Abstract
Миелинизации представляет собой сложный процесс, который включает в себя как нейроны и миелин, образующий глиальные клетки, олигодендроциты в центральной нервной системе (ЦНС) и шванновских клеток в периферической нервной системе (PNS). Мы используем в пробирке миелинизации анализ, установленную модель для изучения ЦНС миелинизации в пробирке. Чтобы сделать это, клетки олигодендроцит предшественника (OPCS) добавляются к очищенной основной грызунов спинной ганглий корень (DRG) нейронов, чтобы сформировать myelinating сопутствующих культур. Для того, чтобы специально допросить роли, что отдельные белки, выраженные олигодендроцитах оказать на миелинизации мы разработали протоколы, которые избирательно преобразовывать OPCs помощью лентивирус с гиперэкспрессией дикого типа, постоянно активный или доминантных негативных белки перед посеяны DRG нейронов. Это позволяет нам специально допросить роли этих олигодендроглиальным белков в регуляции миелинизации. Протоколы могут быть применены при изучении OTее типы клеток, обеспечивая тем самым подход, который позволяет избирательно манипулировать белков, выраженных от желаемого типа клеток, таких как олигодендроциты для целевого изучения сигнализации и механизмы компенсации. В заключение, сочетая в пробирке миелинизации анализа лентивирусными инфицированных OPCs обеспечивают стратегический инструмент для анализа молекулярных механизмов, участвующих в миелинизации.
Introduction
Миелинизации аксонов имеет решающее значение для быстрого и эффективного передачи потенциалов действия как в центральной и периферической нервной систем. Специализированных клеток, шванновских клеток в периферической нервной системе и олигодендроциты в центральной нервной системе, обернуть вокруг и ensheathe аксоны в миелина, эффективно изолирующих нерв и облегчающие сальтаторных проводимость 1. Процесс миелинизации могут быть изучены в лабораторных помощью сетчатки ганглиозных нейронов 2, инженерные нановолокон 3 или задних корешков ганглиев сокультивировали либо с клетками Шванн 4 или олигодендроцитах 5-7. В пробирке миелинизация анализ является известной моделью для изучения нервной системы миелинизации и она повторяет многие из фундаментальных процессов, которые происходят во время миелинизации в естественных условиях 5-8. Анализ включает совместного культивирования очищенных популяций спинных ганглий (DRG) нейронов, с OPCs (для CNS миелинизация) или Шванн клетки (для ПНС миелинизации). При определенных условиях эти myelinating клетки ensheathe DRG аксоны в упорядоченной, ультра структурно проверены, мульти-пластинчатые листа изолирующего клеточную мембрану, что выразить одинаковый набор миелиновых специфических белков, присутствующих в естественных условиях.
Наиболее часто используется сотовый модель изучения ЦНС миелинизации в пробирке является со-культуры DRG нейронов и OPCs, которые были успешно использованы для изучения влияния, что экзогенные факторы, такие как нейротрофинов оказывают на ЦНС миелинизации в пробирке 5,6. Внешние факторы, такие как факторы роста или низкомолекулярных фармакологических ингибиторов широко используется для изучения роли сигнальных путей в миелинизации с помощью DRG-OPC Совместное культивирование модели 7,9. Тем не менее, в случае смешанных со-культуры, которые содержат как нейроны и олигодендроциты, она по-прежнему формально можно что либо факторы роста или Pharmacological ингибиторы могли оказать воздействие на обоих нейронов DRG и олигодендроциты (ПР). Это действительно предлагает способность специфически вскрыть роль, что белки, выраженные только ДРГ или олигодендроглии оказывает на миелинизации с помощью этой системы двойной клеток. Однозначно подтверждают, что сигнальный путь в олигодендроглиальных непосредственно регулирует миелинизация, лентивирусный трансдукция OPCs, перед посевом на DRG нейронов для в пробирке миелинизации анализа, оказалась элегантный способ сверхэкспрессировать как дикого типа и мутантных белков, а также как нокдаун экспрессии конститутивно экспрессированных белков по олигодендроцитах. Таким образом, этот подход дает проспект специально опроса и манипулировать сигнальными путями внутри олигодендроцитах для изучения миелинизации 9,10.
В этой статье мы приводим методы, которые мы разработали для сверхэкспрессии представляющего интерес белка выборочно в олигодендроцитах с помощью лентивирусногоподход к изучению миелинизации в пробирке. Методика начинается с генерации векторов экспрессии, содержащих нужный ген, будь то в дикого типа, конститутивно активным или доминирующей негативной форме, которые затем последовательно клонировали в вектор pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Этот вектор (содержащий интересующий ген), ЦМВ промотор донора (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) и 2K7 lentivector объединены в ферментативной реакции с получением 2K7 вектор, содержащий промотор CMV, интересующий ген, Внутренняя рибосомальной сайт вход и GFP (рис 1). Этот шлюз клонировали 2K7 конструкция в сочетании с вирусной оболочки PMD2.G и вирус пакета pBR8.91 могут быть совместно трансфицировали в клетки HEK293T генерировать лентивирус, которые впоследствии могут быть использованы для трансдукции OPCs. После заражения с лентивирусов в OPCs выражают высокий уровень белка, представляющего интерес. Эти OPCs затем могут быть посеяны на DRG нейронов культур и эффект, что экспрессиявысоких уровней нужного белка оказывает на миелинизации может быть допрошен. Со-культуры оценивали на экспрессию белка миелина с помощью Вестерн-блот-анализа и визуализировали для формирования миелиновых аксонов сегментов по иммуногистохимии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные, используемые в данном исследовании были смешанного пола и вырос на животных в Департаменте средств анатомии и патологии и Florey Института неврологии и исследований в области психического здоровья в Университете Мельбурна. Все процедуры на животных были одобрены комитетами по экспериментам на животных этики в университете Мельбурна.
1. Клонирование 2K7 Lentivector
- Перед клонированием интересующий ген в вектор 2K7 лентивирусов, субклонирования гена в вектор pENTR (3637 п.н., устойчивых к канамицину) с использованием стандартных методов молекулярной 11. Используйте сайты рестрикции EcoRI и SacII для субклонирования.
- Усиление 2K7 Lentivector
- Преобразование 2K7 lentivector ДНК путем осторожного перемешивания 100 нг плазмидной ДНК с компетентных клеток и инкубируют на льду в течение 30 мин.
- Тепловой удар ДНК / компетентные клетки смешивают при 42 ° С в течение 90 сек и пластины их на LB-чашки с агаром, содержащих как ampiciОИСДП (100 мкг / мл) и хлорамфеникол (15 мкг / мл) при 37 ° С в течение 16-18 ч.
