Производство и использование Лентивирус, чтобы выборочно преобразовывать Первичная олигодендроцитов клеток-предшественников для<em> In Vitro</em> миелинизации Анализы
Summary
Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.
Abstract
Миелинизации представляет собой сложный процесс, который включает в себя как нейроны и миелин, образующий глиальные клетки, олигодендроциты в центральной нервной системе (ЦНС) и шванновских клеток в периферической нервной системе (PNS). Мы используем в пробирке миелинизации анализ, установленную модель для изучения ЦНС миелинизации в пробирке. Чтобы сделать это, клетки олигодендроцит предшественника (OPCS) добавляются к очищенной основной грызунов спинной ганглий корень (DRG) нейронов, чтобы сформировать myelinating сопутствующих культур. Для того, чтобы специально допросить роли, что отдельные белки, выраженные олигодендроцитах оказать на миелинизации мы разработали протоколы, которые избирательно преобразовывать OPCs помощью лентивирус с гиперэкспрессией дикого типа, постоянно активный или доминантных негативных белки перед посеяны DRG нейронов. Это позволяет нам специально допросить роли этих олигодендроглиальным белков в регуляции миелинизации. Протоколы могут быть применены при изучении OTее типы клеток, обеспечивая тем самым подход, который позволяет избирательно манипулировать белков, выраженных от желаемого типа клеток, таких как олигодендроциты для целевого изучения сигнализации и механизмы компенсации. В заключение, сочетая в пробирке миелинизации анализа лентивирусными инфицированных OPCs обеспечивают стратегический инструмент для анализа молекулярных механизмов, участвующих в миелинизации.
Introduction
Миелинизации аксонов имеет решающее значение для быстрого и эффективного передачи потенциалов действия как в центральной и периферической нервной систем. Специализированных клеток, шванновских клеток в периферической нервной системе и олигодендроциты в центральной нервной системе, обернуть вокруг и ensheathe аксоны в миелина, эффективно изолирующих нерв и облегчающие сальтаторных проводимость 1. Процесс миелинизации могут быть изучены в лабораторных помощью сетчатки ганглиозных нейронов 2, инженерные нановолокон 3 или задних корешков ганглиев сокультивировали либо с клетками Шванн 4 или олигодендроцитах 5-7. В пробирке миелинизация анализ является известной моделью для изучения нервной системы миелинизации и она повторяет многие из фундаментальных процессов, которые происходят во время миелинизации в естественных условиях 5-8. Анализ включает совместного культивирования очищенных популяций спинных ганглий (DRG) нейронов, с OPCs (для CNS миелинизация) или Шванн клетки (для ПНС миелинизации). При определенных условиях эти myelinating клетки ensheathe DRG аксоны в упорядоченной, ультра структурно проверены, мульти-пластинчатые листа изолирующего клеточную мембрану, что выразить одинаковый набор миелиновых специфических белков, присутствующих в естественных условиях.
Наиболее часто используется сотовый модель изучения ЦНС миелинизации в пробирке является со-культуры DRG нейронов и OPCs, которые были успешно использованы для изучения влияния, что экзогенные факторы, такие как нейротрофинов оказывают на ЦНС миелинизации в пробирке 5,6. Внешние факторы, такие как факторы роста или низкомолекулярных фармакологических ингибиторов широко используется для изучения роли сигнальных путей в миелинизации с помощью DRG-OPC Совместное культивирование модели 7,9. Тем не менее, в случае смешанных со-культуры, которые содержат как нейроны и олигодендроциты, она по-прежнему формально можно что либо факторы роста или Pharmacological ингибиторы могли оказать воздействие на обоих нейронов DRG и олигодендроциты (ПР). Это действительно предлагает способность специфически вскрыть роль, что белки, выраженные только ДРГ или олигодендроглии оказывает на миелинизации с помощью этой системы двойной клеток. Однозначно подтверждают, что сигнальный путь в олигодендроглиальных непосредственно регулирует миелинизация, лентивирусный трансдукция OPCs, перед посевом на DRG нейронов для в пробирке миелинизации анализа, оказалась элегантный способ сверхэкспрессировать как дикого типа и мутантных белков, а также как нокдаун экспрессии конститутивно экспрессированных белков по олигодендроцитах. Таким образом, этот подход дает проспект специально опроса и манипулировать сигнальными путями внутри олигодендроцитах для изучения миелинизации 9,10.
