Abstract
Myelinisierung ist ein komplexer Prozess, der beide Neuronen und das Myelin bilden Gliazellen umfasst, Oligodendrozyten im zentralen Nervensystem (ZNS) und Schwann-Zellen im peripheren Nervensystem (PNS). Wir verwenden ein in vitro Assay Myelinisierung, ein etabliertes Modell für die Untersuchung CNS Myelinisierung in vitro. Um dies zu tun, werden Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC), um die gereinigte primäre Nager dorsalen Wurzelganglien (DRG) Neuronen hinzugefügt myelinisierenden Kokulturen bilden. Um spezifisch zu verhören, die Rollen, die bestimmte Proteine, die von Oligodendrozyten exprimiert auf Myelinisierung auszuüben haben wir Protokolle, die selektiv zu transduzieren OPCs mit dem Lentivirus überexprimieren Wildtyp, konstitutiv aktiv oder dominant negative Proteine, bevor sie auf die DRG-Neuronen ausgesät entwickelt. So können wir gezielt befragen die Rolle dieser Proteine bei der Regulierung oligodendroglialen Myelinisierung. Die Protokolle können auch bei der Untersuchung von ot aufgetragen werdenihren Zelltypen und bietet somit einen Ansatz, der selektiven Manipulation von Proteinen durch einen gewünschten Zelltyp exprimiert wird, wie beispielsweise Oligodendrozyten, für die gezielte Untersuchung von Signalisierungs- und Kompensationsmechanismen ermöglicht. Zusammenfassend, die Kombination der In-vitro-Assays mit Myelinisierung lentiviralen infiziert OPCs eine strategisches Instrument für die Analyse der molekularen Mechanismen in Myelinisierung beteiligt.
Introduction
Myelinisierung von Axonen ist entscheidend für die schnelle und effiziente Übertragung von Aktionspotentialen in den beiden zentralen und peripheren Nervensystemen. Spezialisierte Zellen, Schwann-Zellen im peripheren Nervensystem und Oligodendrozyten im zentralen Nervensystem, Wrap-around und ensheathe Axone im Myelin, effektiv Isolierung der Nerven und saltatorische Erregungsleitung 1 zu erleichtern. Der Prozess der Myelinisierung in vitro unter Verwendung von retinalen Ganglienneuronen 2, konstruiert Nanofasern 3 oder Dorsalwurzelganglionneuronen cokultiviert entweder mit Schwannschen Zellen 4 oder Oligodendrozyten 5-7 untersucht werden. Die In-vitro-Assay Myelinisierung ist ein etabliertes Modell für die Untersuchung des Nervensystems Myelinisierung und viele der grundlegenden Prozesse, die während der Myelinisierung in vivo 8.5 auftreten repliziert. Der Test beinhaltet die Co-Kultur von gereinigten Populationen von Spinalganglion (DRG) Neuronen, mit OPC (für C-NS Myelinisierung) oder Schwann-Zellen (für PNS Myelinisierung). Unter bestimmten Bedingungen sind diese Zellen myelinisierenden ensheathe DRG Axone im befahl, ultra strukturell überprüft, multilamellaren Folie aus isolierendem Plasmamembran, die die gleiche Ergänzung von Myelin in vivo vorhanden spezifische Proteine zu exprimieren.
Das am häufigsten verwendete Zellmodell zu studieren CNS Myelinisierung in vitro ist die Co-Kulturen von DRG-Neuronen und OPCs, die erfolgreich verwendet wurden, um den Effekt, dass exogene Faktoren wie Neurotrophine auszuüben auf CNS Myelinisierung in vitro 5,6 studieren. Exogene Faktoren, wie Wachstumsfaktoren oder kleines Molekül pharmakologische Inhibitoren wurde weithin verwendet, um die Rolle von Signalwegen in der Myelinisierung mit der DRG-OPC Kokulturmodell 7,9 studieren. Jedoch in den Misch Kokultur Einstellungen, die sowohl die Neuronen und Oligodendrozyten enthalten, formell möglich blieb, daß entweder die Wachstumsfaktoren oder die pharmacological Inhibitoren könnte Auswirkungen auf sowohl die DRG-Neuronen und Oligodendrozyten (OL) ausgeübt haben. Hier bietet sich die Möglichkeit, gezielt zu sezieren die Rolle, dass die Proteine nur durch DRGs ausdrücklich oder Oligodendroglia übt auf die Myelinisierung mit dieser Zwei-Zellen-System. Um zweifelsfrei bestätigen, dass der Signalweg in oligodendroglialen Myelinisierung, lentivirale Transduktion OPCs vor auf DRG-Neuronen für die In-vitro-Assays Myelinisierung Aussaat, hat sich eine elegante Möglichkeit, sowohl Wildtyp und mutierten Proteine überexprimiert werden, aber auch direkt reguliert als Zuschlags Ausdruck konstitutiv exprimierten Proteine, die von Oligodendrozyten. Damit bietet dieser Ansatz einen Weg, um gezielt abzufragen und zu manipulieren Signalwege innerhalb Oligodendrozyten zum Studium Myelinisierung 9,10.
In diesem Papier Methoden, die wir selektiv in Oligodendrozyten über einen lentiviralen wurden entwickelt, um ein Protein von Interesse überexprimiert berichten wirAnsatz für das Studium Myelinisierung in vitro. Die Technik beginnt mit der Erzeugung von Expressionsvektoren, die das Gen von Interesse enthält, sei es in einem Wildtyp, konstitutiv aktiven oder dominant negative Form, die dann anschließend in der pENTR Vektor (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP) kloniert werden. Dieser Vektor (der das Gen von Interesse), sind der CMV-Promotor-Donor (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) und das 2K7 lentivector in einer Enzymreaktion kombiniert, um eine 2K7 Vektor, CMV-Promotor, das Gen von Interesse, ein produzieren interne Ribosomenbindungsstelle und GFP (Abbildung 1). Diese Gateway-geklonten 2K7 Konstrukt kombiniert mit der PMD2.G Virushülle und dem pBR8.91 Virus-Paket kann in HEK293T-Zellen cotransfiziert, um Lentiviren, die später verwendet werden, um OPCs transduzieren erzeugen. Einmal mit dem Lentivirus infiziert die OPCs Ausdruck ein hohes Maß an das Protein von Interesse. Diese OPC kann dann auf DRG Neuronenkulturen ausgesät werden und die Wirkung, dass die Expressionvon hohen Niveaus des gewünschten Proteins übt auf die Myelinisierung abgefragt werden. Die Co-Kulturen werden auf Myelin-Protein-Expression durch Western-Blot-Analyse untersucht und für die Bildung von myelinisierten Axonen Segmente durch Immunzytochemie visualisiert.
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Protocol
HINWEIS: Alle Tieren für die Studie verwendet wurden, waren gemischten Geschlechts und aufgewachsen in der Tierhaltung von der Abteilung für Anatomie und Pathologie und der Florey Institut für Neurowissenschaften und Mental Health Research an der Universität von Melbourne. Alle tierischen Verfahren wurden von Tierversuchen Ethikkommissionen an der Universität von Melbourne zugelassen.
1. Klonierung 2K7 Lentivector
- Bevor die Klonierung des Gens von Interesse in das 2K7 lentiviralen Vektor, Subklonierung des Gens in der pENTR Vektors (3637 bp, Kanamycin-resistent) unter Verwendung von Standardtechniken Molekular 11. Verwenden Sie die EcoRI und SacII Restriktionsstellen für die Subklonierung.
