Summary

Производство и использование Лентивирус, чтобы выборочно преобразовывать Первичная олигодендроцитов клеток-предшественников для<em> In Vitro</em> миелинизации Анализы

Published: January 12, 2015
doi:

Summary

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

Abstract

Миелинизации представляет собой сложный процесс, который включает в себя как нейроны и миелин, образующий глиальные клетки, олигодендроциты в центральной нервной системе (ЦНС) и шванновских клеток в периферической нервной системе (PNS). Мы используем в пробирке миелинизации анализ, установленную модель для изучения ЦНС миелинизации в пробирке. Чтобы сделать это, клетки олигодендроцит предшественника (OPCS) добавляются к очищенной основной грызунов спинной ганглий корень (DRG) нейронов, чтобы сформировать myelinating сопутствующих культур. Для того, чтобы специально допросить роли, что отдельные белки, выраженные олигодендроцитах оказать на миелинизации мы разработали протоколы, которые избирательно преобразовывать OPCs помощью лентивирус с гиперэкспрессией дикого типа, постоянно активный или доминантных негативных белки перед посеяны DRG нейронов. Это позволяет нам специально допросить роли этих олигодендроглиальным белков в регуляции миелинизации. Протоколы могут быть применены при изучении OTее типы клеток, обеспечивая тем самым подход, который позволяет избирательно манипулировать белков, выраженных от желаемого типа клеток, таких как олигодендроциты для целевого изучения сигнализации и механизмы компенсации. В заключение, сочетая в пробирке миелинизации анализа лентивирусными инфицированных OPCs обеспечивают стратегический инструмент для анализа молекулярных механизмов, участвующих в миелинизации.

Introduction

Миелинизации аксонов имеет решающее значение для быстрого и эффективного передачи потенциалов действия как в центральной и периферической нервной систем. Специализированных клеток, шванновских клеток в периферической нервной системе и олигодендроциты в центральной нервной системе, обернуть вокруг и ensheathe аксоны в миелина, эффективно изолирующих нерв и облегчающие сальтаторных проводимость 1. Процесс миелинизации могут быть изучены в лабораторных помощью сетчатки ганглиозных нейронов 2, инженерные нановолокон 3 или задних корешков ганглиев сокультивировали либо с клетками Шванн 4 или олигодендроцитах 5-7. В пробирке миелинизация анализ является известной моделью для изучения нервной системы миелинизации и она повторяет многие из фундаментальных процессов, которые происходят во время миелинизации в естественных условиях 5-8. Анализ включает совместного культивирования очищенных популяций спинных ганглий (DRG) нейронов, с OPCs (для CNS миелинизация) или Шванн клетки (для ПНС миелинизации). При определенных условиях эти myelinating клетки ensheathe DRG аксоны в упорядоченной, ультра структурно проверены, мульти-пластинчатые листа изолирующего клеточную мембрану, что выразить одинаковый набор миелиновых специфических белков, присутствующих в естественных условиях.

Наиболее часто используется сотовый модель изучения ЦНС миелинизации в пробирке является со-культуры DRG нейронов и OPCs, которые были успешно использованы для изучения влияния, что экзогенные факторы, такие как нейротрофинов оказывают на ЦНС миелинизации в пробирке 5,6. Внешние факторы, такие как факторы роста или низкомолекулярных фармакологических ингибиторов широко используется для изучения роли сигнальных путей в миелинизации с помощью DRG-OPC Совместное культивирование модели 7,9. Тем не менее, в случае смешанных со-культуры, которые содержат как нейроны и олигодендроциты, она по-прежнему формально можно что либо факторы роста или Pharmacological ингибиторы могли оказать воздействие на обоих нейронов DRG и олигодендроциты (ПР). Это действительно предлагает способность специфически вскрыть роль, что белки, выраженные только ДРГ или олигодендроглии оказывает на миелинизации с помощью этой системы двойной клеток. Однозначно подтверждают, что сигнальный путь в олигодендроглиальных непосредственно регулирует миелинизация, лентивирусный трансдукция OPCs, перед посевом на DRG нейронов для в пробирке миелинизации анализа, оказалась элегантный способ сверхэкспрессировать как дикого типа и мутантных белков, а также как нокдаун экспрессии конститутивно экспрессированных белков по олигодендроцитах. Таким образом, этот подход дает проспект специально опроса и манипулировать сигнальными путями внутри олигодендроцитах для изучения миелинизации 9,10.