В этой статье мы приводим методы, которые мы разработали для сверхэкспрессии представляющего интерес белка выборочно в олигодендроцитах с помощью лентивирусногоподход к изучению миелинизации в пробирке. Методика начинается с генерации векторов экспрессии, содержащих нужный ген, будь то в дикого типа, конститутивно активным или доминирующей негативной форме, которые затем последовательно клонировали в вектор pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Этот вектор (содержащий интересующий ген), ЦМВ промотор донора (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) и 2K7 lentivector объединены в ферментативной реакции с получением 2K7 вектор, содержащий промотор CMV, интересующий ген, Внутренняя рибосомальной сайт вход и GFP (рис 1). Этот шлюз клонировали 2K7 конструкция в сочетании с вирусной оболочки PMD2.G и вирус пакета pBR8.91 могут быть совместно трансфицировали в клетки HEK293T генерировать лентивирус, которые впоследствии могут быть использованы для трансдукции OPCs. После заражения с лентивирусов в OPCs выражают высокий уровень белка, представляющего интерес. Эти OPCs затем могут быть посеяны на DRG нейронов культур и эффект, что экспрессиявысоких уровней нужного белка оказывает на миелинизации может быть допрошен. Со-культуры оценивали на экспрессию белка миелина с помощью Вестерн-блот-анализа и визуализировали для формирования миелиновых аксонов сегментов по иммуногистохимии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Миелинизации аксонов важный процесс для оптимального функционирования как центральных, так и периферической нервной системы позвоночных. Производство и техническое обслуживание миелиновых аксонов является сложным и скоординированный процесс с участием молекулярных взаимодействи…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC fellowship #454330 to JX, project grant #628761 to SM and APP1058647 to JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 to JX), the University of Melbourne Research Grant Support Scheme and Melbourne Research CI Fellowship to JX as well as Australia Postgraduate Scholarships to HP and AF. We would like to acknowledge the Operational Infrastructure Scheme of the Department of Innovation, Industry and Regional Development, Victoria Australia.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # | Notes |
| 2K7 lentivector | Kind gift from Dr Suter9 | ||
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100mg | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115545205 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11012 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518-5G | |
| B27 – NeuroCul SM1 Neuronal Supplement | Stem Cell Technologies | 5711 | |
| BDNF (Human) | Peprotech | PT450021000 | |
| Biotin (d-Biotin) | Sigma Aldrich | B4639 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4161 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-100G | |
| CNTF | Peprotech | 450-13020 | |
| DAKO fluoresence mounting media | DAKO | S302380-2 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate, no Glutamine | Life Technologies | 10313039 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-375KU | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Life Technologies | 14040182 | |
| EBSS | Life Technologies | 14155063 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101 | |
| Entry vectors for promoter and gene of interest | Generate as per protocols 1-2 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886-50MG | |
| Glucose (D-glucose) | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycerol | Chem Supply | GL010-500M | See stock solutions |
| Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115005003 | |
| Goat Anti-Mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115005020 | |
| Goat Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 112005167 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Igepal | Sigma Aldrich | I3021-100ML | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Laminin | Life Technologies | 23017015 | |
| LB Medium | See stock solutions | ||
| LB-Agar | See stock solutions | ||
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C-7477 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415064 | |
| L-Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| L-Glutamine- 200mM (100X) liquid | Life Technologies | 25030081 | |
| LR Clonase II Plus enzyme | Life Technologies | 12538-120 | |
| MEM, NEAA, no Glutamine | Life Technologies | 10370088 | |
| Mouse α βIII Tubulin | Promega | G7121 | |
| Mouse αMBP (monoclonal) | Millipore | MAB381 | |
| Na pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| NAC | Sigma Aldrich | A8199 | |
| NcoI-HF | NEB | R3193S | |
| NEBuffer 4 | NEB | B7004S | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| NGF (mouse) | Alomone Labs | N-100 | |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | |
| O1 antibody – Mouse anti-O1 | Millipore | MAB344 | Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable |
| O1 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning | ||
| O4 antibody – Mouse anti-O4 | Millipore | MAB345 | Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable |
| O4 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning | ||
| Competent Cells | Life Technologies | A10460 | |
| One Shot Stbl competent cells | Life Technologies | C7373-03 | |
| Papain Suspension | Worthington/Cooper | LS003126 | |
| pBR8.91 | Kind gift from Dr Denham10 | ||
| PDGF-AA (Human) | Peprotech | PT10013A500 | |
| Penicillin- Streptomycin 100X solution | Life Technologies | 15140122 | |
| pENTRY4IRES2GFP | Invitrogen | 11818-010 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727-100ML | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | |
| Protease inhibitor tablet (Complete mini) | Roche | 11836153001 | |
| Proteinase K | Supplied with Clonase enzyme | ||
| Putrescine | Sigma Aldrich | P-5780 | |
| Rabbit α neurofilament | Millipore | AB1987 | |
| Rabbit αMBP (polyclonal) | Millipore | AB980 | |
| Ran2 hybridoma cells | ATCC | TIB-119 | Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning |
| Rat anti CD140A/PDGFRa antibody | BD Pharmingen | 558774 | |
| SacII | NEB | R0157 | |
| SOC medium | Supplied with competent bacteria | ||
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| Spe I | NEB | R0133S | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Buffer | NEB | B0202S | |
| TE buffer pH8 | See stock solutions | ||
| TNE lysis buffer | |||
| Trace Elements B | Cellgro | 99-175-CI | |
| Transferrin (apo-Transferrin human) | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
| Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White | Roche | 10109878001 | |
| Trypsin-EDTA (1X), phenol red (0.05%) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 | Vector laboratories | L-1100 | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003-5G |
References
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Lee, K., et al. MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).
- Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Xiao, J., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes. Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).
- Lundgaard, I., et al. Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes. PLoS Biology. 11 (12), e1001743 (2013).
- Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. . Tissue culture methodes for the study of myelination. , (1991).
- Xiao, J., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro. J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).
- Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).
- Li, Z., et al. Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle. Molecular and Cellular Probes. , (2014).
- Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
- Murai, K., et al. Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).
