3x için DPBS ile ikinci immunopanning plakasını (A1 plaka) yıkayın.
- İlk immunopanning plaka üzerinde inkübe edildikten sonra, ikinci üzerine hücre süspansiyonu ucuimmunopanning plaka (A1 plaka), A1 plaka pipetle tampon ve transferi kaydırma 1-3 ml plaka yüzeyinden herhangi bir gevşek hücreleri durulayın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe hücreleri.
- Üçüncü immunopanning plakasını (plaka O4) yıkayın. Bu plaka OPC yüzeyini bağlayan olumlu seçim plaka. 3x için DPBS ile O4 plakasını yıkayın.
- İkinci immunopanning plaka üzerinde inkübe edildikten sonra oda sıcaklığında 45 dakika boyunca hücreler, nihai immunopanning plakasına (O4 plaka) hücreleri transferi inkübe edin. Bu adım O4 + OPC seçecektir.
- Son immunopanning plakası (O4 plaka) süpernatant aspire ve 6x için EBSS'ye ile plaka yıkayın.
- Plakasından OPC kaldırmak için, sıcak,% 0.05 Tripsin-EDTA, 5 ml ile hücrelerin inkübe 8 dakika boyunca 37 ° C'de EBSS'ye ile 1:10 seyreltilmiştir.
- Tripsin nötralize edilmesi için (EBSS'ye yapılan)% 30 FBS 5 ml ilave edilir. Yaklaşık 50x için pipetleme plaka yüzeyinden hücreleri çıkarmak.
- Tüm hücre aktarın200 x g'de 15 dakika boyunca yeni bir tüp ve santrifüj süspansiyon.
- Hücre sayımı ve ardından önceden ısıtılmış Sato ortam 1 ml supernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletini atın. Bir beyin diseksiyonu 1,5-2 milyon OPC elde edebilirsiniz.
- Kirpiksi nörotrofik faktör içeren Sato ortam içinde 1 x 10 5 ve 5 x 10 5 10 başına cm plaka arasında bir yoğunlukta, kuru PDL kaplı plakalar üzerine plakası hücreleri (10 mi) (CNTF, 10 ng / ml), örneğin platelet türevi büyüme faktörü 3 (NT3, 1 ng / ml), nörotrofin (PDGF, 10 ng / ml) ve forskolin (4.2 ug / ml), 2,12. 37 ° C 'de kültür OPC,% 8 CO2.
6. İleten OPC
- CNTF ile Sato ortam (10 ml / 10 cm plaka) Kültür birinci OPC (10 ng / ml), PDGF (10 ng / ml), NT3 (1 ng / ml) ve forskolin (4.2 ug / ml), 37 ° C 'de, diseksiyonu sonrası 24 saat% 8 CO 2.
- Tamamen (10 ml OPC kültür ortamı, taze yapılmış SATO medya ile besleme hücreleri aspire), Büyüme faktörleri ile () aşama 6.1'de yukarıya bakın.
- Bir başka 48 saat için, aşama 3 (Şekil 2, adım 4), kültür OPC ile belirlenen en uygun konsantrasyona kadar OPC virüs ekleyin.
Eş-kültür Myelinating 7. OPC Tohum (Şekil 2, adımlar 5 ve 6)
- Iki kez 8 mi EBSS'ye ile yüzeyden OPC, birinci durulama OPC plakaları çıkarmak için, daha sonra sıcak% 0.05 tripsin-EDTA, 5 ml 2 dakika için 37 ° C 'de EBSS'ye ile 1:10 seyreltilmiş, hücreler inkübe edin.
- EBSS'ye içinde% 30 FBS ile tripsin (5 mi) nötralize ve pipetleme hücreleri plakadan çıkarın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 180 x g'de 15 ml tüp, santrifüj hücre süspansiyonu aktarın.
- Aspire hücre sayısı ve ardından önceden ısıtılmış SATO medya 1 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelet kapalı.
