一个程序，植入脊柱商会纵<em>在体内</em>鼠标脊髓成像

Summary

在这段视频中，我们描述了植入一种慢性的光学成像室在活老鼠的脊髓背侧的过程。室，外科手术，慢性成像的审查和论证。

Abstract

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

Introduction

时间推移在体内显微镜在完整有机体使复杂的生物过程是不可访问的，以传统的单时间点分析，如免疫组织化学的直接可视化。具体地，多光子显微镜（MPM）的¹允许成像散射组织，如啮齿动物新皮层，其中，成像高达^2,3和超过⁴¹毫米已经实现。当与外科制剂^5-7，其中单个程序允许光进入大脑数周至数月合并，这些显微镜方法已被用于研究在大脑中的健康和疾病状态^8-11的动态过程。此外，协议已经开发^12,13提供用于体内成像在清醒（ 即非麻醉）的动物，从而允许在行为分析蜂窝分辨率功能成像。这些协议已被用于comparis相关神经元活动的¹⁴项，星形胶质细胞中的钙和麻醉清醒动物信令^15，该识别特定任务的神经元集群^16，和神经元的能力，以在晶须刺激¹⁷辨别对象的位置。

给出了这种方法的潜在澄清健康和病理机制，时间推移的体内成像施加到小鼠脊髓（SC），允许对急性轴突变性的识别（AAD），为疾病机制^18。随后的研究调查了周围性病变对背根神经节（DRG）轴突再生^19，血管在轴突再生²⁰的作用，趋化胶质响应损伤^21，在实验性自身免疫性脑脊髓炎的T细胞迁移^{（EAE）22，}活动的效果小胶质细胞在响应于amyotroph ^23,24和²⁵的星形胶质细胞IC侧索硬化症（ALS），STAT-3在SC损伤^（SCI）26后的轴突出芽的作用，以及轴突丢失和恢复在EAE ²⁷的一个机构。尽管这些方法的成功，所有这些研究仅限于任一单一成像会话，从而限制了研究，以短期动态，否则需要在每个成像时间点重复该动物的手术开口，限制访问的时间点的数目并增加混杂实验文物的可能性。协议，这些手术已经预先^28,29出版。

最近，我们公布的技术³⁰为一种慢性脊髓室，其使能在小鼠的SC在多个周的时间推移的MPM成像而不需要重复手术植入。简单地说，这个手术准备包括执行椎板在较低的胸椎和四部分腔着床。包括室3定制加工的不锈钢​​零件夹紧围绕椎板椎骨和玻璃盖玻片放置在SC和固定用硅氧烷弹性体。这种技术允许用于常规成像出在健康和受伤状态术后多于5周而不需要重复手术。的成像时间点的数目仅由在该动物能耐受麻醉诱导的频率的限制。成像寿命是由致密，纤维组织在SC的表面生长的限制。此外，我们验证了外科植入对运动功能没有长期的效果。