Примечание: хлорамфеникол используется для предотвращения рекомбинации между длинных концевых повторов. - На следующий день, растут выбран бактериальных клонов в LB среде, содержащей как ампициллин (100 мкг / мл) и хлорамфеникол (15 мкг / мл) при 37 ° С в течение 16-18 ч. Извлечение ДНК с использованием коммерческого ДНК плазмиды Maxiprep комплект в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Sub-клонирование от pENTR вектора к 2K7 Lentivector (Рисунок 1)
Рисунок 1:. Схематическое изображение процесса рекомбинации шлюза интерес ген, представленный здесь, как флаг-Erk1, клонировали в вектор pENTR L1-L2. Это будет добавлен в вектор pENTR L4-R1, содержащего промотор CMV и вектор основой 2K7. Эти три вектора рекомбинации по LR Clonase II Plus ферментавставить ген интересов, и промотор в вирусную готовые 2K7 вектора.- Добавить следование 1,5 мл трубки и аккуратно перемешать:
L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (промоутер) (60 BNG) 1-2.5 мкл
L1-L2 pENTR4IRES2GFP (с интересующего гена) (80 Bng) 1-2.5 мкл
K7 lentivector (80 нг / мкл) 1 мкл
ТЕ-буфера, рН 82-5 мкл
Всего 8 мкл - Удалить Clonase смеси ферментов от -80 & deg; С и оттаивают на льду в течение 2 мин. Убедитесь, что этот фермент является свежей аликвоты от -80 & deg; С, как фермент существенно снижается эффективность клонирования с повторными циклами замораживания-оттаивания
- Добавить 2 мкл фермента на реакцию и хорошо перемешать с помощью вихря и инкубировать Clonase реакционной смеси при 23-25 ° С в течение 6-24 ч.
- Добавить 1 мкл протеиназы К раствору (поставляется с комплектом фермента) к реакционной смеси Clonase и инкубировать в течение 10 мин при 37 ° С.
- Преобразование Clonase реакционной смеси в компетентные клетки и расти выберитеколонии в LB среде, содержащей ампициллин (100 мкг / мл) при 37 ° С в течение 16-18 ч.
- Извлечение и очистить ДНК с использованием коммерческого ДНК плазмиды Miniprep комплект в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Подтвердите ДНК с помощью пищеварения с помощью ферментов рестрикции Spe I и Sac II и соответствующий буфер в соответствии с инструкцией завода-изготовителя, чтобы удалить фрагмент, содержащий промотор и ген интереса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен, чтобы проверить, если субклонирован ДНК имеет правильный ген вставки интересов с правого вектора позвоночника. Размер самого вектора без вставленного фрагмента в 6,7 кб. Размер выпущенного вставленного фрагмента включает в себя как промотор и ген вставки интереса. Рассчитать ожидаемый размер фрагмента из дайджеста для конкретного гена с помощью программы редактирования последовательности ДНК, например, APE - плазмида, редактор. - Проверьте размеры как ДНК вектора позвоночника и отпущенной фрагмента, выполнив 1% агарозном гелев 1x TAE буфер (см таблицу исходных растворов) в 100 В.
- Amplify подтвержденный ДНК путем выращивания бактерий в 500 мл LB среде, содержащей ампициллин (100 мкг / мл) при 37 ° С в течение 16-18 ч.
- Извлечение и очистить ДНК с использованием коммерческого ДНК плазмиды Maxiprep комплект в соответствии с инструкциями изготовителя.
Примечание: Maxiprep обычно создает достаточное количество ДНК, необходимое для продуцирования вирусов.
- Добавить следование 1,5 мл трубки и аккуратно перемешать:
- Повторите шаги 1.3.9-1.3.10, чтобы усилить следующие ДНК для лентивирусных препаратов: конверт вектор (PMD2.G, 6,1 кб), пакет вектор (pBR8.91, 12,5 КБ), и пустой Lentiviral вектор в качестве контроля (GFP -CMV-2K7, 8,7 кб).
2. 2K7 Вирус Производство
ПРИМЕЧАНИЕ: День 1:
- В день трансфекции, плиты 32000000 HEK293 Т-клеток в Т175 колбу, содержащую 25 мл Т-клеток НЕК293 носитель (смотри таблицу исходных растворов). Кроме того, пластина 16 миллионов клеток деньдо трансфекции, если время работает плотно в день трансфекции.
Примечание: трансфекции может быть с равным успехом путем посева клеток на день трансфекции или до дня. С помощью одного из двух альтернативных вариантов, критическая точка здесь, чтобы убедиться, что клетки застрял вниз на блюдо культуры поверхности до трансфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: День 2: - Трансфекция
- До трансфекции, разбавленной ДНК 1 мкг / мкл в буфере ТЕ, которые содержат 10 мМ Трис, рН 8, 1 мМ ЭДТА, рН 8 в деионизированной воде.
- В 50 мл пробирку, подготовить основной смеси (таблица 1) для трансфекции в колбе Т175. Добавить ДНК подогретого Игла в модификации Дульбекко (DMEM) и хорошо перемешать вихря, а затем добавить стерильную полиэтиленимин (PEI) (смотри таблицу исходных растворов), чтобы избежать преждевременного осаждения.
Таблица 1: Подготовка трансфекции смесь для 2K7 Касперского.Вектор Чонг> Концентрация Объем pMDG.2 1 мкг / мкл 5 мкл pBR8.91 1 мкг / мкл 15 мкл 2K7 вектор с GFP + интересующего гена 1 мкг / мкл 22 мкл Стерильные полиэтиленимина (ПЭИ) 1 г / л 500 мкл DMEM 2100 мкл - Хорошо перемешать путем обращения трубку 3-4x и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре (RT).
- Выполнение полного изменения медиа на HEK293T клеток. Аспирируйте от культуральной среды из клеток полностью и кормить подогретым HEK293T среды для культивирования клеток (25 мл на Т175 колбу).
- Добавить трансфекции смесь (ДНК / PEI смеси) по каплям к клеток монослоя. Перемещение осторожно, чтобы хорошо перемешать и инкубировать трансфицированные клетки при 37 ° С, 5% СО 2 в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: День 3: - Для обеспечения трансфекции успешно, проверить выражение GFP 24 ч после трансфекции с помощью флуоресцентной микроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более 50% клеток, экспрессирующих GFP, как правило, указывает на хорошую трансфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: День 4: - В 48 ч после трансфекции, собирать вирусный супернатант и заменить свежими HEK293 Т СМИ (25 мл на Т175 колбу).