- OPC tohumlama öncesinde, DRG kültür plaka tamamen aspire medya. Yavaşça 200.000 OPC DRG nöronlar üzerine damla damla tohum olarak daha önce 4-6 nitelendirdi.
NOT:Toplam OPC tohumlama hacmi 22 mm lamel başına en az 200 ul olmalıdır. - Sonra yavaşça 1 ml önceden ısıtılmış SATO medya ile kontör başına iyi, doku kültürü kaputu 10 dakika süreyle plaka hareket etmeden yerleşmek için hücreleri bırakın.
- Büyüme faktörleri ile SATO medya ile kalan kardeş OPC Replate (adım 6.1). İlgi konusu proteinin ekspresyonunu doğrulamak için bu kardeş OPC kullanın.
- 24 saat sonra,% 1 B27 ile ko-kültür ortamı (2 ml / oyuk) ihtiva eden Sato ortam (hiç faktörler) ve Neurobasal (h / h) ile Sato ortamı değiştirin. Ortam değişikliği ile 14 gün boyunca her 2-3 gün için ko-kültürler koruyun.
- Western blot analizi ile miyelin protein ekspresyonu için ko-kültürler değerlendirmek ve miyelin bazik protein belirteçleri ve nöronal belirteçler 4-6 karşı antikorlar ile çift immüno-boyama ile miyelinli aksonal segmentlerin oluşumu için görsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FLAG-etiketli hücre dışı sinyal ile ilişkili kinaz 1 (Flag-ERK1) enzim 2K7 yapıları ve virüs üretimi için gerekli olan ambalaj ve aksesuar yapılar, her iki dahil olmak üzere kullanılan yapıların, bir restriksiyon dijest ile doğrulanır lentivirüs üretimi için kullanılan yapı (Şekil 3) .
Şekil 3: DNA yapısı doğrulama. Lentivirüs üretimi için gerekli olan bütün DNA yapıları, Stbl3 bakteriden saflaştırılmıştır ve sınırlama enzimi sindirimi ile doğrulanmıştır. Aksesuar ve paketleme vektörleri belirtilmiştir, ve kesilmemiş bir plazma (A) 'ya göre, Ncol ve EcoRI ile sindirildi. 2K7-GFP Spel ve Sacll (A) ile sindirilmiştir. 2K7-Flag-ERK1 DNA, tek başına Spel veya Sacll ile ya sindirimi ile doğrulanmıştır, ya da çift sindirmek (B) oldu. Bantlama desenleri vardımaymun yazılımı kullanarak yapı dizilerinin sanal sindirim oluşturulan beklenen desenleri ile karşılaştırıldığında.
OPC kullanmak için uygun bir seyreltme belirlemek için Erk 1 lentivirüs HEK293T hücreleri (Şekil 4) titre edilmiştir. Bu viral HEK293T hücrelere seyreltileri, bir dizi ekleyerek yapılır (Şekiller 4A, 4C ve 4D) ve OPC (Şekil 4B) kadar edildi. Zaman (Şekil 4D) ile gen-faiz artışı ifade seviyeleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: HEK293T hücreleri ve OPC Flag-ERK1 virüsü Titrasyon. Flag-ERK1 virüs HEK293T hücrelerinde titre edilmiştir (A, C, D) veya OPC (B). HEK293T hücreleri (A) ya da OPC (B), Flag-ERK1 virüs ile enfeksiyondan sonra GFP tanımı, 48 saat boyunca görüntülenmiştir. HEK293T hücre lizatları ERK1 ya da enfeksiyon, toplam ERK1 / 2 48 saat sonra, (C) 'nin mevcudiyetine karşılık sonda edilmiştir. HEK293T hücre lizatları bir yükleme kontrolü 48 saat veya Bayrak-ERK1 virüsü (D) ile enfeksiyondan sonra 96 saat olarak ya Bayrak varlığı, ERK1 / 2 ve Aktin için problanmıştır. Bu lekeler, tüm lekelenen ve iki zaman noktalarında (D) ifade seviyeleri doğrudan karşılaştırılmasını