- Verstärkung des 2K7 Lentivector
- Trans 2K7 lentivector DNA durch vorsichtiges Mischen von 100 ng Plasmid-DNA mit kompetenten Zellen und Inkubation auf Eis für 30 min.
- Hitzeschock-DNA / kompetenten Zellen mischen, auf 42 ° C für 90 sec und der Platte diese auf LB-Agar-Platten, die sowohl ampicillin (100 ug / ml) und Chloramphenicol (15 ug / ml) bei 37 ° C für 16-18 Std.
HINWEIS: Chloramphenicol verwendet wird, um die Rekombination zwischen den langen terminalen Wiederholungen zu vermeiden. - Am nächsten Tag in LB-Medien, die sowohl Ampicillin (100 ug / ml) und Chloramphenicol (15 ug / ml) bei 37 ° C für 16-18 h ausgewählten Bakterienklone wachsen. Extrahieren Sie die DNA mit einem handelsüblichen Plasmid-DNA Maxiprep Kit gemäß Herstellerangaben.
- Subklonieren von pENTR Vektor 2K7 Lentivector (Abbildung 1)
Abb. 1: Schematische Darstellung der Rekombination Gateway Das Gen von Interesse, das hier als Flag-Erk1 dargestellt wird, wird in die pENTR L1-L2-Vektor kloniert. Dies wird auf die pENTR L4-R1 Vektor, der die CMV-Promotor und das Rückgrat 2K7 Vektor addiert. Diese drei Vektoren werden durch die LR Clonase II Plus Enzym rekombinierteinzufügen, die das Gen von Interesse und den Promotor in das Virus-ready 2K7 Vektor.- Fügen Sie den folgenden in ein 1,5-ml-Tube und vorsichtig mischen:
L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (Promotor) (60 BNG) von 1 bis 2,5 & mgr;
L1-L2 pENTR4IRES2GFP (mit Gen von Interesse) (80 BNG) von 1 bis 2,5 & mgr;
K7 lentivector (80 ng / ul) 1 ul
TE-Puffer, pH 82-5 ul
Insgesamt 8 & mgr; - Entfernen Clonase Enzymmischung von -80 ° C und Auftauen auf Eis für 2 min. Sicherzustellen, dass dieses Enzym ein frisches Aliquot von -80 ° C, wie das Enzym wesentlich reduziert Klonierungseffizienz bei wiederholtem Einfrieren und Auftauen
- Add 2 ul Enzym pro Reaktion und gut mischen über Wirbel und inkubieren Sie die Clonase Reaktionsmischung bei 23-25 ° C für 6-24 Stunden.
- 1 & mgr; l Proteinase K-Lösung (mit Enzym Satzes) zur Clonase Reaktionsgemisch und Inkubation für 10 min bei 37 ° C.
- Trans Clonase Reaktionsgemisch in kompetente Zellen und wachsen die AuswahlKolonien in LB-Medium, das Ampicillin (100 ug / ml) bei 37 ° C für 16-18 Std.
- Extrahieren und zu reinigen DNA mit einem handelsüblichen Plasmid-DNA-Miniprep-Kits nach den Anweisungen des Herstellers.
- Bestätigen die DNA mittels Verdauung mit den Restriktionsenzymen Spe I und Sac II und eines geeigneten Puffers nach den Anweisungen des Herstellers, um das Fragment, das den Promotor und das Gen von Interesse zu entfernen.
HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um zu überprüfen, ob die DNA subkloniert den richtigen Einsatz Gen von Interesse mit der rechten Vektorgerüst. Die Größe des Vektors selbst ohne insertierte Fragment 6,7 kb. Die Größe der freigesetzten inserierte Fragment enthält sowohl den Promotor und die Einlage Gen von Interesse. Berechnen Sie die erwarteten Fragmentgrößen von der Digest für das spezifische Gen über eine DNA-Sequenz-Editing-Programm, zum Beispiel, APE - eine Plasmid-Editor. - Überprüfen der Größen der beiden DNA-Vektorgerüst und den Freigabe-Fragments, indem eine 1% Agarosegelin 1x TAE-Puffer (siehe Tabelle der Stammlösungen) bei 100 V
- Erhöhen der bestätigten DNA durch wachsende Bakterien in 500 ml LB-Medium Ampicillin (100 ug / ml), die bei 37 ° C für 16-18 Std.
- Extrahieren und zu reinigen DNA mit einem handelsüblichen Plasmid-DNA Maxiprep Kit gemäß Herstellerangaben.
HINWEIS: Maxiprep erzeugt typischerweise ausreichende Menge an DNA für die virale Produktion erforderlich.
- Fügen Sie den folgenden in ein 1,5-ml-Tube und vorsichtig mischen:
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3.9-1.3.10 die folgenden DNAs für lentiviralen Vorbereitungen zu verstärken: Envelope-Vektor (PMD2.G, 6,1 kb), Paket-Vektor (pBR8.91, 12.5 kb), und eine leere lentiviralen Vektor als Kontrolle (GFP -CMV-2K7, 8,7 kb).
2. 2K7 Virus Produktion
HINWEIS: 1. Tag:
- Am Tag der Transfektion Platte 32 Millionen HEK293-Zellen in T175-Kolben mit 25 ml HEK293 T-Zell-Medien (siehe die Tabelle der Stammlösungen). Alternativ Platte 16 Millionen Zellen den Tagvor der Transfektion, wenn die Zeit abgelaufen ist dicht am Tag der Transfektion.
HINWEIS: Die Transfektion kann durch Plattieren Zellen am Tag der Transfektion oder vor dem Tag gleichermaßen erfolgreich. Mit einer der beiden Alternativen ist der kritische Punkt ist hier, um sicherzustellen, Zellen sich auf Kulturschale Oberfläche vor der Transfektion aufgeklebt werden.
HINWEIS: Tag 2: - Transfektion
- Vor der Transfektion verdünnte DNA 1 ug / ul in TE-Puffer, der 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA pH 8 in vollentsalztem Wasser enthalten.
- In einem 50-ml-Tube, bereiten Sie einen Master-Mix (Tabelle 1) für die Transfektion in der T175-Kolben. Fügen DNA zu vorgewärmten Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und gut mischen durch Wirbel, dann fügen Sie sterile Polyethylenimin (PEI) (siehe Tabelle der Stammlösungen) zu einer vorzeitigen Ausfällen zu vermeiden.
Tabelle 1: Vorbereiten Transfektionsmischung für 2K7 Virus.Vektor trong> Konzentration Volumen pMDG.2 1 ug / ul 5 & mgr; pBR8.91 1 ug / ul 15 ul 2K7 Vektor mit GFP + Gen von Interesse 1 ug / ul 22 & mgr; Sterile Polyethylenimin (PEI) 1 g / L 500 & mgr; DMEM 2100 & mgr; - Gut mischen durch Umdrehen des Röhrchens 3-4x und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur (RT).
- Führen Sie eine vollständige Medienwechsel auf HEK293T-Zellen. Absaugen des Kulturmediums von Zellen vollständig und Futter mit vorgewärmter HEK293T Zellkulturmedien (25 ml je T175-Kolben).