- Центрифуга вирусной супернатант в 1140 х г в течение 10 мин при 4 ° С для очистки клеточного дебриса от супернатант. Передача очищены супернатанта к 50 мл пробирку и хранят при температуре 4 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: День 5:
- Центрифуга вирусной супернатант в 1140 х г в течение 10 мин при 4 ° С для очистки клеточного дебриса от супернатант. Передача очищены супернатанта к 50 мл пробирку и хранят при температуре 4 ° С.
- В 72 ч после трансфекции, собирают вторую партию вирусной супернатант. Повторите шаг 2.3.1 и бассейн 48 и 72 ч очищается супернатантами.
- Для концентрации вируса, вирусный супернатант центрифуги в 170000 х г в течение 90 мин при 4 ° С с использованием 30 мл Ультрацентрифуга трубки.
- Жидкость над осадком сливают и повторить шаг 2,6, пока все очищены супернатант был центрифугировали оставляя (невидимый) гранул вируса плюс осаждают PEI в базе трубки.
- Ресуспендировать вирус, добавить 500 мкл SATO СМИ (см таблицу исходных растворов), чтобы ультрацентрифуга труб. Vortex в течение 30 секунд аго очистить основание трубки с наконечником пипетки механически ослабить вирус. Повторите этот шаг 6x для того, чтобы потерять вирусной гранулы.
- Бассейн Ресуспендированный вирус в микропробирок и вращаются очень кратко для удаления нерастворимого PEI. Фильтр супернатанта через 0,45 мкм фильтр для удаления белков.
- Алиготе вирус в 20 мкл, 50 мкл и 100 мкл аликвоты и хранят при -80 ° С.
3. Определение титра вируса в клетках HEK293T
- Чтобы проверить экспрессию интересующего белка и определить оптимальную концентрацию вируса для экспериментов, добавить серию последовательных разведений вируса наличии (например, 0, 5, 10, 20, 40, 80 мкл) в трансдукции Т-клеток НЕК293 высевают в 6-луночные планшеты, и культуры в течение 24 часов при 37 ° С, 5% СО 2. Этот протокол, как правило, формирует вирус, который может быть использован в концентрациях от 1:50 до 1: 200, что достичь надежной экспрессии геназаинтересованность.
- 48 часов после вирусной трансдукции, лизируют клетки HEK293T в TNE буфера (см таблицу маточного раствора) с ингибиторами протеазы.
- Промыть лунки дважды охлажденной DPBS и затем добавить 150 мкл буфера ТНЭ в каждую лунку.
- LYSE клетки с помощью пипетки вверх и вниз 5-10 раз. Передача лизаты клеток в 1,5 мл микроцентрифужных трубки и инкубировать на льду в течение 15-30 мин.
- Центрифуга лизаты при 4 ° С в течение 30 мин при максимальной скорости (20000 х г) и передачи сбрасывается супернатант в чистую пробирку для определения белка по Bradford и последующего Вестерн-блоттинга.
- Определение уровня экспрессии интересующего белка с помощью стандартных Вестерн-блот-анализа в то время зондирования антител против самого белка и плавленого тега (т.е., флаг). Используйте вирусный разведения, который дает> 95% GFP + клеток и сильную экспрессию белка интереса для экспериментов.
4. Выделение и культивирование DRG, (Figure 2 шаги 1 и 2)
Рисунок 2:. Принципиальная схема в пробирке миелинизации нейронов DRG анализа расчленены из P2-3 крысят, затем очищают и культивированных в течение двух недель (1-2). OPCs очищают от крыс мозга P7-9 использованием immunopanning (3). OPCs затем инфицировали лентивирусов и культивировали в течение 48 ч (4). OPCs затем высевали на DRG, и любые факторы роста, такие как интерес BDNF добавляют (5). Со-культуры затем культивировали в течение 2 недель, чтобы позволить OPCs дифференцировать и myelinate аксоны (6). И, наконец, со-культуры либо лизируют для вестерн-блоттинга или фиксированной для иммуногистохимии (7).ПРИМЕЧАНИЕ: День 1 2 дня до вскрытия:
<ол> - Шерсть в автоклаве 22 мм х 22 мм покровные с поли-L-орнитин (0,5 мг / мл) в 6-луночный планшет, и инкубируют при 37 ° С в течение ночи.
- На следующий день, пальто покровные снова ламинином (20 мкг / мл в MEM) при 37 ° С в течение ночи, аспирация лишнюю и сухой в течение 20 минут в капот культуры ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: День 2: Вскрытие и изоляции ДРГ: - Жертва P2-P3 крысята 12x шейным перерезки.
- Удалить кожу, покрывающий мышцы от задней части животного. Используйте Vännäs ножницы, чтобы открыть позвонков отверстия и использовать пинцет, чтобы аккуратно выкопать спинного мозга.
- Выклюй ДРГ, которые лежат между позвоночнику и отрезать прикрепленные спинного нервных волокон, а затем поместить ДРГ в блюдо 33 мм Петри, содержащую 3 мл L-15 средств массовой информации. Это, как правило, можно собрать от 8 до 12 DRG с каждой стороны спинного мозга
- Передача собраны DRGs наряду с L-15 средств массовой информации в 15 мл трубки, центрифуге при 180 мкг в течение 5 мин.
- Придыхательныйсупернатант, добавить 2 мл 0,25% трипсина в DRG гранулы и инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин.
- Добавляют 5 мл среды М1 (табл исходного раствора) к DRG гранул, чтобы остановить трипсина и центрифуге при 180 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Отберите супернатант, вновь приостановить осадок в 2 мл подогретого среды М1 (не с факторами роста). Растирают ганглиев гранул с помощью пипетки 50x или до ганглии рассеяны. Центрифуга клеточной суспензии при 180 мкг в течение 3 мин.
- Ресуспендируют диссоциируют нейроны в M1 сред и пластины вниз в 6-луночный планшет в 5 ганглиев на 100 мкл на лунку.
- Для удаления пролиферирующих без нервных клеток, после как минимум 4 ч инкубации для облегчения присоединения, снимите M1 СМИ и кормить нейроны М2 СМИ (см таблицу маточного раствора). Культура DRG нейроны в присутствии NGF (100 нг / мл), чтобы очистить культуры ФРН-зависимых TrkA экспрессирующих DRG,. Кроме того, использование BDNF (100 нг / мл), чтобы очистить BDNF-зависимого TrkB-Expresпеть ДРГ.