自从我们最初发布，其他方法还使长期成像在SC已经在其他地方^31-33描述。该协议证明了我们的程序植入我们开发了脊髓腔。

Protocol

注：护理和实验操作本文所有小鼠被批准康奈尔大学机构动物护理和使用委员会。 1.设置外科手术消毒用高压锅或批准的消毒程序所需的所有工具。至少，包括解剖刀，剪刀，万纳剪刀，镊子，珠宝商的螺丝刀，棉签，一套拉钩的，植入物（ 图1A）和它的传送系统（ 图1D，E）。 擦拭所有表面，包括任何立体镜旋钮，用70％的乙醇和/或合适的消毒剂。 通过叠置定制stereotax（ 图1D）和围绕台式用无菌窗帘创建一个无菌区。加热垫（优选反馈控制）应放置在stereotax的顶部和下无菌布帘。 2.准备鼠标外科手术麻醉下的5％异氟醚/氧气鼠标的感应室，直到呼吸减慢速度约1呼吸/秒。 转印鼠标到分段区域远离无菌区，用鼻锥，继续异氟醚暴露。减少异氟烷至2％。适用眼药，以防止角膜干燥。 在0.05毫克/ 100g的鼠施用格隆（抗胆碱能药物）肌内成使用29后肢 – 地下30针和3/10毫升注射器，每肢注射量的递送约50％。 注：格隆溴铵用于防止流体积聚在肺中，而鼠标是在麻醉下。 使用电剪，2厘米宽，并集中在胸主动脉弓剃鼠标的背侧，大约3厘米长的部分。清洁任何修剪头发远离剃的区域。 管理下列注射皮下和远端的剃贴片使用29 – 地下30的针头和3/10立方厘米注射器1毫升/ 100克鼠标5％葡萄糖盐水中（对于水合），5mg / kg的小鼠的酮洛芬（一种NSAID镇痛），0.2毫克/千克小鼠塞米松（抗炎类固醇，以减轻炎症）。 使用棉签，执行碘和70％乙醇的三个交替洗涤，等待1分钟在洗涤之间。 施用100μl的0.125％布比卡因（一外周神经阻滞）皮下使用29 – 地下30针和3/10毫升注射器的剃贴片的中心，以减少疼痛，在切口部位。 传输鼠标自定义stereotax（ 图1D），插入直肠温度计，并等待大约10分钟的布比卡因生效。 3.揭露和清理的3个相邻胸椎的背纹层使用手术刀刀片，创建一个小的（5毫米或更小）的切口的兴趣（ 图2A）在椎骨上方。 <li>使用或者镊子或通过插入外科剪刀的尖端和扩展的把手，增加通过钝器解剖中的开口的皮肤的大小。 使用手术刀或手术剪，轻轻地分解皮肤和下面的肌肉之间的结缔组织筋膜。 用拉钩忍住皮肤，允许尽可能大的工作区域越好（ 图2B）。小心不要增加负载的胸部，从而阻碍呼吸。 用一对镊子，把手喙最椎骨将通过上覆的肌肉被暴露。使用手术刀，切离组织上背进程从所有3椎骨（ 图2c）两侧。 使用的手术刀刀片，棉签，和/或骨刮刀任何组合，除去从背薄片（ 图2D）的所有组织覆盖。 用手术剪刀，小心切掉连接到脊椎骨上都拉泰拉筋脊柱（ 图2E）的升边沿。 使用手术刀，轻轻地从脊柱尽可能的横向边缘，以便提供一个清洁的夹紧表面除去尽可能多的组织。 轻轻清创使用骨刮刀和/或棉签任何剩余的软组织的椎骨。剪掉其他地方使用手术剪（ 图2F）任何不协调的组织。 注意：这是既夹紧和执行所述背侧椎板的椎骨被干净地暴露必不可少的。一个cauterizer可能在随后的控制出血有用。 移拉钩忍住周围除了皮肤（ 图2F）的脊柱组织。 附着在交付职位植入侧栏的插脚，并加载这些后入者（ 如图1E）。 采用侧杆夹住3椎体，运用足够的压力来保存securelY（ 图2G，H）。使用镊子，以帮助确保3椎骨的电平钳位。需要注意的是多次尝试可能是必要的。确保该侧杆都是水平和平行之前执行椎板切除术。 仔细清洁和干燥用棉签夹紧的椎骨的背水面。 4.执行背椎板切除术插入vannas剪刀的前端到内侧夹紧椎骨的硬膜外腔和挤压手柄轻轻;如果骨是干的，它应当沿背薄片的长度开裂。重复在对侧此过程释放层。 轻轻地握住松层的背过程钳，小心切掉任何结缔组织的椎板的喙和尾两端，抬起它拿走。 用0.9％的盐水和/或人造脑脊髓液（ACSF），彻底洗去任何血液overlyi纳克脊髓。用棉签吸收多余的液体。 