- Fügen Sie das Transfektionsgemisch (DNA / PEI Mischung) tropfenweise zu den Zellen-Monoschicht. Bewegen Sie vorsichtig, um bei 37 ° C, 5% CO 2 gut mischen und inkubieren transfizierten Zellen, über Nacht.
HINWEIS: Tag 3: - Um sicherzustellen, dass die Transfektion erfolgreich ist, überprüfen Sie die GFP-Expression 24 h nach der Transfektion über einen Fluoreszenz-Mikroskopie.
HINWEIS: Über 50% der Zellen, die GFP in der Regel zeigt eine gute Transfektion.
HINWEIS: Tag 4: - An der 48 Stunden nach der Transfektion, zur Erhebung der Virusüberstand und ersetzen Sie sie durch frische HEK293 T-Medien (25 ml pro Flasche T175).
- Zentrifugieren Sie die Virusüberstand bei 1140 × g für 10 Minuten bei 4 ° C, um aus dem Überstand klar, bis die Zelltrümmer. Über geklärte Überstand an 50 ml Tube und bei 4 ° C.
HINWEIS: 5. Tag:
- Zentrifugieren Sie die Virusüberstand bei 1140 × g für 10 Minuten bei 4 ° C, um aus dem Überstand klar, bis die Zelltrümmer. Über geklärte Überstand an 50 ml Tube und bei 4 ° C.
- Bei 72 Stunden nach der Transfektion sammeln die zweite Charge von Virusüberstand. Wiederholen Sie Schritt 2.3.1 und Pool 48 und 72 Stunden gelöscht Ständen.
- Um das Virus, die virale Zentrifugenüberstand bei 170.000 · g für 90 min konzentrieren bei 4ºC unter Verwendung von 30 ml Ultrazentrifugenröhrchen.
- Überstand verwerfen und wiederholen Sie Schritt 2.6, bis alle geklärte Überstand wurde zentrifugiert worden Verlassen einer (unsichtbar) Pellet-Virus Plus gefällt PEI in der Basis der Röhre.
- Um die Viren resuspendieren, 500 ul SATO Medien (siehe Tabelle der Stammlösungen) zu den Ultrazentrifugenröhrchen. Vortex für 30 Sekunden einnd kratzen die Basis des Rohrs mit einer Pipettenspitze, um das Virus mechanisch zu lösen. Wiederholen Sie diesen Schritt 6x, um virale Pellet zu verlieren.
- Bündeln die resuspendiert Virus in Mikrozentrifugenröhrchen und Spin ganz kurz auf unlösliche PEI entfernen. Den Überstand durch ein 0,45 um Filter, um Proteine zu entfernen.
- Aliquot des Virus in 20 ul, 50 ul und 100 ul Aliquots und bei -80 ° C.
3. Virale Titer Bestimmung in HEK293T Zellen
- Um die Expression des Proteins von Interesse zu überprüfen und die optimale Viruskonzentration für Experimente verwendet, fügen eine Reihe von seriellen Verdünnungen des Virusstamms (beispielsweise 0, 5, 10, 20, 40, 80 & mgr; l), um HEK293-Zellen in plattierten transduzieren 6-Well-Platten, und die Kultur für 24 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2. Dieses Protokoll erzeugt typischerweise Virus, das in Konzentrationen im Bereich von 1:50 bis 1 verwendet werden können: 200, die robuste Expression des Gens der zu erreichenInteresse.
- 48 Stunden nach der Virusübertragung, Lyse HEK293T-Zellen in TNE-Puffer (siehe Tabelle der Stammlösung) mit Proteasehemmern.
- Vertiefungen zweimal Spülen Sie mit kaltem DPBS und fügen 150 ul TNE-Puffer in jede Vertiefung.
- Lyse Zellen durch Auf- und Abpipettieren 5-10x. Übertragen Ganzzelllysaten bis 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Inkubieren auf Eis für 15-30 min.
- Zentrifugation der Lysate bei 4 ° C für 30 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit (20,000 · g) und die Übertragung geklärte Überstand in ein frisches Röhrchen zur Proteinbestimmung nach Bradford und anschließende Western Blot-Analyse.
- Bestimmen Sie die Höhe der Expression des Proteins von Interesse durch Standard Western Blot-Analyse, während Sondieren für Antikörper gegen das Protein selbst und dem geschmolzenen Tag (dh Flagge). Verwenden Sie die Virusverdünnung, die> 95% GFP + -Zellen und robuste Expression von Protein von Interesse für Experimente ergibt.
4. Isolierung und Kultur der DRGs (Fild 2 Schritte 1 & 2)
Abb. 2: Schematische Darstellung der In-vitro-Assays Myelinisierung DRG-Neuronen von P2-3 Rattenjungen, dann gereinigt und kultiviert über zwei Wochen (1-2) zerlegt. OPCs sind aus P7-9 Rattenhirnen mit Immunopanning gereinigt (3). OPCs werden dann mit Lentivirus und für 48 Stunden (4) kultiviert infiziert. OPCs werden dann auf DRGs ausgesät, und alle Wachstumsfaktoren von Interesse, wie BDNF hinzugefügt (5). Co-Kulturen werden dann für 2 Wochen kultiviert, damit OPCs zu differenzieren und myelinisieren die Axone (6). Schließlich werden die Co-Kulturen entweder für Western Blot lysiert oder Immunzytochemie (7) befestigt.HINWEIS: Tag 1 2 Tage vor der Dissektion:
<ol> - Coat autoklaviert 22 mm x 22 mm Deckgläsern mit Poly-L-Ornithin (0,5 mg / ml) in einer 6-Well-Platte, und bei 37 ° C über Nacht.
- Am nächsten Tag, Kleiderdeck wieder mit Laminin (20 ug / ml in MEM) bei 37 ° C über Nacht, saugen überschüssige und trocken für 20 Minuten in der Gewebekultur Kapuze.
HINWEIS: Tag 2: Präparation und Isolierung von DRGs: - Sacrifice P2-P3 Rattenjungen 12x durch zervikale Trennung.
- Entfernen der Haut über dem vom Rücken des Tieres. Verwenden Vannas Schere Wirbelloch öffnen und Pinzette vorsichtig aushöhlen das Rückenmark.
- Auszureißen DRGs, die dazwischen liegen, Wirbelsäulen und abgeschnitten befestigt spinalen Nervenfasern, dann Ort DRGs in einer 33 mm Petrischale mit 3 ml L-15 Medien. Es ist normalerweise nicht möglich, zwischen 8 und 12 DRG von jeder Seite des Rückenmarks zu sammeln
- Aufesammeltes DRGs zusammen mit den L-15-Medium in einem 15 ml-Röhrchen, Zentrifuge bei 180 × g für 5 min.
- Aspirierender Überstand, 2 ml 0,25% Trypsin, um Pellets DRG und bei 37 ° C für 30 min.
- 5 ml Medium M1 (siehe Tabelle der Stammlösung) zu den DRG-Pellets zu Trypsin und Zentrifuge bei 180 xg für 3 min bei RT zu stoppen.
- Überstand entfernen, resuspendieren Sie das Pellet in 2 ml vorgewärmten M1 Medium (nicht mit Wachstumsfaktoren). Man reibt die Ganglien Pellet durch Pipettieren von 50-fach oder bis die Ganglien dispergiert sind. Zentrifuge Zellsuspension bei 180 × g für 3 min.
- Resuspendieren dissoziierten Neuronen in Medien M1 und die Platte in einer 6-Napf-Platte mit 5-Ganglien pro 100 ul pro Vertiefung.