В этой статье мы приводим методы, которые мы разработали для сверхэкспрессии представляющего интерес белка выборочно в олигодендроцитах с помощью лентивирусногоподход к изучению миелинизации в пробирке. Методика начинается с генерации векторов экспрессии, содержащих нужный ген, будь то в дикого типа, конститутивно активным или доминирующей негативной форме, которые затем последовательно клонировали в вектор pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Этот вектор (содержащий интересующий ген), ЦМВ промотор донора (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) и 2K7 lentivector объединены в ферментативной реакции с получением 2K7 вектор, содержащий промотор CMV, интересующий ген, Внутренняя рибосомальной сайт вход и GFP (рис 1). Этот шлюз клонировали 2K7 конструкция в сочетании с вирусной оболочки PMD2.G и вирус пакета pBR8.91 могут быть совместно трансфицировали в клетки HEK293T генерировать лентивирус, которые впоследствии могут быть использованы для трансдукции OPCs. После заражения с лентивирусов в OPCs выражают высокий уровень белка, представляющего интерес. Эти OPCs затем могут быть посеяны на DRG нейронов культур и эффект, что экспрессиявысоких уровней нужного белка оказывает на миелинизации может быть допрошен. Со-культуры оценивали на экспрессию белка миелина с помощью Вестерн-блот-анализа и визуализировали для формирования миелиновых аксонов сегментов по иммуногистохимии.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные, используемые в данном исследовании были смешанного пола и вырос на животных в Департаменте средств анатомии и патологии и Florey Института неврологии и исследований в области психического здоровья в Университете Мельбурна. Все процедуры на животных были одобре…

Representative Results

Флаг-меченый внеклеточного сигнала, связанных киназы 1 (Флаг-Erk1) используются в качестве конструкции для производства лентивирусов проверяется ферментом рестрикции переварить из конструкций, используемых, в том числе оба 2K7 конструкции и упаковки и вспомогательных конструкций, необх?…

Discussion

Миелинизации аксонов важный процесс для оптимального функционирования как центральных, так и периферической нервной системы позвоночных. Производство и техническое обслуживание миелиновых аксонов является сложным и скоординированный процесс с участием молекулярных взаимодействи…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC fellowship #454330 to JX, project grant #628761 to SM and APP1058647 to JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 to JX), the University of Melbourne Research Grant Support Scheme and Melbourne Research CI Fellowship to JX as well as Australia Postgraduate Scholarships to HP and AF. We would like to acknowledge the Operational Infrastructure Scheme of the Department of Innovation, Industry and Regional Development, Victoria Australia.