- Поддержание нейронов в М1 СМИ (+ NGF или BDNF на 100 нг / мл), чередующиеся с антимитотическую М2 СМИ в течение 2 недель, как показано ниже.
- Поддержание среды M1 (+ NGF или BDNF на 100 нг / мл) в дни: 4-6, 8-10, 12-14 и М2 носитель (+ NGF или BDNF на 100 нг / мл) с FDU и уридин в дни 1, чтобы 4, 6-8, и 10-12. Минимум 3 циклов очистки M2 медиа требуется.
- Поддержание DRGs в M1 в покое еще на одну неделю после завершения 2 недели антимитотической цикл. Изменить M1 СМИ каждые 2-3 дня.
5. Выделение и культивирование OPCs (рис 2 шаг 3)
ПРИМЕЧАНИЕ: День 1 2 дня до вскрытия:
- Coat 10 см ткани культуральные планшеты с поли-D-лизина (PDL, 10 мкг / мл в стерилизованной деионизированной воды) при 4 ° С в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: День 2: 1 день до вскрытия: - Вымойте PDL пластины стерильной деионизированной воды для 3x. Дайте высохнуть в течение ~ 6 ч в капот культуры ткани. Если не используется сразу, оберните и магазиндо 4 недель при 4 ° С.
- Подготовка пластин вторичных антител для immunopanning. Для 1 мозга вскрытия, подготовки 2x IgG пластинок (для RAN2 антитела, чтобы удалить астроцитов и О1 антитела, чтобы удалить premyelinating олигодендроцитов), с 45 мкл Козье α мыши IgG в DPBS (15 мл) в 10 см чашки Петри; 1x IgM пластина для (O4 антитела для выбора клетки-предшественники олигодендроцитов), 45 мкл Козье α мыши IgM в DPBS (15 мл) в 10 см чашки Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: День 3: день вскрытия: - Добавить 200 единиц папаина в 10 мл буфера папаина (таблица 2), и нагревают до при 37 ° С, пока буфер не станет прозрачной.
Таблица 2: Получение папаина буфера.Концентрация 250 мл Конечная концентрация EBSS акции 10x 25 мл 1x MgSO 4 100 мМ 2,5 мл 1 мм Глюкоза 30% 3 мл 0,46% ЭГТА 0,5 М 1 мл 2 мм NaHCO 3 1 М 6,5 мл 26 мм Доведите объем до 250 мл с помощью деионизированной воды и фильтра стерилизуют - Вымойте все тарелки вторичные антитела с DPBS для 3x.
- Вылейте RAN2 и O1 антитела на пластинах IgG и O4 гибридомы к IgM пластины. Инкубируйте все эти пластины первичного антитела в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Проанализируйте один мозг от P7 крысы. Обезглавить щенка с заостренными ножницами и удалить кожа, покрывающая череп с ножницами.
- Сокращение вокруг черепа, затылочной доли, височной доли и лобной доли. Удалить мозг от черепа с помощью щипцов и аккуратно перенести его на 35-мм чашки Петри с 1 мл DPBS.
- Нарезать мозг на мелкие кусочки примерно с ножницами или стерильной лезвия.
- Фильтр предварительно нагревают папаин буфера (10 мл) в новую пробирку, содержащую 15 мл несколько зерен L-цистеина, затем добавить 200 мкл ДНКазы (12500 ЕД / мл) в буфере фильтровали папаина.
- Вылейте папаин буфер на нарезанные кубиками тканях мозга; инкубировать при 37 ° С в течение 90 мин.
- Gentlly передачи диссоциируют ткани головного мозга в 50 мл пробирку с использованием 25 мл пипетки идают отстояться.
- Удалить папаин буфер, добавьте 2 мл Lo Ово (Овомукоид) к тканям мозга и titurate в 5-10 раз с помощью пипетки, чтобы разбить куски тканей головного мозга, дают отстояться и снимите верхнюю 2 мл супернатанта в новую пробирку.
- Добавить еще 2 мл Lo ово к тканям мозга и повторите шаг 5,11 до исчезновения куски ткани не останется. Tituration можете получить более агрессивным.
- Центрифуга диссоциированных клеток суспензии в течение 15 мин при 200 х г. Аспирируйте от супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл Hi Ово и центрифуги в течение 15 мин при 200 х г.
- Вымойте первый immunopanning пластину (Ran 2 пластины) с DPBS для 3x. Аспирируйте супернатант, ресуспендирования клеток в 10 мл буфера панорамирования (таблица 2) и залить на первом immunopanning пластины (RAN 2 пластины). Инкубируйте клетки в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Вымойте второй immunopanning пластину (O1 планшета) DPBS для 3x.
- После инкубации в первый immunopanning пластины, наконечник клеточной суспензии на второйimmunopanning пластина (пластины О1), промыть любые свободные клетки с поверхности пластины с 1-3 мл буфера панорамирования и передачи с помощью пипетки на O1 пластины. Инкубируйте клетки в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Вымойте третий immunopanning пластину (O4 пластины). Эта пластина является позитивной селекции пластины, где OPCs связать его поверхность. Вымойте O4 тарелку с DPBS для 3x.
- После инкубации на второй immunopanning пластины, передать клеток до конечного immunopanning пластины (пластины) О4, инкубировать клетки в течение 45 мин при комнатной температуре. Этот шаг будет выбрать O4 + OPCs.
- Аспирируйте супернатант из последнего immunopanning пластины (O4 пластины) и промойте пластину с EBSS для 6х.
- Чтобы удалить OPCs от пластины, инкубировать клетки с 5 мл теплого 0,05% трипсин-ЭДТА разводили 1:10 в EBSS при 37 ° С в течение 8 мин.
- Добавляют 5 мл 30% FBS (сделано в EBSS) для нейтрализации трипсина. Удалить клетки с поверхности пластины с помощью пипетки в течение примерно 50 раз.
- Перенесите все клеткиСуспензию в новую пробирку и центрифугируют в течение 15 мин при 200 х г.
- Удалите супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл предварительно нагретой САТО медиа с последующим подсчетом клеток. Вскрытие один мозг может дать 1,5-2 млн OPCs.
- Пластина клеток на сухих пластин, покрытых PDL при плотности между 1 х 10 5 и 5 × 10 5 на 10 см пластины с в средах САТО (10 мл), содержащие цилиарного нейротрофического фактора (CNTF, 10 нг / мл), тромбоцитарный фактор роста (PDGF, 10 нг / мл,), нейротрофина 3 (NT3, 1 нг / мл), и форсколин (4,2 мкг / мл) 2,12. Культура OPCs при 37 ° С, 8% СО 2.