- So entfernen Sie wuchernden nicht-neuronalen Zellen nach einer mindestens 4-stündigen Inkubation, um die Befestigung zu erleichtern, nehmen Sie M1 Medien und füttern Neuronen mit M2-Medium (siehe Tabelle der Stammlösung). Kultur DRG Neuronen in Gegenwart von NGF (100 ng / ml), um eine Kultur der NGF-abhängige TrkA exprimierende DRGs reinigen. Alternativ können Sie auch BDNF (100 ng / ml), um BDNF-abhängigen TrkB-expres reinigensingen DRGs.
- Pflegen Neuronen in M1 Medien (+ NGF oder BDNF bei 100 ng / ml) im Wechsel mit antimitotischen M2-Medium für 2 Wochen als unten.
- Pflegen Medium M1 (+ NGF oder BDNF bei 100 ng / ml) an den Tagen 4-6, 8-10, 12-14 und M2-Medium (+ NGF oder BDNF bei 100 ng / ml) mit FDU und Uridin an den Tagen 1 bis 4, 6-8 und 10-12. Ein Minimum von 3 Zyklen von M2-Medium Reinigung erforderlich.
- Pflegen DRGs in M1 allein für eine weitere Woche nach Abschluss der 2 Wochen antimitotische Zyklus. Ändern M1 Medien alle 2-3 Tage.
5. Isolierung und Kultur der OPCs (Abbildung 2 Schritt 3)
HINWEIS: Tag 1 2 Tage vor der Dissektion:
- Mantel 10 cm-Gewebekulturplatten mit Poly-D-Lysin (PDL, 10 ug / ml in sterilisiertem deionisiertem Wasser) bei 4 ° C über Nacht.
HINWEIS: Tag 2: 1 Tag vor der Dissektion: - Mit sterilem entionisiertem Wasser 3x waschen PDL Platten. Lassen Sie für ca. 6 h in der Gewebekultur Haube trocknen. Wenn nicht sofort verwendet, wickeln und zu speichernfür bis zu 4 Wochen bei 4 ° C.
- Bereiten sekundären Antikörper Platten für Immunopanning. 1 Gehirnsezierung bereiten 2x IgG Platten (für Ran2 Antikörper an Astrozyten und O1-Antikörper zu entfernen, um zu entfernen premyelinating Oligodendrozyten), mit 45 & mgr; l Ziegen-α-Maus IgG in DPBS (15 ml) pro 10 cm Petrischale; 1x IgM Platte (O4 Antikörper zum Auswählen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen), 45 & mgr; l Ziegen-α-Maus IgM in DPBS (15 ml) pro 10 cm Petrischale.
HINWEIS: Tag 3: Tag der Präparation: - In 200 Einheiten Papain in 10 ml Papain Puffer (Tabelle 2) und Aufwärmen auf 37 ° C, bis der Puffer klar wird.
Tabelle 2: Herstellung von Papain Puffer.Konzentration für 250 ml Endkonzentration EBSS Lager 10x 25 ml 1x MgSO 4 100 mM 2,5 ml 1 mM Glucose 30% 3 ml 0,46% EGTA 0,5 M 1 ml 2 mM NaHCO3 1 M 6,5 ml 26 mM Bringen Volumen bis 250 ml mit VE-Wasser und Filter zu sterilisieren - Waschen Sie alle sekundären Antikörper Platten mit DP-BS für 3x.
- Gießen Sie die Ran2 und O1-Antikörper auf die IgG-Platten und der O4 Hybridomzellen auf die IgM-Platte. Alle diese primären Antikörper Inkubation erfolgt über 2 Stunden bei RT.
- Präparieren eines Gehirns von einem P7 Ratte. Enthaupten einen Welpen mit scharfen Scheren und entfernen Sie die Haut über den Schädel mit einer Schere.
- Um den Schädel geschnitten aus dem Hinterhauptslappen, Temporallappen und an den Stirnlappen. Entfernen von Gehirn Schädel mit einer Pinzette und sanft überträgt es auf einer 35-mm-Petrischale mit 1 ml DPBS.
- Würfeln Gehirn in kleine Stücke in etwa mit einer Schere oder sterile Klinge.
- Filter vorgewärmt Papain-Puffer (10 ml) in ein neues 15 ml Röhrchen, das ein Körnchen von L-Cystein, danach 200 ul DNAse (12.500 U / ml) zu dem filtrierten Papain Puffer.
- Gießen Sie die Papain-Puffer auf die gewürfelte Hirngewebe; Inkubieren bei 37 ° C für 90 min.
- Gentlly Transfer dissoziiert Hirngewebe in 50-ml-Röhrchen mit einer 25 ml Pipette undabsetzen lassen.
- Entfernen Papain Puffer, 2 ml Lo Ovo (Ovomucoid) zu Hirngewebe und titurate 5-10x durch Pipettieren zu brechen Stücke von Hirngewebe, absetzen lassen und entfernen Sie die oberen 2 ml Überstand in ein neues Röhrchen.
- Fügen Sie eine weitere 2 ml Lo Ovo zu Hirngewebe und wiederholen Sie Schritt 5,11 bis keine Klumpen von Gewebe bleibt. Tituration bekommen kann immer aggressiver.
- Zentrifuge dissoziierte Zellsuspension für 15 min bei 200 x g. Absaugen Stand und resuspendiere Zellpellet in 10 ml Hallo Ovo und zentrifugieren für 15 min bei 200 x g.
- Waschen Sie zuerst Immunopanning Platte (Ran 2-Platte) mit DPBS für 3x. Überstand entfernen, Zellen in 10 ml Panning Puffer (Tabelle 2) und gießen Sie auf die erste Immunopanning Platte (Ran 2 Schild). Zellen, die Proben für 15 min bei RT.
- Waschen Sie die zweite Immunopanning Platte (O1 Platte) mit DPBS für 3x.
- Nach der Inkubation in der ersten Immunopanning Platte, das Zünglein an der Zellsuspension auf zweitenImmunopanning Platte (O1 Platte), spülen Sie lose Zellen von der Oberfläche der Platte mit 1-3 ml Panning Puffer und Pipettieren mit dem O1 Platte. Zellen, die Proben für 15 min bei RT.
- Waschen Sie die dritte Immunopanning Platte (O4 Schild). Diese Platte ist die positive Selektionsplatte, wo die OPCs binden seiner Oberfläche. Waschen Sie die O4-Platte mit DPBS für 3x.
- Nach der Inkubation auf der zweiten Immunopanning Platte, übertragen die Zellen auf die endgültige Immunopanning Platte (O4 Platte), inkubieren Zellen für 45 min bei RT. Dieser Schritt wird O4 + OPCs auswählen.
- Überstand von dem letzten Immunopanning Platte (O4 Platte) und spülen Sie die Platte mit EBSS für 6x.
- Um OPCs off der Platte zu entfernen, inkubiert die Zellen mit 5 ml warmem 0,05% Trypsin-EDTA, verdünnt 1:10 mit EBSS bei 37 ° C für 8 min.
- 5 ml 30% FBS (in EBSS hergestellt), um das Trypsin zu neutralisieren. Entfernen Zellen ab Oberfläche der Platte durch Pipettieren ca. 50x.
- Übertragen Sie alle ZellSuspension in ein neues Röhrchen und zentrifugiere für 15 Minuten bei 200 x g.
