في هذا الفيديو، ونحن تصف الإجراء لزرع غرفة التصوير الضوئي مزمنة على الحبل الشوكي الظهري على فأرة الحاسوب الحية. تتم مراجعة الغرفة، إجراء العمليات الجراحية، والتصوير المزمن وأظهر.
Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.
الوقت الفاصل في الجسم الحي المجهري في الكائنات سليمة تمكن رؤية مباشرة من العمليات البيولوجية المعقدة التي لا يمكن الوصول إليها لالتقليدي تحليل نقطة لمرة واحدة، مثل المناعية. على وجه التحديد، المجهري متعدد الفوتون (MPM) 1 يسمح للتصوير في نثر الأنسجة، مثل القشرة المخية الحديثة القوارض، حيث تحقق التصوير تصل إلى 2،3 والتي تزيد من 4 1 مم. عندما جنبا إلى جنب مع الاستعدادات الجراحية 5-7 التي إجراء واحد يسمح بالوصول البصري إلى الدماغ لمدة أسابيع أو شهور، وقد استخدمت هذه الأساليب المجهر لدراسة العمليات الدينامية في الدماغ في الدول السليمة والمريضة 8-11. وبالإضافة إلى ذلك، تم وضع بروتوكولات 12،13 التي توفر للتصوير في الجسم الحي في مستيقظا (أي غير تخدير) الحيوانات، والسماح لالخلوية القرار التصوير وظيفية خلال المقايسات السلوكية. وقد استخدمت هذه البروتوكولات لcomparisإضافات من مترابطة نشاط الخلايا العصبية 14، نجمية الكالسيوم مما يشير إلى 15 في الحيوانات تخدير ومستيقظا، وتحديد مهمة محددة مجموعات الخلايا العصبية 16، وقدرة الخلايا العصبية لتميز موقع الكائن على الخط الطولي التحفيز 17.
ونظرا للإمكانات هذا النهج لتوضيح آليات صحية ومرضية، والوقت الفاصل بين التصوير في الجسم الحي تم تطبيقها على الحبل الشوكي الماوس (SC)، والسماح لتحديد انحطاط محور عصبي حاد (AAD) كآلية المرض 18. التحقيق دراسات لاحقة آثار الآفات المحيطية على العقد الجذرية الظهرية (DRG) محور عصبي تجديد 19، ودور الأوعية الدموية في محور عصبي تجديد 20، الكيميائي الدبقية ردا على إصابة 21، والهجرة T-خلية في التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) 22، والنشاط من الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية 23،24 25 ردا على amyotrophالتصلب الجانبي جيم (ALS)، ودور STAT-3 في تبرعم محور عصبي بعد SC إصابة (SCI) 26، وآلية من فقدان محور عصبي والانتعاش في EAE 27. وعلى الرغم من نجاح هذه المناهج، وجميع هذه الدراسات تقتصر على إما جلسة التصوير واحدة، مما يحد من الدراسات لديناميكية على المدى القصير، وإلا اللازمة المتكررة الفتحات الجراحية للحيوان في كل نقطة زمنية التصوير، مما يحد من عدد من النقاط الزمنية الوصول إليها ويزيد من احتمال من التحف التجريبية التباس. وقد نشرت البروتوكولات لهذه العمليات الجراحية سابقا 28،29.
في الآونة الأخيرة، نشرنا تقنية 30 لغرس غرفة العمود الفقري المزمنة التي مكنت الوقت الفاصل بين التصوير MPM في SC الماوس فوق أسابيع عدة دون الحاجة إلى تكرار عملية جراحية. لفترة وجيزة، وشملت هذه إعداد الجراحية أداء الثقب في العمود الفقري الصدري السفلي وغرس غرفة من أربعة أجزاء. الغرفة شملتثلاثة أجزاء الفولاذ المقاوم للصدأ خصيصا تشكيله التي فرضت فقرات المحيطة الثقب، وساترة الزجاج توضع فوق SC والمضمون مع سيليكون المطاط الصناعي. هذه التقنية سمحت للتصوير روتيني إلى أكثر من 5 أسابيع بعد العمل الجراحي في حالات صحية والجرحى دون الحاجة لتكرار عملية جراحية. عدد نقاط وقت التصوير كان محدود فقط من التردد الذي الحيوان يمكن أن يتسامح مع تحريض التخدير. تم تصوير حياة محدودة بسبب نمو، النسيج الليفي كثيفة على سطح SC. وبالإضافة إلى ذلك، نحن التحقق من أن عملية الزرع الجراحي لم يكن لها تأثير على المدى الطويل على وظيفة الحركة.