kolaylaştırmak için birlikte görüntülendi. (A) için ölçek çubuğu 100 mikron =. (B) için ölçek çubuğu 50 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Uygun virüs seyreltme belirlendikten sonra, saflaştırılmış OPC transgen sentezleme suff ulaşmasına izin verecek biçimde 48 saat en az enfekte edilmiş ve kültüre edildiicient kat, daha sonra miyelinasyon potansiyeli (Şekil 5) değerlendirmek için DRG nöronlarının ekilmiştir. DRG nöronlar üzerine numaralı seribaşı sonra, OPC oligodentrositlere ayırt ve batı lekeleme (Şekil 5C) tarafından değerlendirilebilir miyelin proteinleri, ifade başlayacak. Bazı olgun oligodendrositler myelinate olacak, ve bu MBP boyama (Şekil 5D) üzerinden görüntülenebilir. Aksonlar da myelinasyon düzeylerinin analiz edilmesi sırasında akson yoğunluğu dikkate alınır sağlamak için böyle Nörofilaman veya βIII-tubulin (Şekil 5D) ve bir marker ile boyanmış olması gerekir.
Şekil 5: OPC DRG nöronlarının üzerine tohumlama yapılmadan önce 48 saat süre ile Flag-ERK1 virüsü ile enfekte edildi. Kardeş OPC sabit ve Bayrak ve GFP (A) için boyandı ya parçalanır ve doğrulamak için Bayrak ve ERK1 için problanmıştır yaviral aşın protein (C) 'nin ifadesi. Eş-kültür kültürde, 2 hafta sonra sabit ve βIII-tubulin ve MBP DRG aksonlar görselleştirmek ve myelinating gibi olmayan myelinating oligodendrositler (B) için boyandı. Bir Myelinating oligodendrosit ok-baş (B) ile gösterilir ok ve olmayan Myelinating oligodendrosit ile gösterilir. Paralel ko-kültürler çözülmüş ve ko-kültür (D) 'de transgen ekspresyonunu doğrulamak için, miyelin protein MBP ve MAG, hem de işaretle ve ERK1 / 2 için problanmıştır. ERK1 seviyelerinde bir artış, Lizatlar Ölçek çubuğu = 20 um mevcut DRG türetilmiş ERK1 büyük miktarlarda ko-kültür görülmemiştir.
| Isim | Malzemeler | Notlar |
| TE Tamponu, pH 8 | 10 mM Tris, pH 8 1 mM EDTA, pH 8 | Iyonu giderilmiş su içinde tamamlanır. |
| Polietilenimin (PEI) | 1 g / l | -20 ° C'de iyonu giderilmiş suda, filtre-sterilize ve mağaza stokları tamamlanır. |
| LB ortamında | 20 gr Tripton 10 g Maya özütü 10 gr NaCl | Iyonu giderilmiş su ile, 2 L tamamlanır |
| % 50 Gliserol stok | Gliserin | Iyonu giderilmiş su ve otoklav bir eşit hacmi ile tamamlanır |
| HEK 293, T hücre ortamı | DMEM % 10 Fetal Sığır Serumu % 1 Penisilin / streptomisin % 1 L-glutamin | |
| TNE liziz tamponu | 10 mM Tris, pH 8 150 mM NaCI 1 mM EDTA, pH 8 % 1 NP-40 | Bu, su ile temas halinde kristalize olur ilk deiyonize su daha küçük bir hacimde NP40 içinde çözülür. Iyonu giderilmiş su içinde nihai hacme tamamlanır |
| M1 | MEM % 10 Fetal Sığır Serumu % 0.4, D-glukoz 2 nM L-glutamat % 1 Penisilin / streptomisin | Sıçan DRG nöronlar ile kullanım için |
| MM1 | Neuro temelli vasat 2% B27 (SM1) ek % 0.4, D-glukoz 2 nM L-glutamat % 1 Penisilin / streptomisin | Fare DRG nöronlar ile kullanım için |