使用vannas剪刀，小心地修剪骨的横向边缘后面的植入物的侧杆。再次，洗去和控制用棉签和盐水/学联出血。 地下30针 – 倘骨膜的一部分已经脱落，覆盖脊髓，用棉签和/或29轻轻取出这个组织。小心不要弄伤脊髓在程序的这一部分。不要混淆宽松与骨膜包裹严实硬脑膜。 仔细，密封骨的剩余暴露边缘的一个或两个的牙科丙烯酸和氰基丙烯酸酯（ 图2I）的。请特别小心不要让胶水流到暴露脊髓。 5.密封商会小心地定位在顶板，使得4个插槽排列起来的4个孔上的侧杆和开口覆盖的露出旋人线（ 图1B和2J）。 使用珠宝商的螺丝刀，小心启动第一螺丝，稳定螺丝刀的轴与另一对钳。不拧紧螺丝在这个阶段，但将其插入，使最初的几个螺纹接合。对于其他3个螺丝重复此过程。 注：这是非常有用的使用钛或其他非磁化钳帮位置的螺丝在这个阶段。 有了所有的4个螺丝，拧紧小的增量每个螺丝交替相同的量，直到螺丝紧固（ 图2K）。需要注意的是它是不寻常的顶板到在此过程中弯曲。小心不要将螺丝拧得太多，因为螺钉头可​​断和过度下行压力将打跑钳和/或导致脊髓损伤。 使用有机硅弹性体以填充脊髓和玻璃窗之间的空间。因为它母鹿在固化过程中不是产生醋酸，使用KwikSil品牌弹性体和混合的技巧。适用的有机硅的自由部分，以暴露脊髓。照顾摆脱含气泡从混合头之前施加到脊髓的任何硅氧烷。 工作迅速，轻轻按下一个5毫米＃0盖玻片到顶板的插图。施加足够的压力，以逐渐挤压液态弹性体以包围脊髓，但不会导致脊髓压迫（ 图2L）。设置时间弹性大约为90秒，所以要确保盖玻片迅速应用。 在一个密封失败的情况下，等到弹性体已成立，轻轻地从用钳子取出植入物，重复5.4 – 5.5。 覆盖渗出弹性体的牙科丙烯酸/腈基丙烯酸酯的边缘并附着到周围骨尽可能防止弹性体从移在脊髓的表面上。 除去拉钩和拉扯皮肤围绕所述植入物的边缘。使用氰基丙烯酸酯，附着在皮肤到植入物（ 图2M，N）的边缘。 插入＃0-80 – 1/4“设置螺钉插入顶板的翼（ 图1C和图2 0）。 使用牙科丙烯酸，密封在顶板（ 图2P）的螺旋槽的缝隙。 6.术后护理在一个大笼子里干净去除麻醉和地方的动物。确保笼足够大，使得该腔室将不会在任何抽丝（如V形浸一水瓶和/或食物）的正常运动的过程中在整个笼中。 注：一个标准的鼠笼是理想的。 将笼上加热表面，而动物恢复。不鼠标返回到其他动物的公司，直到它已完全恢复。 检查动物BEHAvior在1 – 2小时术后疼痛或痛苦，并植入完整的迹象。 注意：在正常条件下，将动物应该能够走动具有适度扰动运动。 继续检查动物，每8 – 12小时，第72小时，体重测量和监控行为。检查动物是在夜间活跃和移动。在地面覆盖的形式湿的食物周星驰与水或营养凝胶，州城颗粒混合，饮水应在地面提供。通过皮下或intraperiotoneal注射额外水合应提供必要的。 辖5毫克/千克小鼠酮洛芬和0.2mg / kg的地塞米松小鼠皮下，在24和48小时的时间点，术后。此外，0.005-0.010毫克/ 100g的鼠应当施用每8小时皮下注射72小时。 7. 体内成像麻醉鼠标下5％异氟烷/氧在感应腔直到呼吸速率减慢到大约1呼吸/秒。 鼠标转移到自定义stereotax（ 图1D）与反馈控制的加热垫，插入直肠温度计。减少异氟烷至2％。 辖格隆0.05毫克/ 100g的鼠肌内成使用29后肢 – 地下30针和3/10毫升注射器，每肢注射量的递送约50％。 辖1毫升/ 100克小鼠的5％葡萄糖（水合）皮下盐水一次每小时。 插入螺纹室持有者为用于手术（ 图1F）后持有者。调整高度和扭支柱上的固定螺钉在顶板。 与这两个人连接，提高在后持有人持有，直至胸部可以根据灵感自由膨胀。 注：持有人无论是坚定执着和胸部significan的自由扩张TLY减少因呼吸运动伪影。 根据需要进行成像。 当成像完成后，较低的职位，拧开室支架，移除直肠体温计，放鼠标在加热表面恢复。不鼠标返回到其他动物的公司，直到它已完全恢复。