6. преобразующие OPCs
- Культура первичные OPCs в САТО сред (10 мл / 10 см пластины) с CNTF (10 нг / мл), PDGF (10 нг / мл), NT3 (1 нг / мл), и форсколином (4,2 мкг / мл) при 37 ° С, 8% СО 2 в течение 24 ч после вскрытия.
- Полностью аспирации и выключение OPC питательных сред, кормить клетки с свежеприготовленной SATO СМИ (10 мл) С факторами роста (см выше в пункте 6.1).
- Добавить вируса к OPCs в оптимальной концентрации, определенной стадии 3 (фиг 2, стадия 4), культура OPCs еще в течение 48 ч.
7. OPC заполнение для Myelinating сокультурах (рис 2, пункты 5 и 6)
- Чтобы удалить OPCs от поверхности, Вначале промыть OPC пластины с 8 мл EBSS дважды, затем инкубировать клетки с 5 мл теплой 0,05% трипсина-EDTA разбавляют 1:10 EBSS при 37 ° С в течение 2 мин.
- Нейтрализовать трипсина с 30% FBS в EBSS (5 мл) и удаления ячеек из пластины с помощью пипетки. Передача клеточной суспензии в 15 мл пробирку, центрифугируют при 180 х г в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Отберите у супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл подогретого SATO СМИ с последующим подсчетом клеток.
- До OPC посева, полностью аспирации СМИ от DRG культуры пластины. Аккуратно семян 200000 OPCs каплям на ГВС нейронов, как описано выше 4-6.
ПРИМЕЧАНИЕ:Общий объем ОРС посева должна быть меньше 200 мкл на 22 мм покровным. - Оставить клеток, чтобы без перемещения пластины в течение 10 мин в капот культуры ткани, затем осторожно долить 1 мл подогретого SATO среды на лунку.
- Replate оставшиеся сестры OPCs с SATO СМИ с факторами роста (см шаг 6,1). Используйте эти сестра OPCs проверить экспрессию белка интереса.
- После 24 часов, замените СМИ SATO с со-культуральной среды (2 мл / лунку), содержащие SATO СМИ (без факторы) и Neurobasal (v / v) с 1% B27. Поддерживать совместные культуры в течение 14 дней с изменением среды каждые 2-3 дня.
- Оценка совместного культивировани миелин для экспрессии белка с помощью Вестерн-блот-анализа и визуализации для формирования миелиновых аксонов сегментов, дважды иммунного окрашивания с антителами против миелинового основного белка маркеров и нейрональных маркеров 4-6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Флаг-меченый внеклеточного сигнала, связанных киназы 1 (Флаг-Erk1) используются в качестве конструкции для производства лентивирусов проверяется ферментом рестрикции переварить из конструкций, используемых, в том числе оба 2K7 конструкции и упаковки и вспомогательных конструкций, необходимых для производства вирусов (фигура 3) ,
Рисунок 3: конструкция ДНК проверка. Все конструкции ДНК, необходимые для лентивирусом производства были очищены от Stbl3 бактерий и проверяется рестриктазы дайджеста. Вспомогательные и упаковочные векторы расщепляли NcoI и EcoRI, как указано, и по сравнению с режиссерский плазмиды (A). 2K7-GFP был усвоен SpeI и SacII (A). 2K7-Flag-Erk1 ДНК была проверена путем гидролиза или с SpeI или SacII в одиночку, или с помощью двойного сборника (B). Набора полос былипо сравнению с ожидаемыми моделей, полученных от виртуального переваривания построить последовательностей с использованием APE программного обеспечения.
Для определения оптимального разведения для использования на OPCs, Эрк 1 лентивирус титруют HEK293T клеток (рисунок 4). Это было сделано путем добавления спектр вирусных разведений в HEK293T клеток (фиг.4А, 4С, 4D и) или OPCs (фиг.4В). Уровни экспрессии гена интересов, увеличиваются со временем (рис 4D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: Титрование вируса Flag-erK1 в HEK293T клеток и OPCs. Вирус Флаг-Erk1 титровали в клетках HEK293T (А, С, D) или OPCs (В), HEK293T клетки (а) или OPCs (B) были обследованы на экспрессию GFP 48 ч после инфицирования вирусом Флаг-ERK1. Клеточные лизаты HEK293T зондировали на присутствие Erk1 или общей ERK1 / 2 после 48 ч инфекции (C). Лизаты HEK293T клеток исследовали на наличие флага, ERK1 / 2 и актина в качестве контроля нагрузки либо 48 ч или 96 ч после инфекции с флагом-Erk1 вируса (D). Эти пятна были все уничтожены и отображаемого вместе, чтобы облегчить прямое сравнение уровней экспрессии в двух временных точках (D). Масштабная линейка для (A) = 100 мкм. Масштабная линейка для (B) = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
После того, как оптимальная разбавления вируса было определено, очищенные OPCs были инфицированы и культивированы в течение минимум 48 ч, чтобы выражение трансгена, чтобы достичь SuffУровни циент, то высевали DRG нейронов, чтобы оценить их миелинизации потенциал (рисунок 5). После высевали DRG нейроны, OPCs будет дифференцироваться в олигодендроциты и начинают экспрессировать белков миелина, которые могут быть оценены с помощью Вестерн-блоттинга (фиг 5С). Некоторые зрелые олигодендроциты будет myelinate, и это может быть визуализированы с помощью МВР окрашивания (фиг 5D). Аксоны также должны быть окрашены с маркером, таким как нейрофиламентов или βIII-тубулина (рис 5D), чтобы обеспечить плотность аксонов учитывается при анализе уровней миелинизации.