| M2 | DMEM 10 mg / ml transferin 5 mg / L İnsülin 20 nM progesteron 100 uM Putresin 10 uM FDU 10 uM Üridin | 1-2 ay içinde kullanılmak üzere bir büyük hacimli FDU olmadan DMEM ve üridinin M2 Makyaj. 2 hafta içinde bitmiş olabilir küçük birimlere FDU ve üridin ekle |
| MM2 | MM1 10 uM FDU 10 uM Üridin | 2 hafta içinde bitmiş olabilir ortamın küçük hacimleri FDU ve üridin ekleyin. |
| 10x MT-PBS, pH 7.4 | 28,48 g / L (160 mM) 2 Na HPO 4 · 2H 2 O 5.52 g / L (40 mM) NaH 2 PO 4 · H 2 O 87,66 g / L (1.5 M), NaCI | Iyonu giderilmiş su ilave edin ve 10 N NaOH ile 7.4'e pH ayarlamak |
| 1x MT-PBS | 10x MT-PBS Deiyonize su | 1x MT-PBS için deiyonize su içinde 10 kat MT-PBS 1:10 seyreltin |
| 10x Borat tamponu (1.5 M) | 18.55 gr Borik asit 1x MT-PBS | 150 mi 1x MT-PBS içinde, borik asit içinde çözülür. 10 N NaOH ile pH 8.56 ayarlayın ve 1x MT-PBS ile 200 ml son hacim. Otoklav |
| 1x Borat tamponu (0.15 M) | 10x Borat tamponu 1x MT-PBS | PLN çözülmesi için, bu tampon 100 ml hazırlayın. 10 mi 10x borat tampon (pH 8.56) ve 1x MT-PBS, 90 ml ekle |
| 0.5 mg / ml poli-L-ornitin (PLN) | 50mg Poli-L-ornitin hidrobromid 0.15 M Borat tamponu (pH 8.56) | 1x borat tamponu, 100 ml poli-L-ornitin hidrobromid 50 mg eritin. En fazla bir ay için 4 ° C'de filtre sterilize edin (0.22 um filtre) ve mağaza |
| 100x Poly-D-lisin (PDL) | 5 mg Poli-D-lizin Steril deiyonize su | 100x PDL stokları tek kullanımlık parçalar halinde -20 ° C de dondurulabilir. Kullanım sırasında, steril, de-iyonize su içinde 1x seyreltilmiş |
| Papain tampon | Tablo 2 görün | |
| Dnaz | 12,500 U DNase I 1 mi EBSS | Buz üzerinde, soğutulmuş EBSS'ye 1 ml Dnaz I çözülür. Kısım (örneğin, 300 ul / tüp) ve -20 ° C'de gece boyunca dondurma. -20 ° C'de saklayın. |
| % 4 BSA | 8 g BSA 200 mi DPBS | 37 ° C'de 150 mi, DPBS içinde BSA içinde çözülür. ~ Ile 7.4'e pH ayarlama1 N NaOH ile 1 mi. 200 ml hacim kazandırın. Sterilize etmek için 0.22 um filtre içinden filtre. -20 ° C'de 1 ml'lik numuneler hazırlayın ve mağaza olun. |
| 10x Lo ovomukoid | 3 g BSA 200 mi DPBS 3 g tripsin inhibitörü | 150 ml DPBS için BSA ekleyin ve iyice karıştırın. Tripsin önleyici ilave edin ve eritmek için karıştırın. PH'ı 7.4'e ayarlamak için 1 N NaOH ~ 1 ml ilave edilir. DPBS ile 200 ml hacim getirin. 0.22 um'lik bir filtreden filtre-sterilize edin. -20 ° C'de 1 ml'lik numuneler hazırlayın ve mağaza olun. |
| 6x Merhaba ovomukoid | 6 g BSA 200 mi DPBS 6 g tripsin önleyicisi | 150 ml DPBS için BSA ekleyin ve iyice karıştırın. Tripsin önleyici ilave edin ve eritmek için karıştırın. PH'ı 7.4'e ayarlamak için 1 N NaOH ~ 1 ml ilave edilir. DPBS ile 200 ml hacim getirin. 0.22 um'lik bir filtreden filtre-sterilize edin. -20 ° C'de 1 m alikotları ve mağaza olun. |
| SATO baz | Tablo 3 görün | |
| SATO medya (sıçan) | 1% SATO baz % 1 Penisilin / streptomisin 1%, 0.5 mg / mL arasında insülin % 1 L-Glutamin % 0.1 NAC % 0.1 Biyotin DMEM ve filtre sterilize ile yapın. | |
| SATO medya (fare) | 1% SATO baz 1%, 0.5 mg / ml insülin % 1 Penisilin / streptomisin % 1 L-Glutamin % 0.1 NAC % 0.1 Biyotin % 0.1 İz Elementler B % 2 B27 DMEM ve filtre sterilize ile yapın. | |