Representative Results

按照上述步骤，在手术中的每个阶段应模仿结果在图2中所概述的手术的每个阶段。施加有机硅弹性体，以消除在玻璃下气泡时特别必须小心，或至少确保它们位于感兴趣（ 图2L）的区域的外周。对于有经验的外科医生，手术并发症需要安乐死无论在手术或前24个小时的术后内发生在操作的约20％。这些并发症过度软组织出血或失败到室牢固地固定到脊柱最常出现。 在成功植入室中，该窗口通常保持光学透明的多周（ 图3）。尽管最好的努力，不透明，纤维状，肿瘤生长经常形成在几天内，造成局部obscuri窗口纳克（ 图3C – 女 ，黑色虚线）。荧光结构是很难看到使用2PEF显微镜此纤维组织下方。我们发现结果的双峰分布，具有成功植入窗户大约50％的剩余明确超过5周术后，和大约50％的范围内变得模糊处理1 – 3周。对于保持在视窗的经验只是一个温和的程度的新生血管或硬脑膜（ 图3D – 楼绿星号）上面清晰，大多数地方的窗口，这并不妨碍2PEF成像。我们过去的研究显示，30窗口和相邻椎骨下增加小胶质细胞，但不是星形胶质细胞密度，说明轻度炎症类似于见于颅窗口准备5。 在背根gangl的一个子集表达黄色荧光蛋白（YFP）的转基因小鼠IA（DRG）神经元（YFPH线;杰克逊实验室），轴突分别清晰可辨了几个星期术后（ 图4A和B），并且只要在一个动物4个月（数据未示出）。血管（ 图4A和B）可见通过眼眶注入荧光德克萨斯红标记的葡聚糖进入血浆。小胶质细胞也显现在小鼠中CX3CR1敲入小鼠表达GFP（CX3CR1-GFP;杰克逊实验室）杂交，以该YFPH线（ 图4C）。对比度和分辨率适度恶化随着时间的推移（ 图4C）由于先前30描述的纤维过度生长的形成。我们经常拍摄3个小时在一个会话中没有死亡和频率高达每12小时。会话的持续时间和频率是由动物麻醉诱导，伴随的伦理考虑伴随的疼痛和痛苦到实验动物的耐受性的限制。 < P类=“j​​ove_content”FO：保持together.within页=“总是”> 图1。定制手术套件有助于室分娩植入过程中，并在随后的成像会议稳定室，两个边的酒吧和顶板（A）是组装（B）用小螺丝进入椎管腔（C）。一种外科表可扩展的帖子（D）允许侧酒吧（E）采用控股引脚椎骨的交付和夹紧。随后的成像会议改用内螺纹的帖子通过对植入物（F）的机翼固定螺丝连接到室内。面板这个数字B已经被修改法拉等人 ， 自然方法 ，2012 30与自然出版集团的许可。96 / 52196fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。 图2.背椎板执行和慢性成像室被植入以提供光接入到脊髓。该过程在蒙太奇说明。首先，皮肤（板A，B，协议部分3.1 – 3.4）和肌肉（C; 3.5）缩回，露出三个基本椎骨。所述组织覆盖这三个椎骨被除去（D，E，F; 3.6 – 3.10）和横向进程刮清洁它们将被锁定在两侧（G，H; 3.12）之前。小心，中央椎骨的背薄片是去除与骨的边缘密封（ 我 </strong>的; 4. 6）。顶板应用（J; 5.1）和螺钉固定到位（K; 5.3）用密封硅橡胶和玻璃盖（L; 5.5）室之前，确保室。后输送销被除去（M; 5.8），皮肤被粘在腔室的侧面（M，N; 5.8）和固定螺钉插入到翼（O; 5.9）。最后，螺丝槽密封用牙科丙烯酸（P 5.10），和鼠标被放置在一个干净的笼子里恢复请点击此处查看该图的放大版本。 图3.慢性脊髓腔保持光学透明OV呃多个星期。白色光图像中的脊髓的，范围从几分钟（A）至术后3周（F）中 。血管标志是可识别的各时间点（黄色箭头）。几乎没有变化被认为在1天术后（B）中 。致密的纤维增生（C – 女 ，围边虚线上右下）的存在早三天结果在成像区域的局部模糊处理。轻度新生血管（D，E，F，绿星号）也存在，但并不能掩盖在白光或2PEF成像原有血管。 请点击此处查看该图的放大版本。 <p类=“jove_content”> 图4.慢性脊髓腔允许重复多光子成像，而不需要重复手术。在脊髓的背funiculi表达YFP的背根神经节轴突（绿色）的一个子集的转基因小鼠反复成像线和血管（红色）标记血管内注射染料（A，B）。小胶质细胞（紫红色）的活性，也可以随时间跟踪Thy1肾炎-YFP / CX3CR1-GFP的双转基因小鼠（C）的 。虽然轴突和小胶质细胞保持可见，对比度和分辨率小幅下降时间（C）。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