- Überstand verwerfen und resuspendieren Zellpellet in 1 ml vorgewärmten SATO Medien, gefolgt von Zellzählung. Dissection von einem Gehirn 1,5-2.000.000 OPCs liefern.
- Platten Zellen auf Trocken PDL-beschichteten Platten in einer Dichte von 1 x 10 5 und 5 x 10 5 pro 10 cm Platte mit in SATO Medium (10 ml), der ciliare neurotrophe Faktor enthalten (CNTF, 10 ng / ml), Plättchenwachstumsfaktor (PDGF, 10 ng / ml), Neurotrophin 3 (NT3, 1 ng / ml) und Forskolin (4,2 ug / ml) 2,12. Kultur OPCs bei 37 ° C, 8% CO 2.
6. transduzierenden OPCs
- Kultur primären OPCs in SATO Medium (10 ml / 10 cm-Platte) mit CNTF (10 ng / ml), PDGF (10 ng / ml), NT3 (1 ng / ml) und Forskolin (4,2 ug / ml) bei 37 ° C, 8% CO 2 für 24 Stunden nach der Sektion.
- Komplett absaugen den OPC Kulturmedien, Futter Zellen mit frisch zubereiteten SATO Medium (10 ml) Mit Wachstumsfaktoren (siehe oben in Schritt 6.1).
- Hinzufügen Virus zu den OPCs auf die optimale Konzentration für Schritt 3 (Abbildung 2, Schritt 4), Kultur OPCs für weitere 48 h bestimmt.
7. OPC Seeding für myelinisierenden Co-Kulturen (Abbildung 2, Schritt 5 und 6)
- Um OPCs von der Oberfläche, erste Spülung OPC Platten mit 8 ml EBSS zweimal zu entfernen, dann inkubieren Zellen mit 5 ml warmem 0,05% Trypsin-EDTA, verdünnt 1:10 mit EBSS bei 37 ° C für 2 min.
- Neutralisieren die Trypsin mit 30% FBS in EBSS (5 ml), und entfernen Sie Zellen aus Platte pipettiert. Übertragen Zellsuspension in ein 15 ml-Gefäß, Zentrifuge bei 180 × g für 15 min bei RT.
- Absaugen der Überstand und resuspendieren Zellpellet in 1 ml vorgewärmten SATO Medien gefolgt von Zellzahl.
- Vor der OPC Aussaat, vollständig absaugen Medien aus dem DRG-Kulturplatte. Gently Saatgut 200.000 OPCs tropfenweise auf die DRG-Neuronen, wie zuvor beschrieben 6.4.
HINWEIS:Die gesamte OPC Aussaat Volumen muss weniger als 200 & mgr; l pro 22 mm Deckglas sein. - Lassen Zellen ohne Bewegen der Platte für 10 Minuten in der Gewebekultur Haube zu regeln, dann vorsichtig nachfüllen 1 ml vorgewärmten SATO Medium pro Vertiefung.
- Ausstrich die restlichen Schwester OPCs mit SATO Medium mit Wachstumsfaktoren (siehe Schritt 6.1). Verwenden Sie diese Schwester OPCs, die Expression des Proteins von Interesse zu prüfen.
- Nach 24 Stunden, ersetzen Sie den SATO Medien mit dem Co-Kulturmedien (2 ml / Vertiefung), die SATO Medien (keine Faktoren) und Neurobasalmedium (v / v) mit 1% B27. Pflegen Sie die Co-Kulturen für 14 Tage mit Medienwechsel alle 2-3 Tage.
- Bewertung der Co-Kulturen für Myelinprotein-Expression durch Western Blot-Analyse und Visualisierung für die Bildung von myelinisierten Axonen Segmente durch Doppelimmunfärbung mit Antikörpern gegen das Myelin-Basisprotein-Marker und neuronalen Marker 4-6.
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Representative Results
Das Flag-markierten extrazellulären Signal-bezogene Kinase 1 (Flag-Erk1) Konstrukt für Lentivirus Produktion verwendet wird durch Restriktionsenzym verdauen prüft der verwendeten Konstrukte, die sowohl die 2K7 Konstrukte und die für die Virusproduktion erforderlichen Verpacken und Zusatz-Konstrukte (Abbildung 3) .
Figur 3: DNA-Konstrukt Verifikation. Alle DNA-Konstrukte für die Produktion erforderlichen Lentivirus wurden aus Stbl3 Bakterien gereinigt und durch Restriktionsenzym-Verdau bestätigt. Zubehörteil und Verpackungsvektoren wurden mit NcoI und EcoRI verdaut, wie angedeutet, und im Vergleich zu ungeschnittenen Plasmid (A). 2K7-GFP wurde mit Spei und SacII (A) verdaut. 2K7-Flag-Erk1 DNA wurde durch Verdauung mit entweder SpeI oder SacII allein verifiziert oder durch Doppel-Verdau (B). Bandenmuster wurdenim Vergleich zu der erwarteten Entwicklung von virtuellen Verdauung der Konstrukt Sequenzen mit ApE Software generiert.
Zur Bestimmung der optimalen Verdünnung auf OPCs Verwendung wurde die Erk 1 Lentivirus in HEK293T-Zellen (Figur 4) titriert. Dies wurde durch Zugabe einer Reihe von viralen Verdünnungen HEK293T Zellen durchgeführt (Figuren 4A, 4C und 4D) oder OPCs (4B). Expressionsniveaus des Gens von Interesse Anstieg mit der Zeit (4D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 4: Titration von Flag-Erk1 Virus in HEK293T-Zellen und OPC. Flag-Erk1 Virus wurde in HEK293T-Zellen titriert (A, C, D) oder OPCs (B). HEK293T-Zellen (A) oder OPCs (B) wurden auf GFP-Expression 48 Stunden nach der Infektion mit Flag-Erk1 Virus abgebildet. HEK293T Zelllysate wurden auf die Anwesenheit von Erk1 oder Gesamt Erk1 / 2 nach 48 Stunden der Infektion (C) sondiert. HEK293T Zelllysate wurden auf die Anwesenheit des Flag, ERK1 / 2 und Actin als Ladekontrolle entweder 48 Stunden oder 96 Stunden nach der Infektion mit Flag-Erk1 Virus (D) untersucht. Diese Blots wurden alle geblottet und zusammen abgebildet werden, um einen direkten Vergleich der Expressionsniveaus in den beiden Zeitpunkten (D) zu erleichtern. Maßstab für (A) = 100 um. Maßstab für (B) = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Sobald die optimale Virusverdünnung bestimmt wurde, wurden gereinigte OPCs infiziert und kultiviert für mindestens 48 h zu erlauben Transgenexpression ausr erreicheniziente Ebenen, dann auf DRG Neuronen ausgesät ihre Myelinisierung Potential (5) zu bewerten. Einmal auf DRG-Neuronen ausgesät wird OPCs in Oligodendrozyten differenzieren, und beginnen, Myelinproteine, die durch Western Blot (5C) bewertet werden können zum Ausdruck bringen. Einige reife Oligodendrozyten wird myelinisieren, und dies kann durch MBP-Färbung (5D) visualisiert werden. Axone müssen auch mit einem Marker wie Neurofilament oder βIII-Tubulin (5D) gefärbt, um sicherzustellen, Axon Dichte wird bei der Analyse der Myelinisierung Ebenen getroffen werden.