| Ensülin | 10 mg insülin 20 mi steril deionzed su | Iyonu giderilmiş su insülin ekleyin ve insülin çözünmesi için 1 N HCI, 100 ul ilave edin. İyice karıştırın. 4-6 hafta süre ile, 4 ° C'de bir 0.22 mikron filtre ve mağaza Filtre |
| NAC (N-asetil-L-sistein) | 5 mg / ml NAC DMEM | 5 mg için DMEM'de NAC çözülür/ Ml -20 ° C'de çözelti, belirtilen miktar ve saklayın. |
| Cı-Biyotin | / Ml biyotin 50 ug Steril deiyonize su | -20 ° C'de 50 ug / ml solüsyon, bir kısım ve mağaza yapmak için su içinde biotin eritin. |
| CNTF (siliyer nörotrofik faktör) | 10 ug / ml CNTF DPBS içinde% 0.2 BSA | DPBS steril% 0.2 BSA ile 10 ug / ml çözelti yapmak için CNTF seyreltin. Kısım, -80 ° C'de, sıvı azotun ve deposunda flaş dondurma. |
| PDGF (platelet türevli büyüme faktörü) | 10 ug / ml, PDGF DPBS içinde% 0.2 BSA | DPBS steril% 0.2 BSA ile 10 ug / ml (üreticinin talimatlarına göre hazırlanmıştır), PDGF, ana stokunu. Kısım, -80 ° C'de, sıvı azotun ve deposunda flaş dondurma. |
| NT3 (nörotrofin-3) | 1 ug / ml, NT-3 DPBS içinde% 0.2 BSA | NT3 ana stoc seyreltink, DPBS steril% 0.2 BSA ile 1 ug / ml olacak şekilde (üreticinin talimatlarına göre hazırlanmıştır). Kısım, -80 ° C'de, sıvı azotun ve deposunda flaş dondurma. |
| Forskolin | 50 mg Forskolin Steril DMSO | Forskolin 50 mg şişesine 1 ml steril DMSO ilave edin ve tamamen tekrar süspansiyon iyice karıştırın. 15 ml'lik bir tüpe aktarın ve 4.2 mg / ml'lik bir konsantrasyona ulaşmak için 11 ml steril DMSO ilave edin. -20 ° C'de kısım ve mağaza. |
Tablo 3. Stok çözümleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aksonların myelinizasyonuna omurgalıların merkezi ve çevresel sinir sistemlerinde optimal fonksiyonu için önemli bir işlemdir. miyelinli akson nesil ve bakım ve hücre dışı matriks proteinleri (Schwann hücreleri veya oligodendrositler itibaren) moleküler nöronal arasındaki etkileşimleri, glial içeren bir karmaşık ve koordineli bir süreçtir. Bu protokolün önemi ve uygulanabilirliği karışık ko-kültür ayarları içinde belirli bir hücre tipinde proteinlerin manipülasyonu izin vermesidir. Birden fazla hücre tipleri, belirli proteinlerin aktivitesini engellemek için künt farmakolojik araçlarını kullanarak, in vivo ve in vitro miyelinasyon tayininde hem miyelinasyona katılan veya sinyal yolları proteinler ya nöronal gelen miyelinasyona üzerine uyguladığı etkisi hakkında özel bilgiler sağlayamaz gibi ya glial perspektif, protein, benzersiz bir hücre tipi ile ifade edilir edilmiştir. Bu nedenle, in vitro olarak miyelinasyonoligodendroglial proteinler miyelinasyona üzerine uyguladığı etkileri sorgulamak için bize izin verir özellikle OPC uyum sağlamak Lentivirüste kullanımı ile bağlantılı olarak söylüyorlar. Biz başarıyla oligodendroglial sinyaller MSS miyelinasyonu 9 üzerinde sarf etkisini incelemek amacıyla özellikle in vitro miyelinasyon deneyi için oligodendrositler özellikle proteinleri aşırı ifade etmek 2K7 lentivirüs kullandık.