Рисунок 5: OPCs были инфицированы вирусом Флаг-ERK1 в течение 48 ч перед посевом на DRG нейроны. Сестринские OPCs были либо фиксировали и окрашивали для флага и GFP (А) или лизируют и зондировали для флага и Erk1 проверкиВыражение вирус-сверхэкспрессируется белка (С). Со-культуры фиксировали через 2 недели в культуре и окрашивают в течение βIII-тубулина и ПМБ, с целью визуализации DRG аксоны и myelinating, а также не-myelinating олигодендроцитах (B). Myelinating олигодендроцит указано стрелкой и без myelinating олигодендроцитов указано стрелкой головки (B). Параллельные со-культуры лизировали и зондировали на миелиновых белков MBP и MAG, а также флаг и ERK1 / 2, чтобы подтвердить экспрессию трансгена в совместной культуре (D). Повышение уровня erK1 не было видно в совместной культуре из-за большого количества DRG-производных Erk1, присутствующих в лизаты масштабную линейку = 20 мкм.
| Имя | Ингредиенты | Примечания |
| ТЕ-буфера рН 8 | 10 мМ Трис рН 8 1 мМ ЭДТА, рН 8 | Макияж в деионизированной воде. |
| Полиэтиленимина (ПЭИ) | 1 г / л | Макияж в деионизированной воде, фильтр-стерилизовать и хранить запасы при температуре -20 ° C. |
| LB Средний | 20 г Триптон 10 г Дрожжевой экстракт 10 г NaCl | Сделайте до 2 л деионизированной воды |
| 50% глицерине | Глицерин | Сделать с равным объемом деионизированной воды и автоклав |
| НЕК среднего 293 Т-клеток | DMEM 10% фетальной бычьей сыворотки 1% пенициллина / стрептомицина 1% L-глутамина | |
| TNE буфера для лизиса | 10 мМ Трис рН 8 150 мМ NaCl 1 мМ ЭДТА, рН 8 1% NP40 | Растворить NP40 в меньшем объеме деионизированной воды сначала будет кристаллизоваться при контакте с водой. Сделать до конечного объема в деионизированной воде |
| M1 | MEM 10% фетальной бычьей сыворотки 0,4% D-глюкозы 2 нМ L-глутамата 1% пенициллина / стрептомицина | Для использования с крысой DRG нейронов |
| ММ1 | Neurobasal среднего 2% B27 (SM1) дополнение 0,4% D-глюкозы 2 нМ L-глутамата 1% пенициллина / стрептомицина | Для использования с мышь DRG нейронов |
| M2 | DMEM 10 мг / л трансферрина 5 мг / л инсулина 20 нМ прогестерона 100 мкМ Путресцин 10 мкМ Fdu 10 мкМ Уридин | Макияж м2 в большем объеме DMEM без Fdu и уридину для использования в течение 1-2 месяцев. Добавить Fdu и уридин в меньших объемах, которые могут быть завершены в течение 2 недель |
| мм2 | ММ1 10 мкМ Fdu 10 мкМ Уридин | Добавить Fdu и уридин в меньших объемах среды, которые могут быть завершены в течение 2 недель. |
| 10x MT-PBS pH 7,4 | 28.48 г / л (160 мм) Na 2 HPO 4 · 2H 2 O 5,52 г / л (40 мМ) NaH 2 PO 4 · H 2 O 87.66 г / л (1,5 М) NaCl | Добавить в деионизированной воды и доведения рН до 7,4 с помощью 10 N NaOH |
| 1x MT-PBS | 10x MT-PBS Деионизированная вода | Развести 10x MT-PBS 1:10 в деионизированной воде, чтобы сделать 1x МТ-PBS |
| 10x Борат буфера (1,5 М) | 18.55 г борной кислоты 1x MT-PBS | Растворите борной кислоты в 150 мл 1x MT-PBS. Доведения рН до 8,56 с помощью 10 N NaOH и довести конечный объем до 200 мл с 1x МТ-PBS. Автоклав |
| 1x боратного буфера (0,15 М) | 10x Борат буфер 1x MT-PBS | Подготовьте 100 мл этого буфера для растворения PLN. Добавить 10 мл 10х боратного буфера (рН 8,56) до 90 мл 1х МТ-PBS |
| 0,5 мг / мл поли-L-орнитин (PLN) | 50мг поли-L-орнитин гидробромид 0,15 М боратного буфера (рН 8,56) | Растворите 50 мг поли-L-орнитин гидробромида в 100 мл боратного буфера 1x. Фильтр стерилизуют (0,22 мкм фильтр) и хранят при температуре 4 ° С на срок до одного месяца |
| 100x поли-D-лизина (PDL) | 5 мг поли-D-лизином Стерильный, деионизированная вода | Запасы 100x PDL могут быть заморожены при температуре -20 ° С в одноразовых аликвоты. После использования, разбавленной до 1 раза в стерильной деионизированной воде |
| Папаин буфер | Смотрите таблицу 2 | |
| ДНКазы | 12500 U ДНКазы I 1 мл EBSS | На льду, растворить ДНКазы I в 1 мл охлажденного EBSS. Аликвоту (например, 300 мкл / пробирка) и заморозить в течение ночи при -20 ° С. Хранить при -20 ° С. |
| 4% БСА | 8 г BSA 200 мл DPBS | Растворить BSA в 150 мл DPBS при 37 ° С. Доводят рН до 7,4 с ~1 мл 1 N NaOH. Довести объем до 200 мл. Фильтруют через фильтр 0,22 мкм для стерилизации. Сделайте 1 мл аликвоты и хранят при температуре -20 ° C. |
| 10x Lo Овомукоид | 3 г BSA 200 мл DPBS 3 г ингибитора трипсина | Добавить BSA 150 мл DPBS и хорошо перемешать. Добавить ингибитора трипсина и перемешивают до растворения. Добавить ~ 1 мл 1 N NaOH, чтобы довести рН до 7,4. Довести объем до 200 мл с DPBS. Фильтр-стерилизовать через фильтр 0,22 мкм. Сделайте 1 мл аликвоты и хранят при температуре -20 ° C. |
| 6x Привет Овомукоид | 6 г BSA 200 мл DPBS 6 г ингибитора трипсина | Добавить BSA 150 мл DPBS и хорошо перемешать. Добавить ингибитора трипсина и перемешивают до растворения. Добавить ~ 1 мл 1N NaOH, чтобы довести рН до 7,4. Довести объем до 200 мл с DPBS. Фильтр-стерилизовать через фильтр 0,22 мкм. Сделайте 1 м аликвоты и хранят при температуре -20 ° C. |
| SATO база | Смотрите таблицу 3 | |
| SATO СМИ (крыса) | 1% SATO база 1% пенициллина / стрептомицина 1% 0,5 мг / мл инсулина 1% L-глутамина 0,1% НАК 0,1% Биотин Макияж с DMEM и фильтра стерилизуют. | |
| SATO СМИ (мышь) | 1% SATO база 1% 0,5 мг / мл инсулина 1% пенициллина / стрептомицина 1% L-глутамина 0,1% НАК 0,1% Биотин 0,1% Микроэлементы B 2% B27 Макияж с DMEM и фильтра стерилизуют. | |
| Инсулин | 10 мг Инсулин 20 мл стерильной deionzed воды | Добавить инсулин деионизированной воды и добавить 100 мкл 1 N HCl, чтобы растворить инсулин. Все хорошо перемешать. Фильтруют через фильтр и хранят 0,22 мкм при 4 ° С в течение 4-6 недель |
| НАК (N-ацетил-L-цистеин) | 5 мг / мл НАК DMEM | Растворите NAC в DMEM сделать 5 мг/ Мл раствора, аликвоту и хранить при -20 ° С. |