Abbildung 5: OPCs wurden mit Flag-Erk1 Virus für 48 Stunden infiziert vor der Aussaat auf DRG-Neuronen. Schwester OPCs wurden entweder fixiert und für die Flagge und GFP (A) gefärbt oder lysiert und für Flag und Erk1 um zu überprüfen, untersuchtExpression des viral überexprimierten Protein (C). Co-Kulturen wurden nach 2 Wochen in Kultur fixiert und für βIII -Tubulin und MBP DRG Axone visualisieren und myelinisierenden sowie nicht-myelinisierenden Oligodendrozyten (B) gefärbt. A myelinisierenden Oligodendrozyten ist durch den Pfeil und einem nicht-myelinisierenden Oligodendrozyten deutet durch die Pfeilspitze (B) angegeben. Parallel Kokulturen wurden lysiert und die Myelinproteine MBP und MAG, sowie Flag und ERK1 / 2 abgetastet, um die Transgenexpression in der Co-Kultur (D) zu bestätigen. Eine Erhöhung Erk1 Ebenen nicht in der Co-Kultur sichtbar aufgrund der großen Mengen von DRG-abgeleitete Erk1 in Lysaten Maßstabsbalken = 20 & mgr; m vorhanden.
| Name | Zutaten | Aufzeichnungen |
| TE-Puffer pH 8 | 10 mM Tris pH 8 1 mM EDTA pH 8 | Make-up in VE-Wasser. |
| Polyethylenimin (PEI) | 1 g / L | Make-up in VE-Wasser, Filter sterilisieren und zu speichern Aktien bei -20 ° C. |
| LB Medium | 20 g Trypton 10 g Hefeextrakt 10 g NaCl | Stellen bis zu 2 L mit VE-Wasser |
| 50% Glycerin-Stamm | Glycerol | Machen Sie sich mit dem gleichen Volumen an entionisiertem Wasser und Autoklaven |
| HEK 293 T-Zell-Medium | DMEM 10% fötales Rinderserum 1% Penicillin / Streptomycin 1% L-Glutamin | |
| TNE Lysepuffer | 10 mM Tris pH 8 150 mM NaCl 1 mM EDTA pH 8 1% NP40 | Löse NP40 in einem kleineren Volumen an entionisiertem Wasser zuerst, wie es bei Kontakt mit Wasser zur Kristallisation gebracht. Make-up auf das Endvolumen in VE-Wasser |
| M1 | MEM 10% fötales Rinderserum 0,4% D-Glucose 2 nM L-Glutamat 1% Penicillin / Streptomycin | Für den Einsatz mit Ratten-DRG-Neuronen |
| mm1 | Neurobasalmedium 2% B27 (SM1) zu ergänzen 0,4% D-Glucose 2 nM L-Glutamat 1% Penicillin / Streptomycin | Für die Verwendung mit der Maus DRG-Neuronen |
| M2 | DMEM 10 mg / l Transferrin 5 mg / l Insulin 20 nM Progesteron 100 uM Putrescin 10 uM FdU 10 & mgr; M Uridine | Bilden M2 in einem größeren Volumen DMEM ohne FdU und Uridin zur Verwendung über 1-2 Monate. Fügen FdU und Uridin zu kleineren Volumina, die innerhalb von 2 Wochen fertig sein kann |
| mM2 | mm1 10 uM FdU 10 & mgr; M Uridine | Fügen FdU und Uridin, kleinere Mengen an Medium, das innerhalb von 2 Wochen fertig sein kann. |
| MT-10x PBS pH-Wert 7,4 | 28,48 g / l (160 mM) Na 2 HPO 4 · 2H 2 O 5,52 g / l (40 mM) NaH 2 PO 4 · H 2 O 87,66 g / l (1,5 M) NaCl | In den VE-Wasser und pH-Wert auf 7,4 mit 10 N NaOH |
| 1x MT-PBS | 10x MT-PBS VE-Wasser | Verdünnen 10x MT-PBS 1:10 in entionisiertem Wasser auf 1x MT-PBS zu machen |
| 10x Boratpuffer (1,5 M) | 18,55 g Borsäure 1x MT-PBS | Auflösen von Borsäure in 150 ml 1x MT-PBS. Auf pH 8,56 mit 10 N NaOH und bringe das Endvolumen auf 200 ml mit 1x MT-PBS. Autoklav |
| 1x Boratpuffer (0,15 M) | 10x Boratpuffer 1x MT-PBS | Bereiten 100 ml dieses Puffers zu PLN in aufzulösen. In 10 ml 10x Boratpuffer (pH 8,56) auf 90 ml 1x MT-PBS |
| 0,5 mg / ml Poly-L-Ornithin (PLN) | 50mg Poly-L-Ornithin Hydrobromide 0,15 M Boratpuffer (pH 8,56) | Man löst 50 mg Poly-L-Ornithin-hydrobromid in 100 ml 1x Boratpuffer. Filter zu sterilisieren (0,22 um Filter) und bei 4 ° C für bis zu einem Monat |
| 100x Poly-D-Lysin (PDL) | 5 mg Poly-D-Lysin Steril, VE-Wasser | 100x PDL Aktien können bei -20 ° C in Einweg-Aliquots eingefroren werden. Bei der Verwendung zu verdünnen, um in sterilen, VE-Wasser 1x |
| Papain-Puffer | Siehe Tabelle 2 | |
| DNase | 12.500 U DNase I 1 ml EBSS | Auf Eis, lösen die DNase I in 1 ml gekühltes EBSS. Aliquot (beispielsweise 300 & mgr; l / Röhrchen) und gefrier Nacht bei -20 ° C. Lagerung bei -20 ° C. |
| 4% BSA | 8 g BSA 200 ml DPBS | Löse das BSA in 150 ml DPBS bei 37ºC. Den pH-Wert auf 7,4 mit ~1 ml von 1 N NaOH. Bringen Sie das Volumen auf 200 ml. Man filtriert durch ein 0,22 um Filter zu sterilisieren. Stellen Sie 1 ml-Teilmengen und bei -20 ° C. |
| 10x Lo Ovomucoid | 3 g BSA 200 ml DPBS 3 g Trypsin Inhibitor | Fügen BSA auf 150 ml DPBS und gut mischen. Fügen Trypsininhibitor und mischen sich aufzulösen. Hinzufügen ~ 1 ml 1 N NaOH, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen. Bringen Sie das Volumen auf 200 ml mit DPBS. Filter-Sterilisierung durch ein 0,22 um-Filter. Stellen Sie 1 ml-Teilmengen und bei -20 ° C. |
| 6x Hallo Ovomucoid | 6 g BSA 200 ml DPBS 6 g Trypsininhibitor | Fügen BSA auf 150 ml DPBS und gut mischen. Fügen Trypsininhibitor und mischen sich aufzulösen. Hinzufügen ~ 1 ml 1N NaOH, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen. Bringen Sie das Volumen auf 200 ml mit DPBS. Filter-Sterilisierung durch ein 0,22 um-Filter. Stellen Sie 1 m Teilmengen und bei -20 ° C. |
| SATO Basis | Siehe Tabelle 3 | |
| SATO Medien (rat) | 1% SATO Basis 1% Penicillin / Streptomycin 1% 0,5 mg / ml Insulin 1% L-Glutamin 0,1% NAC 0,1% Biotin Make-up mit DMEM und Filter zu sterilisieren. | |
| SATO Medien (Maus) | 1% SATO Basis 1% 0,5 mg / ml Insulin 1% Penicillin / Streptomycin 1% L-Glutamin 0,1% NAC 0,1% Biotin 0,1% Spurenelemente B 2% B27 Make-up mit DMEM und Filter zu sterilisieren. | |
| Insulin | 10 mg Insulin 20 ml steriles Wasser deionzed | Fügen Sie Insulin zu entionisiertem Wasser und mit 100 ul 1 N HCl, damit das Insulin zu lösen. Gut mischen. Man filtriert durch ein 0,22 um Filter und bei 4 ° C für 4-6 Wochen |
| NAC (N-Acetyl-L-Cystein) | 5 mg / ml NAC DMEM | Lösen Sie NAC in DMEM, eine 5 mg machen/ Ml Lösung, aliquotieren und bei -20 ° C. |
| d-Biotin | 50 ug / ml Biotin Steril, VE-Wasser | Auflösen Biotin in Wasser, um eine 50 ug / ml Lösung, aliquotieren und bei -20 ° C zu machen. |