In vitro miyelinasyon tayininde transdüse OPC tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, optimizasyon inceleme ve OPC tohumlama yoluyla klonlama gelen protokolün her adım için gereklidir. Bu DNA düzeyinde, ilgi yapısının etiketli gen içeren pENTR vektör sıklıklandırılır zorunludur ve ilgi etiketli gen ile 2K7 DNA etiket ifadesi ve söz konusu gen için western blot tarafından kontrol edilmesi, virüs üretmek için DNA kullanılarak, önce. Ya HEK293Tcells veya HEK293 seçmek için esastırFT hücreleri virüs üretmek ve mikoplazma ücretsiz ortamda büyümek. Lentivirüs üretilmesinden sonra, OPC kullanmak için uygun bir seyreltme belirlemek için virüsün her parti titre etmek için önemlidir. Bu HEK293T hücrelere veya OPC viral seyreltilerde bir dizi ilave edilerek yapılabilir. 2K7 yapısı, her iki gen-faiz ve GFP içerdiğinden, transdüksiyon etkinliği floresan mikroskobu ile GFP ekspresyonu ile ve etiket ifadesi ve Batı benek analizi ile ilgili geni tahlil ile değerlendirilebilir. Mümkün olduğu kadar çok sayıda viral partiküller tek bir hücre enfekte için parlak GFP + hücreler daha yüksek virüs konsantrasyonu ile görünür hale gelecektir. Floresan mikroskobu ile GFP ekspresyonunun doğrulanması GFP virüs ve ifade titresi yararlı bir göstergedir, ancak ilgilenilen proteinin ekspresyonunu kontrol etmek için bir vekil olarak kullanılamaz. Her iki HEK293T hücrelerde ilgi konusu proteinin ekspresyonu seviyesini kontrol etmek için kritiktirve western blot analizi ile OPC. İlgi dahilindeki protein eş kültürlerinde nöronlar tarafından endojen olarak ifade edilirse western blot ile ko-kültür lisat analiz edilirken, OPC / OLS tarafından aşın maskelenebilir; böylece ko-kültür takdirde ilgilenilen proteinin ekspresyonu kardeş OPC kontrol edilebilir, böylece tohum aşağıdaki ilgi veya kültür kardeş OPC proteini etiketlemek için ya da önemlidir.