Materials

Item Manufacturer Catalog # Notes
2K7 lentivector  Kind gift from Dr Suter9
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100mg
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 115545205
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) Life Technologies A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) Life Technologies A11005
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) Life Technologies A11012
Ampicillin Sigma-Aldrich A9518-5G
B27 – NeuroCul SM1 Neuronal Supplement Stem Cell Technologies  5711
BDNF (Human) Peprotech PT450021000
Biotin (d-Biotin) Sigma Aldrich B4639
Bradford Reagent Sigma Aldrich B6916-500ML  
BSA Sigma Aldrich A4161
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378-100G
CNTF Peprotech 450-13020
DAKO fluoresence mounting media DAKO S302380-2
DMEM, High Glucose, Pyruvate, no Glutamine Life Technologies 10313039
DNase Sigma-Aldrich D5025-375KU
DPBS Life Technologies 14190250
DPBS, calcium, magnesium Life Technologies 14040182
EBSS Life Technologies 14155063
EcoRI-HF NEB R3101
Entry vectors for promoter and gene of interest Generate as per protocols 1-2
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12003C
Forskolin  Sigma Aldrich F6886-50MG
Glucose (D-glucose) Sigma-Aldrich G7528
Glycerol Chem Supply GL010-500M See stock solutions
Goat Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115005003
Goat Anti-Mouse IgM  Jackson ImmunoResearch 115005020
Goat Anti-Rat IgG Jackson ImmunoResearch 112005167
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
Igepal Sigma Aldrich I3021-100ML 
Insulin  Sigma Aldrich I6634 
Kanamycin Sigma-Aldrich 60615
Laminin  Life Technologies 23017015
LB Medium See stock solutions
LB-Agar See stock solutions
L-cysteine Sigma-Aldrich C-7477
Leibovitz's L-15 Medium Life Technologies 11415064
L-Glutamate Sigma-Aldrich G1626
L-Glutamine- 200mM (100X) liquid Life Technologies 25030081
LR Clonase II Plus enzyme Life Technologies 12538-120
MEM, NEAA, no Glutamine Life Technologies 10370088
Mouse α βIII Tubulin  Promega G7121
Mouse αMBP (monoclonal) Millipore MAB381
Na pyruvate  Life Technologies 11360-070
NAC Sigma Aldrich A8199
NcoI-HF NEB R3193S
NEBuffer 4 NEB B7004S
Neurobasal medium Life Technologies 21103049
NGF (mouse) Alomone Labs N-100
NT-3 Peprotech  450-03
O1 antibody – Mouse anti-O1 Millipore MAB344 Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable
O1 hybridoma cells Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning
O4 antibody – Mouse anti-O4 Millipore MAB345 Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable
O4 hybridoma cells Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning
 Competent Cells Life Technologies A10460
One Shot Stbl competent cells Life Technologies C7373-03
Papain Suspension Worthington/Cooper LS003126
pBR8.91 Kind gift from Dr Denham10
PDGF-AA (Human) Peprotech PT10013A500  
Penicillin- Streptomycin 100X solution Life Technologies 15140122
pENTRY4IRES2GFP Invitrogen 11818-010 
pMD2.G Addgene 12259
Poly-D-lysine Sigma P6407-5MG
Polyethylenimine (PEI)  Sigma-Aldrich 408727-100ML
Poly-L-ornithine  Sigma Aldrich  P3655
Progesterone  Sigma Aldrich P8783
Protease inhibitor tablet (Complete mini) Roche 11836153001
Proteinase K Supplied with Clonase enzyme
Putrescine Sigma Aldrich P-5780
Rabbit α neurofilament Millipore AB1987  
Rabbit αMBP (polyclonal) Millipore AB980
Ran2 hybridoma cells ATCC TIB-119 Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning
Rat anti CD140A/PDGFRa antibody BD Pharmingen 558774
SacII NEB R0157
SOC medium Supplied with competent bacteria
Sodium selenite  Sigma Aldrich S5261
Spe I NEB R0133S
T4 DNA Ligase NEB M0202S
T4 DNA Ligase Buffer NEB B0202S
TE buffer pH8 See stock solutions
TNE lysis buffer
Trace Elements B Cellgro  99-175-CI
Transferrin (apo-Transferrin human) Sigma-Aldrich T1147
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284 
Trypsin Sigma-Aldrich T9201-1G
Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White Roche 10109878001
Trypsin-EDTA (1X), phenol red (0.05%) Life Technologies 25300-054
Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 Vector laboratories  L-1100
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G

References

  1. Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).
  2. Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
  3. Lee, K., et al. MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).
  4. Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
  5. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
  6. Xiao, J., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes. Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).
  7. Lundgaard, I., et al. Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes. PLoS Biology. 11 (12), e1001743 (2013).
  8. Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. . Tissue culture methodes for the study of myelination. , (1991).
  9. Xiao, J., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro. J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).
  10. Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).
  11. Li, Z., et al. Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle. Molecular and Cellular Probes. , (2014).
  12. Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
  13. Murai, K., et al. Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).

Play Video

Cite This Article
Peckham, H. M., Ferner, A. H., Giuffrida, L., Murray, S. S., Xiao, J. Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays. J. Vis. Exp. (95), e52179, doi:10.3791/52179 (2015).

View Video