منذ نشر لدينا الأولي، وقد وصفت النهج البديلة أيضا تمكين التصوير طويل الأجل في أماكن أخرى SC 31-33. يوضح هذا البروتوكول إجراءاتنا لزرع الغرفة العمود الفقري وضعنا.
هذه التقنية أثبتت هنا تسمح المتكررة، الوقت الفاصل، في الجسم الحي التصوير من ظهري الماوس SC إلى عدة أسابيع بعد الجراحة دون الحاجة إلى عمليات جراحية لاحقة. يمثل هذا الإجراء تحسنا كبيرا خلال دراسات التصوير تكرار جراحة أو على النهج النسيجية portmortem، حيث يتم فقدان المعلومات عن ديناميات الخلوية. لدينا في السابق 30 أثبتت قيمة هذه التقنية لدراسة SCI علم الأمراض في الجسم الحي.
تم تحديد أقصى مدى الطولي للتصوير من خلال نمو لذلك، النسيج الليفي كثيفة على السطح الظهري للSC. مع مرور الوقت، وأدى هذا النمو إلى فقدان النقيض من الصورة والقرار. كما تم رأيت هذا النمو في الأعمال التحضيرية الجراحية البديلة 31. الروايات المتناقلة، لاحظنا أن هذا النمو يمكن التقليل من غسل بعناية السطح الظهري SC لإزالة منتجات الدم، وختم سطحقطع العظام مع cyanoacrylate، وختم حواف من الغرفة جيدا مع السيليكون والمطاط الصناعي، والتقليل من الفضاء الخلالي بين SC الظهرية وغطاء زجاجي.
في الآونة الأخيرة، فقد ثبت مقاربة أخرى مماثلة لمنطقتنا باستخدام غرفة البولي 32. استخدام البولي هو مفيد لأنه متوافق مع الأشعة السينية وطرائق التصوير الصوتية، وهي ليست الحال بالنسبة لأجزاء لدينا الفولاذ المقاوم للصدأ. ومع ذلك، مع التكنولوجيا الآن في كل مكان من الطابعات 3D، يمكن أن تكون ملفقة أجزاء الغرفة من مجموعة واسعة من المواد لتتناسب مع احتياجات محددة. لقد طبعت مؤخرا جميع أجزاء لدينا في فوتوبوليمير واضح.
عيب واحد رئيسي في غرفة مغلقة هو عدم القدرة على إدارة جرعات متكررة من الأدوية أو الأصباغ الخارجية مناسبة لSC التصوير 34. ومع ذلك، من خلال الاستفادة من الاستقرار الميكانيكي للنظام الحالي دينا، ونحن قد استخدمت بالفعل لدينا غرفة الحالية إلى النجاحلاي ترسيخ قسطرة داخل القراب متصلة تحت الجلد المزروع ميناء حقن، مما سمح لتسليم المخدرات في نقاط زمنية متعددة حتى في نظام الدائرة المغلقة (عمل غير منشورة). وعلاوة على ذلك، نظرا لطبيعة وحدات من الصفيحة العلوية، سوف الإصدارات المستقبلية من هذا المستحضر تشمل غرفة الأغلاق للسماح لتطبيق المتكررة من كل من العوامل العلاجية والعلامات الفلورية. ومن الممكن أيضا أن نتصور العليا لوحات مع تصاعد لتسجيل الأقطاب، وتدرج البصرية، ومنافذ لتوصيل الدواء. ان مثل هذه الإضافات من المرجح أن تكون أكثر تحديا لتنفيذ باستخدام نظام أكثر الحد الأدنى من Fenrich وآخرون. 31. وفي الختام، تقدم غرفة لدينا منصة بوابة التي تقوم عليها ويمكن أن تستند التجارب المتنوعة.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-04 | |
forceps, scissors, scalpel, etc. | Fine Science Tools | multiple | |
retractor kit -magnetic fixator | Fine Science Tools | 18200-02 | |
retractor kit -retractor | Fine Science Tools | 18200-09 | other retractors may also be used |
retractor kit -elastomer | Fine Science Tools | 18200-07 | |
feedback controlled heating blanket | CWE Inc. | Model: TC-1000 Mouse Part No. 08-13000 | |
stereotax | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber holders | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
Cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite 495 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder) | Teets | Mfg. Part: 8101 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid) | Teets | Mfg. Part: 8501 | multiple suppliers |
Glycopyrrolate | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602) | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
Bupivacaine | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 029841 (Hospira 116301) | |
Ketoprofen | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193) | |
Dexamethasone | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032) | |
KwikSil Elastomer | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
KwikSil Mixing Tips | World Precision Inc. | KWIKMIX |