deneyler başarılı olursa DRG ve OPC kültür hem de kalitesini doğrudan belirler. Kokültürünün ayarlarında, sıçan DRG nöronlarında sıçan veya fare türetilen OPC ile kültive edilebilir. OPC nazik ve hızlı kullanım gerektirir. Bu çok az etkili bir şekilde nöronlar üzerine tohum çok az sayıda hücre vardır, böylece OPC için toksik olan ilgi ve çok fazla virüs proteininin ifadesinin düşük düzeylerine yol açan OPC nakletmek için başarısız olarak OPC virüs titresi optimize etmek için önemlidir. Bu optimal transdüksiyon Hem Resul olabilirmiyelinasyon veya miyelin proteini ifade unanalyzable veya önemsiz değişiklikler t. Onlar konfluant üzerinde olmak ve yerel koşullara optimize edilmesi, kültürlü OPC ve transdük ihtiyaçlar dolayısıyla sayıda farklılaşmış sonra seribaşı olamaz eğer OPC ayırt. Bu, birden fazla deney içinde koşulları arasında karşılaştırılan miyelinli aksonal parça sayısına doğrudan karşılaştırma izin her miyelinasyon deneyi için OPC aynı sayıda tohum arzu edilir.
Bu tekniğin önemli bir dezavantaj miyelinasyon tahlilleri arasında başlangıç miyelinasyon seviyelerinde değişkenliktir. Viral transdüksiyon sonra, miyelinasyon bazal seviyede viral yönden enfekte OPC saf (dışı virüs tarafından enfekte edilmiş) OPC gibi myelinate olmadığını düşündürmektedir azaltılır. Bu, her bir deneyde bazal miyelinasyon için miyelinasyon nisbetle ölçüde miktarının aşılabilir. Bu nedenle, sadece GFP ifade eden boş vektör bir iç Contr olarak kullanılmalıdırol elde edilir. Miyelinasyon ek olarak, ilgi konusu bir protein ekspresyonu, miyelinasyon üzerinde dolaylı bir etkiye yol açan, örneğin hayatta kalma, yayılma ve farklılaşma gibi OPC diğer yönlerini etkileyebilir. Bu nedenle, örneğin hücre canlılığı gibi OPC davranış analizi miyelinasyonun deneyleri paralel olarak yapılmalıdır.
Burada anlatılan viral transdüksiyon yöntemleri oligodendrosit miyelinasyon çalışma ile sınırlı değildir; aslında yaygın ve en iyi duruma getirme, bireysel hücre tipi için gerekli olabilir, örneğin Schwann hücrelerinin, astrositlerin, nöronlar gibi diğer hücre tipleri, uygulanabilir. Bu protokol, bir karma hücre kültür sistemi kullanırken özel avantajlara sahip arzu edilen bir hücre tipi, ilgi (doğal tipte veya mutant) bir proteinin seçici bir aşırı ifadesi ile çoğalması ve farklılaşması gibi hücre davranışını incelemek için büyük bir esneklik sunar. transdüksiyonu için kullanılan hücreler, sıçan ya da ya da izole edilebilirFare (yabani türü veya transgenik), böylece bir in vivo transgenik fare modeli kullanılarak daha tüketen elde etmek genellikle zordur transgenik hayvanlarda sinyalizasyon ve tazminat mekanizmaları hedeflenen çalışmada, ve çok daha fazla zaman izin. Son zamanlarda bulunan kanıtlar, lentiviral tabanlı strateji başarılı bir şekilde in vivo olarak, lentiviral yaklaşımlar kullanılarak oligodendroglial hücrelerin transduse güçlü bir potansiyel düşündürmektedir hayvan modellerinde 13 hücre transdüksiyonu için kullanılmış olduğunu göstermektedir.