| d-биотин | 50 мкг / мл биотина Стерильный, деионизированная вода | Растворить в воде биотин, чтобы сделать 50 мкг / мл раствора, аликвоту и хранят при -20 ° С. |
| CNTF (цилиарного нейротрофического фактора) | 10 мкг / мл CNTF 0,2% БСА в DPBS | Развести CNTF, чтобы сделать раствор 10 мкг / мл стерильного 0,2% БСА в DPBS. Аликвоты, флэш-замораживание в жидком азоте и хранят при -80 ° С. |
| PDGF (тромбоцитарный фактор роста) | 10 мкг / мл PDGF 0,2% БСА в DPBS | Развести PDGF мастер запас (подготовленный в соответствии с инструкциями изготовителя) до 10 мкг / мл стерильной 0,2% BSA в DPBS. Аликвоты, флэш-замораживание в жидком азоте и хранят при -80 ° С. |
| NT3 (Нейротрофин-3) | 1 мкг / мл NT-3 0,2% БСА в DPBS | Развести NT3 мастер STOCK (полученного в соответствии с инструкциями производителя) с 1 мкг / мл стерильной 0,2% БСА в DPBS. Аликвоты, флэш-замораживание в жидком азоте и хранят при -80 ° С. |
| Форсколин | 50 мг Форсколин Стерильный ДМСО | Добавить 1 мл стерильной ДМСО в 50 мг бутылку форсколином и хорошо перемешать, чтобы полностью ресуспендирования. Переход к 15 мл пробирку и добавить 11 мл стерильной ДМСО, чтобы достичь концентрации 4,2 мг / мл. Аликвоты и хранить при -20 ° С. |
Таблица 3. Исходные растворы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Миелинизации аксонов важный процесс для оптимального функционирования как центральных, так и периферической нервной системы позвоночных. Производство и техническое обслуживание миелиновых аксонов является сложным и скоординированный процесс с участием молекулярных взаимодействий между нейронов, глиальных (от шванновских клеток или олигодендроциты) и внеклеточного матрикса белков. Значение и применимость этого протокола является то, что она позволяет манипулировать белков в одном конкретном типе клеток в смешанных установках со-культуры. Как несколько типов клеток участвуют в миелинизации и в естественных условиях и в экстракорпорального миелинизации анализа, с помощью тупой фармакологические инструменты, чтобы блокировать активность определенных белков или сигнальные пути не может содержать конкретную информацию о влиянии, что белки оказывают на миелинизации либо из нейронов или глиальных в перспективе, если белок не однозначно выражается одним типом клеток. Таким образом, миелинизации в пробирке, какговорят, в сочетании с использованием Лентивирус специально трансдукции OPCs позволяет допросить эффекты, которые олигодендроглиальным белки оказывают на миелинизации. Мы успешно использовали 2K7 Лентивирус что экспрессия определенных белков в частности, в олигодендроциты для в пробирке миелинизации анализа с целью расчленения эффект, который олигодендроглиальным сигналы оказывать на ЦНС миелинизации 9.
Для получения воспроизводимых результатов в трансдуцированной OPC в пробирке миелинизации анализа, оптимизации, необходимые для каждого шага протокола от клонирования через вскрытий и OPC посева. Очень важно, чтобы на уровне ДНК, вектор pENTR содержащий маркированный интерес ген конструкции секвенируют и 2K7 ДНК с меченой интересующего гена проверяют вестерн-блоттинга экспрессии тега и интересующего гена, Перед использованием ДНК для создания вируса. Важно выбрать либо HEK293Tcells или HEK293FT-клетки, чтобы генерировать вирус и расти в свободной среде микоплазмы. После получения лентивирус важно титровать каждую партию вируса, чтобы определить оптимальную разбавление для использования на OPCs. Это может быть сделано путем добавления спектр вирусных разведений в клетках HEK293T или OPCs. Как 2K7 конструкция содержит как ген интересов, и GFP, эффективность трансдукции могут быть оценены по экспрессии GFP при помощи флуоресцентной микроскопии и путем анализа экспрессии теги и интерес ген вестерн-блот анализа. Яркие GFP + клетки станут видимыми с более высокими концентрациями вируса, так как это возможность для нескольких вирусных частиц, чтобы заразить одну ячейку. Проверка экспрессии GFP с помощью флуоресцентной микроскопии является полезным показателем титра вируса и экспрессии GFP, но не могут быть использованы в качестве суррогата проверки экспрессии интересующего белка. Поэтому очень важно, чтобы проверить уровень экспрессии интересующего белка в обоих клетках HEK293Tи OPCs вестерн-блот анализа. Если интерес белок выразил эндогенно нейронов в совместных культурах, избыточная экспрессия по OPCS / ВЛ могут маскироваться при анализе совместного культивирования лизата блоте; Таким образом, важно, чтобы либо пометить интерес белка или культуры сестры OPCs следующий посева, так экспрессия белка интерес может быть проверена в братских OPCs если не в совместной культуре.
Качество как DRG и OPC культуры непосредственно определяет если эксперименты успешно. В настройках совместного культивирования, DRG нейроны крыс может быть культивировали с OPCs, получаемый из крысы или мыши. OPCs требуют нежный и быстрое управление. Важно оптимизировать титра вируса по OPCs как слишком мало не может эффективно преобразовывать по OPCs, ведущие к низким уровнем экспрессии белка, представляющего интерес, и слишком много вируса является токсичным для OPCs так что слишком мало, чтобы отобрать клетки на нейронах. Оба этих Субоптимальная трансдукции может Расулат в не поддающейся анализу или незначительных изменений в экспрессии белка миелинизации или миелина. OPCs дифференцировать если они становятся более сливной и не может быть заполнена после того как они дифференцируются, таким образом, число OPCs культивируемых и преобразованных должен быть оптимизирован к местным условиям. Желательно, чтобы отобрать такое же количество OPCs для каждого миелинизации анализа дает возможность прямого сравнения количества миелиновых аксонов сегментов в сравнении между условиями более нескольких экспериментов.