| CNTF (ciliary neurotrophic factor) | 10 ug / ml CNTF 0,2% BSA in DPBS | Verdünne CNTF, um eine 10 & mgr; g / ml-Lösung mit steriler 0,2% BSA in DPBS machen. Aliquot, Flash Einfrieren in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. |
| PDGF (Plättchenwachstumsfaktor) | 10 ug / ml PDGF 0,2% BSA in DPBS | Verdünnen PDGF Master Lager (nach Herstellerangaben vorbereitet) bis 10 ug / ml mit steriler 0,2% BSA in DPBS. Aliquot, Flash Einfrieren in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. |
| NT3 (Neurotrophin-3) | 1 & mgr; g / ml NT-3 0,2% BSA in DPBS | Verdünnen NT3 Master stock (entsprechend den Anweisungen des Herstellers hergestellt) in 1 & mgr; g / ml mit steriler 0,2% BSA in DPBS. Aliquot, Flash Einfrieren in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. |
| Forskolin | 50 mg Forskolin Steriles DMSO | 1 ml sterile DMSO auf die 50 mg Flasche Forskolin und gut mischen, um vollständig zu suspendieren. Transfer zum 15-ml-Röhrchen und fügen Sie 11 ml steriles DMSO, um eine Konzentration von 4,2 mg / ml zu erreichen. Aliquotieren und bei -20 ° C. |
Tabelle 3. Stammlösungen.
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Discussion
Myelinisierung von Axonen ist eine entscheidende Prozess für die optimale Funktion von sowohl den zentralen und peripheren Nervensystems von Wirbeltieren. Die Erzeugung und Wartung von myelinisierten Axonen ist ein komplexer Prozess, und koordinierte molekulare Wechselwirkungen zwischen neuronalen, glialen (von Schwann-Zellen oder Oligodendrozyten) und extrazellulären Matrixproteinen. Die Bedeutung und die Anwendbarkeit dieses Protokolls ist, dass es ermöglicht die Manipulation von Proteinen in einem spezifischen Zelltyp innerhalb der Misch Kokultur Einstellungen. Da mehrere Zelltypen sind in der Myelinisierung in vivo und in in vitro Myelinisierung Assay beteiligt sind, mit einer stumpfen pharmakologische Werkzeuge, die Aktivität von bestimmten Proteinen blockieren oder Signalwege keine einzelnen Informationen liefern über den Einfluss, dass Proteine üben auf die Myelinisierung von entweder einer neuronalen oder glial perspektivische, sofern das Protein eindeutig durch einen Zelltyp exprimiert. Somit ist die in vitro als Myelinisierungsagen wir in Verbindung mit der Verwendung von Lentivirus spezifisch transduzieren OPCs erlaubt uns, die Wirkung abzufragen daß oligodendroglial Proteine üben auf die Myelinisierung. Wir haben erfolgreich 2K7 Lentivirus verwendet, um bestimmte Proteine spezifisch in Oligodendrocyten für die in vitro Myelinisierung Assay verwendet, um die Wirkung, dass oligodendroglial Signale bei CNS Myelinisierung 9 ausüben sezieren überexprimieren.
Um reproduzierbare Ergebnisse bei der transduzierten OPC in vitro Myelinisierung Assay zu erreichen, wird die Optimierung für jeden Schritt des Protokolls aus der Klonierung durch Sezieren und OPC- Aussaat erforderlich. Es ist zwingend notwendig, dass auf der Ebene der DNA, die pENTR Vektor, der die markierten interessierenden Gen-Konstrukt wird sequenziert und die 2K7 DNA mit der markierten Gen von Interesse wird durch Western-Blot auf die Expression des Tags und des Gens von Interesse kontrolliert, vor der Verwendung des DNA-Virus zu erzeugen. Es ist wichtig, entweder HEK293Tcells oder HEK293 wählenFT-Zellen, um das Virus zu erzeugen und wachsen unter Mykoplasmen freie Umgebung. Nach der Herstellung von Lentivirus ist es wichtig, jede Charge von Virus zu titrieren, um die optimale Verdünnung auf OPCs verwendet bestimmen. Dies kann durch Hinzufügen einer Reihe von viralen Verdünnungen HEK293T Zellen oder OPCs erfolgen. Da die 2K7 Konstrukt enthält sowohl das Gen von Interesse und GFP, kann die Wirksamkeit der Transduktion durch die Expression von GFP durch Fluoreszenzmikroskopie und durch Untersuchen der Expression des Tags und des interessierenden Gens durch Western-Blot-Analyse beurteilt. Hellere GFP + -Zellen mit höheren Viruskonzentrationen sichtbar werden, da es möglich ist, mehrere Viruspartikel, um eine einzelne Zelle zu infizieren. Verifizierung der Expression von GFP durch Fluoreszenzmikroskopie ist ein nützlicher Indikator der Virustiter und die Expression von GFP, kann aber nicht als Ersatz für die Kontrolle der Expression des Proteins von Interesse verwendet werden. Es ist daher wichtig, das Expressionsniveau des Proteins von Interesse in beiden HEK293T Zellen verifizierenOPCs und durch Western-Blot-Analyse. Wenn das Protein von Interesse endogen von Neuronen in den Co-Kulturen ausgedrückt, kann die Überexpression von OPCs / OLs maskiert werden, wenn die Analyse der Co-Kultur-Lysat durch Western-Blot; so ist es wichtig, entweder markieren das Protein von Interesse oder Kultur die Schwester OPCs folgenden Aussaat so die Expression des Proteins von Interesse in den Schwester OPCs überprüft werden, wenn nicht in der Co-Kultur.
Die Qualität sowohl der DRG und OPC Kultur direkt bestimmt, ob die Versuche erfolgreich ist. In der Co-Kultur-Einstellungen können Ratten-DRG-Neuronen mit OPCs entweder von Ratte oder Maus abgeleitet kokultiviert werden. OPCs erfordern sanfte und schnelle Handhabung. Es ist wichtig, den Virustiter für OPC optimieren zu wenig nicht wirksam transduzieren die OPCs, die zu niedrigen Niveaus der Expression des Proteins von Interesse und zuviel Virus toxisch OPCs so gibt es zu wenige Zellen auf die Neuronen Samen. Beide dieser suboptimalen Transduktionen kann Result in unanalyzable oder geringfügige Änderungen in der Myelinisierung oder Myelin-Protein-Expression. OPCs zu unterscheiden, wenn sie sich über konfluent und kann nicht ausgesät, nachdem sie unterschieden haben, wodurch die Anzahl der OPC kultiviert und transduzierten Anforderungen an die Umweltbedingungen optimiert werden. Es ist wünschenswert, die gleiche Anzahl von OPCs für jede Myelinisierung Assay ermöglicht den direkten Vergleich der Anzahl der myelinisierten Axonen Segmente Saatgut zwischen Bedingungen über mehrere Versuche verglichen werden.