这里展示的技术允许重复，时间推移， 体内成像背侧鼠标SC出许多周后可操作，而不需要后续的外科手术。此过程是一项重大改进，重复手术成像研究或以上portmortem组织学方法，其中，对细胞动力学信息丢失。我们先前³⁰展示了这种技术的价值为研究SCI病理体内 。

成像的最大纵向范围是由致密，纤维组织在SC的背表面上的生长确定。随着时间的推移，这种增长导致了图象对比度和分辨率的损失。这种增长也被视为在备选外科制剂^31。有趣的是，我们已观察到，这种增长可以最小化通过仔细洗涤该背侧的SC表面，以去除血液制品，密封的表面切骨与腈基丙烯酸酯，密封腔室的边缘以及与硅氧烷弹性体，和最小化背SC和盖玻璃之间的间隙空间。

最近，另一种方法类似于我们自己使用聚碳酸酯室已经证明^32。使用的聚碳酸酯是有利的，因为它是用X射线和声学成像方式，这是不针对我们的不锈钢零件的情况相兼容。然而，随着三维打印机的现在普遍存在的技术，腔室部分可以从各种各样的材料制成，以适应特定的需要。最近，我们在印刷清晰感光树脂我们所有的零部件。

一个封闭的腔室中的一个关键的缺点是不能施用药物或适于成像的SC ³⁴的外源染料重复剂量。然而，通过利用我们现有系统的机械稳定性，我们已经使用了我们目前室成功LY锚鞘内导管连接到皮下植入注射端口，其中，即使在一个封闭的腔室系统（未发表的作品）允许用于药物递送在多个时间点。另外，由于顶板的模块化性质，该制剂的未来版本将包括一个可重新密封的腔室，以允许两者的治疗剂和荧光标记的重复应用。另外，也可以设想顶板与支架用于记录电极，光学镶件，和端口用于药物递送。这种增加很可能会更具挑战性，以实现使用Fenrich 等 ³¹多个极简系统。总之，我们的腔室提供一个网关平台在其上不同的实验，可以根据。

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Vannas scissors	Fine Science Tools	15000-04
forceps, scissors, scalpel, etc.	Fine Science Tools	multiple
retractor kit -magnetic fixator	Fine Science Tools	18200-02
retractor kit -retractor	Fine Science Tools	18200-09	other retractors may also be used
retractor kit -elastomer	Fine Science Tools	18200-07
feedback controlled heating blanket	CWE Inc.	Model: TC-1000 Mouse              Part No. 08-13000
stereotax	N/A	see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
spinal chamber	N/A	see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
spinal chamber holders	N/A	see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
Cyanoacrylate glue	Loctite	Loctite 495	multiple suppliers
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder)	Teets	Mfg. Part: 8101	multiple suppliers
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid)	Teets	Mfg. Part: 8501	multiple suppliers
Glycopyrrolate	MWI Veterinary Supply	MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
Bupivacaine	MWI Veterinary Supply	MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)
Ketoprofen	MWI Veterinary Supply	MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)
Dexamethasone	MWI Veterinary Supply	MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)
KwikSil Elastomer	World Precision Inc.	KWIK-SIL
KwikSil Mixing Tips	World Precision Inc.	KWIKMIX