Потенциальным ограничением этого метода является изменчивость в базальных уровней миелинизации между миелинизации анализов. После вирусной трансдукции, базальный уровень миелинизации уменьшается, указывая, что инфицированные вирусом OPCs не myelinate, а также наивных (не инфицированных вирусными) OPCs. Эту проблему можно решить путем количественного определения степени миелинизации по отношению к базисной миелинизации в каждом анализе. Таким образом, пустой вектор, который экспрессирует только GFP должен быть использован в качестве внутреннего Contrол. В дополнение к миелинизации, экспрессия белка интерес может также влиять на другие аспекты OPCs, таких как выживание, пролиферации и дифференцировки, что приводит к косвенному воздействию на миелинизации. Таким образом, анализ OPC поведения, например, жизнеспособности клеток должны проводиться параллельно с миелинизации анализов.
Вирусные способы трансдукции, описанные здесь, не ограничены при изучении олигодендроцитов миелинизации; на самом деле это может быть обобщена и применяется для изучения других типов клеток, таких как шванновских клеток, астроциты и нейроны, в то время как оптимизация может потребоваться для отдельного типа клеток. Этот протокол обеспечивает большую гибкость, чтобы изучить поведение клеток, таких как пролиферации и дифференцировки путем селективного сверхэкспрессии белка интереса (дикого типа или мутантный) в нужный тип клеток, который имеет особые преимущества при использовании смешанной системы для культивирования клеток. Клетки, используемые для трансдукции может быть выделен либо из крысы илиТаким образом, мышь (дикого типа или трансгенных), что позволяет целевой изучения сигнальных и компенсации механизмов в трансгенных животных, которые, как правило, трудно добиться и многое больше времени, чем при использовании трансгенных мышах в естественных условиях. Последние данные свидетельствуют о том, что стратегия лентивирусный основе успешно используется для сотового трансдукции в животных моделях 13, что свидетельствует о большой потенциал трансдуцирующих олигодендроглиальным клеток с использованием лентивирусные подходы в естественных условиях.
В заключение, сочетая в пробирке миелинизации анализа лентивирусными инфекции OPCs обеспечивают стратегический инструмент для анализа молекулярных механизмов, участвующих в миелинизации. Роль специфических белков в миелинизации могут быть опрошены и в OPCs может быть выделен из мышей и крыс для использования на крысы DRG совместных культурах, лентивирусов подход также может быть использован в сочетании с нокаутом технологии различных линий мышей опрашивать мехмах компенсации в процессах миелинизации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2K7 lentivector | Kind gift from Dr Suter9 | ||
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100mg | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115545205 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11012 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518-5G | |
| B27 - NeuroCul SM1 Neuronal Supplement | Stem Cell Technologies | 5711 | |
| BDNF (Human) | Peprotech | PT450021000 | |
| Biotin (d-Biotin) | Sigma Aldrich | B4639 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4161 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-100G | |
| CNTF | Peprotech | 450-13020 | |
| DAKO fluoresence mounting media | DAKO | S302380-2 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Life Technologies | 10313039 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-375KU | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Life Technologies | 14040182 | |
| EBSS | Life Technologies | 14155063 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101 | |
| Entry vectors for promoter and gene of interest | Generate as per protocols 1-2 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886-50MG | |
| Glucose (D-glucose) | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycerol | Chem Supply | GL010-500M | See stock solutions |
| Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115005003 | |
| Goat Anti-Mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115005020 | |
| Goat Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 112005167 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Igepal | Sigma Aldrich | I3021-100ML | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Laminin | Life Technologies | 23017015 | |
| LB Medium | See stock solutions | ||
| LB-Agar | See stock solutions | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-7477 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415064 | |
| L-Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| L-Glutamine- 200 mM (100x) liquid | Life Technologies | 25030081 | |
| LR Clonase II Plus enzyme | Life Technologies | 12538-120 | |
| MEM, NEAA, no Glutamine | Life Technologies | 10370088 | |
| Mouse α βIII Tubulin | Promega | G7121 | |
| Mouse αMBP (monoclonal) | Millipore | MAB381 | |
| Na pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| NAC | Sigma Aldrich | A8199 | |
| NcoI-HF | NEB | R3193S | |
| NEBuffer 4 | NEB | B7004S | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| NGF (mouse) | Alomone Labs | N-100 | |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | |
| O1 antibody - Mouse anti-O1 | Millipore | MAB344 | Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable |
| O1 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning | ||
| O4 antibody - Mouse anti-O4 | Millipore | MAB345 | Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable |
| O4 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning | ||
| Competent cells | Life Technologies | A10460 | |
| One Shot Stbl competent cells | Life Technologies | C7373-03 | |
| Papain Suspension | Worthington/Cooper | LS003126 | |
| pBR8.91 | Kind gift from Dr Denham10 | ||
| PDGF-AA (Human) | Peprotech | PT10013A500 | |
| Penicillin-streptomycin 100x solution | Life Technologies | 15140122 | |
| pENTRY4IRES2GFP | Invitrogen | 11818-010 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727-100ML | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | |
| Protease inhibitor tablet (Complete mini) | Roche | 11836153001 | |
| Proteinase K | Supplied with Clonase enzyme | ||
| Putrescine | Sigma Aldrich | P-5780 | |
| Rabbit α neurofilament | Millipore | AB1987 | |
| Rabbit αMBP (polyclonal) | Millipore | AB980 | |
| Ran2 hybridoma cells | ATCC | TIB-119 | Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning |
| Rat anti CD140A/PDGFRa antibody | BD Pharmingen | 558774 | |
| SacII | NEB | R0157 | |
| SOC medium | Supplied with competent bacteria | ||
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| Spe I | NEB | R0133S | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Buffer | NEB | B0202S | |
| TE buffer pH8 | See stock solutions | ||
| TNE lysis buffer | |||
| Trace Elements B | Cellgro | 99-175-CI | |
| Transferrin (apo-Transferrin human) | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
| Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White | Roche | 10109878001 | |
| Trypsin-EDTA (1x), phenol red (0.05%) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 | Vector laboratories | L-1100 | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003-5G |
References
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Lee, K., et al. MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).
- Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Xiao, J., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes. Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).
- Lundgaard, I., et al. Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes. PLoS Biology. 11 (12), e1001743 (2013).
- Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture methodes for the study of myelination. , MIT Press. Cambridge, MA. (1991).
- Xiao, J., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro. J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).
- Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).
- Li, Z., et al. Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle. Molecular and Cellular Probes. , (2014).
- Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
- Murai, K., et al. Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).