Sonuç olarak, OPC ve Lentiviral enfeksiyonu ile in vitro miyelinasyon tahlil birleştirerek miyelinasyona yer alan moleküler mekanizmaların analizi için stratejik bir araç sağlar. miyelinasyon spesifik proteinlerin rolü sorgulanır ve OPC sıçan DRG ko-kültürlerinde kullanılmak için sıçanlar ve fareler izole edilebilir, lentiviral yaklaşım, Mech sorgulamak için çeşitli fare hatları nakavt teknolojisi ile kombinasyon halinde de kullanılabilirmiyelinasyonun süreçlerinde tazminat nizmasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2K7 lentivector | Kind gift from Dr Suter9 | ||
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100mg | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115545205 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11012 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518-5G | |
| B27 - NeuroCul SM1 Neuronal Supplement | Stem Cell Technologies | 5711 | |
| BDNF (Human) | Peprotech | PT450021000 | |
| Biotin (d-Biotin) | Sigma Aldrich | B4639 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4161 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-100G | |
| CNTF | Peprotech | 450-13020 | |
| DAKO fluoresence mounting media | DAKO | S302380-2 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Life Technologies | 10313039 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-375KU | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Life Technologies | 14040182 | |
| EBSS | Life Technologies | 14155063 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101 | |
| Entry vectors for promoter and gene of interest | Generate as per protocols 1-2 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886-50MG | |
| Glucose (D-glucose) | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycerol | Chem Supply | GL010-500M | See stock solutions |
| Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115005003 | |
| Goat Anti-Mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115005020 | |
| Goat Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 112005167 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Igepal | Sigma Aldrich | I3021-100ML | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Laminin | Life Technologies | 23017015 | |
| LB Medium | See stock solutions | ||
| LB-Agar | See stock solutions | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-7477 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415064 | |
| L-Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| L-Glutamine- 200 mM (100x) liquid | Life Technologies | 25030081 | |
| LR Clonase II Plus enzyme | Life Technologies | 12538-120 | |
| MEM, NEAA, no Glutamine | Life Technologies | 10370088 | |
| Mouse α βIII Tubulin | Promega | G7121 | |
| Mouse αMBP (monoclonal) | Millipore | MAB381 | |
| Na pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| NAC | Sigma Aldrich | A8199 | |
| NcoI-HF | NEB | R3193S | |
| NEBuffer 4 | NEB | B7004S | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| NGF (mouse) | Alomone Labs | N-100 | |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | |
| O1 antibody - Mouse anti-O1 | Millipore | MAB344 | Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable |
| O1 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning | ||
| O4 antibody - Mouse anti-O4 | Millipore | MAB345 | Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable |
| O4 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning | ||
| Competent cells | Life Technologies | A10460 | |
| One Shot Stbl competent cells | Life Technologies | C7373-03 | |
| Papain Suspension | Worthington/Cooper | LS003126 | |
| pBR8.91 | Kind gift from Dr Denham10 | ||
| PDGF-AA (Human) | Peprotech | PT10013A500 | |
| Penicillin-streptomycin 100x solution | Life Technologies | 15140122 | |
| pENTRY4IRES2GFP | Invitrogen | 11818-010 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727-100ML | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | |
| Protease inhibitor tablet (Complete mini) | Roche | 11836153001 | |
| Proteinase K | Supplied with Clonase enzyme | ||
| Putrescine | Sigma Aldrich | P-5780 | |
| Rabbit α neurofilament | Millipore | AB1987 | |
| Rabbit αMBP (polyclonal) | Millipore | AB980 | |
| Ran2 hybridoma cells | ATCC | TIB-119 | Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning |
| Rat anti CD140A/PDGFRa antibody | BD Pharmingen | 558774 | |
| SacII | NEB | R0157 | |
| SOC medium | Supplied with competent bacteria | ||
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| Spe I | NEB | R0133S | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Buffer | NEB | B0202S | |
| TE buffer pH8 | See stock solutions | ||
| TNE lysis buffer | |||
| Trace Elements B | Cellgro | 99-175-CI | |
| Transferrin (apo-Transferrin human) | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
| Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White | Roche | 10109878001 | |
| Trypsin-EDTA (1x), phenol red (0.05%) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 | Vector laboratories | L-1100 | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003-5G |
References
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Lee, K., et al. MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).
- Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Xiao, J., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes. Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).
- Lundgaard, I., et al. Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes. PLoS Biology. 11 (12), e1001743 (2013).
- Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture methodes for the study of myelination. , MIT Press. Cambridge, MA. (1991).
- Xiao, J., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro. J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).
- Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).
- Li, Z., et al. Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle. Molecular and Cellular Probes. , (2014).
- Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
- Murai, K., et al. Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).