Ein potentieller Nachteil dieser Technik ist die Variabilität der basalen Myelinisierung Niveaus zwischen Myelinisierung Assays. Nach einer Virusübertragung wird das Grundniveau der Myelinisierung verringert, was darauf hindeutet, daß virusinfizierte OPCs nicht so gut wie die myelinisieren naiven (nicht-viralen infiziert) OPCs. Dies kann durch Quantifizieren des Ausmaßes der Myelinisierung bezug auf das Grund Myelinisierung in jedem Assay überwinden. Somit muss der leere Vektor, der nur GFP exprimiert als interner contr verwendet werdenol. Neben Myelinisierung kann die Expression eines Proteins von Interesse auch andere Aspekte des OPCs wie Überleben, Proliferation und Differenzierung zu beeinflussen, was zu einer indirekten Effekt auf die Myelinisierung. Daher sollten Analyse OPC Verhalten wie die Lebensfähigkeit der Zellen parallel zu Myelinisierung Tests durchgeführt werden.
Die hier beschriebenen viralen Transduktion Verfahren sind nicht auf die Untersuchung von Oligodendrozyten Myelinisierung beschränkt; in der Tat kann es ausgedehnt und aufgetragen zu anderen Zelltypen, wie Schwann-Zellen, Astrozyten und Neuronen zu untersuchen, während die Optimierung kann für einzelne Zelltyp erforderlich ist. Dieses Protokoll bietet eine große Flexibilität, um Zellverhalten wie Proliferation und Differenzierung durch selektive Überexpression eines Proteins von Interesse (Wildtyp oder Mutante) in dem gewünschten Zelltyp, der bei Verwendung einer gemischten Zellkultursystem besondere Vorteile hat studieren. Die Zellen, die für die Transduktion verwendet werden, können entweder aus der Ratte oder isoliert werdenMaus (Wildtyp oder transgenen), so dass für die gezielte Untersuchung von Signal- und Kompensationsmechanismen in transgenen Tieren, die in der Regel nur schwer zu erreichen ist, und noch viel mehr Zeit in Anspruch als die Verwendung eines in vivo transgenen Mausmodell. Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass der lentivirale basierte Strategie wurde erfolgreich für die Zellübertragung im Tiermodell 13 verwendet, was auf eine starke Potenzial der Transduktion oligodendroglialen Zellen mit den lentiviralen Ansätze in vivo.
Zusammenfassend, die Kombination der In-vitro-Assays mit Myelinisierung Lentivirale Infektion von OPCs eine strategisches Instrument für die Analyse der molekularen Mechanismen in Myelinisierung beteiligt. Die Rolle von spezifischen Proteinen in Myelinisierung abgefragt werden und als OPCs kann von Ratten und Mäusen isoliert werden zur Verwendung auf Ratten DRG Kokulturen, das lentivirale Ansatz kann auch in Kombination mit Knockout-Technologie in verschiedenen Mauslinien zu mech abzufragen verwendet werdennismen der Entschädigung in den Prozessen der Myelinisierung.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2K7 lentivector | Kind gift from Dr Suter9 | ||
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100mg | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115545205 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11012 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518-5G | |
| B27 - NeuroCul SM1 Neuronal Supplement | Stem Cell Technologies | 5711 | |
| BDNF (Human) | Peprotech | PT450021000 | |
| Biotin (d-Biotin) | Sigma Aldrich | B4639 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4161 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-100G | |
| CNTF | Peprotech | 450-13020 | |
| DAKO fluoresence mounting media | DAKO | S302380-2 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Life Technologies | 10313039 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-375KU | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Life Technologies | 14040182 | |
| EBSS | Life Technologies | 14155063 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101 | |
| Entry vectors for promoter and gene of interest | Generate as per protocols 1-2 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886-50MG | |
| Glucose (D-glucose) | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycerol | Chem Supply | GL010-500M | See stock solutions |
| Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115005003 | |
| Goat Anti-Mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115005020 | |
| Goat Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 112005167 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Igepal | Sigma Aldrich | I3021-100ML | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Laminin | Life Technologies | 23017015 | |
| LB Medium | See stock solutions | ||
| LB-Agar | See stock solutions | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-7477 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415064 | |
| L-Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| L-Glutamine- 200 mM (100x) liquid | Life Technologies | 25030081 | |
| LR Clonase II Plus enzyme | Life Technologies | 12538-120 | |
| MEM, NEAA, no Glutamine | Life Technologies | 10370088 | |
| Mouse α βIII Tubulin | Promega | G7121 | |
| Mouse αMBP (monoclonal) | Millipore | MAB381 | |
| Na pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| NAC | Sigma Aldrich | A8199 | |
| NcoI-HF | NEB | R3193S | |
| NEBuffer 4 | NEB | B7004S | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| NGF (mouse) | Alomone Labs | N-100 | |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | |
| O1 antibody - Mouse anti-O1 | Millipore | MAB344 | Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable |
| O1 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning | ||
| O4 antibody - Mouse anti-O4 | Millipore | MAB345 | Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable |
| O4 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning | ||
| Competent cells | Life Technologies | A10460 | |
| One Shot Stbl competent cells | Life Technologies | C7373-03 | |
| Papain Suspension | Worthington/Cooper | LS003126 | |
| pBR8.91 | Kind gift from Dr Denham10 | ||
| PDGF-AA (Human) | Peprotech | PT10013A500 | |
| Penicillin-streptomycin 100x solution | Life Technologies | 15140122 | |
| pENTRY4IRES2GFP | Invitrogen | 11818-010 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727-100ML | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | |
| Protease inhibitor tablet (Complete mini) | Roche | 11836153001 | |
| Proteinase K | Supplied with Clonase enzyme | ||
| Putrescine | Sigma Aldrich | P-5780 | |
| Rabbit α neurofilament | Millipore | AB1987 | |
| Rabbit αMBP (polyclonal) | Millipore | AB980 | |
| Ran2 hybridoma cells | ATCC | TIB-119 | Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning |
| Rat anti CD140A/PDGFRa antibody | BD Pharmingen | 558774 | |
| SacII | NEB | R0157 | |
| SOC medium | Supplied with competent bacteria | ||
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| Spe I | NEB | R0133S | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Buffer | NEB | B0202S | |
| TE buffer pH8 | See stock solutions | ||
| TNE lysis buffer | |||
| Trace Elements B | Cellgro | 99-175-CI | |
| Transferrin (apo-Transferrin human) | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
| Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White | Roche | 10109878001 | |
| Trypsin-EDTA (1x), phenol red (0.05%) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 | Vector laboratories | L-1100 | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003-5G |
References
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Lee, K., et al. MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).
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- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Xiao, J., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes. Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).
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- Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture methodes for the study of myelination. , MIT Press. Cambridge, MA. (1991).
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- Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
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