Bu videoda, bir canlı fare dorsal spinal kord üzerinde kronik optik görüntüleme odasını yerleştirmeye yönelik bir prosedür açıklanmaktadır. odası, cerrahi işlem ve kronik görüntüleme gözden ve gösterilmiştir.
Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.
Sağlam organizmalarda in vivo mikroskopi time-lapse gibi immünohistokimya gibi geleneksel tek-zaman noktası analizi erişilemez karmaşık biyolojik süreçlerin, direkt görüntülenmesini sağlar. Özel olarak, çoklu foton mikroskobu (MPM) 1, örneğin, 2,3 kadar ve 4 1 mm'den daha fazla görüntüleme elde edilmiştir kemirgen neokorteks gibi, doku saçılma görüntüleme için izin verir. Tek bir prosedür haftalar ve aylar beyne optik erişim sağlar 5-7 olan cerrahi preparatları ile bir araya getirildiğinde, bu mikroskopi yaklaşımlar sağlıklı ve hastalıklı ülkelerde 8-11 beyinde dinamik süreçleri incelemek için kullanılmıştır. Buna ek olarak, protokoller davranış deneyleri sırasında hücresel çözünürlüklü fonksiyonel görüntüleme için izin uyanık (yani, sigara, anestezi), hayvanlarda in vivo görüntüleme için temin 12,13 geliştirilmiştir. Bu protokoller, comparis kullanılmaktadırkorelasyon nöronal aktivitenin 14 ons, anestezi ve uyanık hayvanlarda 15 sinyalizasyon astrosit kalsiyum, görev özgü nöronal kümelerin 16 belirlenmesi ve nöronların yeteneği bıyık stimülasyonu 17 üzerine nesne konumunu ayırt etmek.
Bir hastalık mekanizması 18 gibi akut aksonal dejenerasyon tanımlaması (AAD) sağlayan, fare omurilik (SC) tatbik edilmiştir, sağlıklı ve patolojik mekanizmalar, in vivo görüntüleme zaman atlamalı aydınlatmak için bu yaklaşım potansiyeli göz önüne alındığında. Daha sonraki çalışmalar, arka kök gangliyon (DRG) akson rejeneras-yonunun 19 akson rejenerasyonu 20 kan damarlarının yeri, yaralanma 21 karşılık glial kemotaksis, deneysel otoimmün ensefalomiyelit T-hücresi göçü (EAE) 22, aktivite ile ilgili periferal lezyonların etkileri araştırıldı amyotroph yanıt mikrogliya 23,24 ve astrositler 25ic lateral skleroz (ALS), SC yaralanması (SKY) 26 sonra aksonal filizlenme içinde STAT-3 rolü ve EAE 27 akson kaybı ve kurtarma mekanizması. Bu yaklaşımların başarısına rağmen, tüm bu çalışmalar zaman noktalarında erişilebilir sayısını sınırlayarak, her görüntüleme zaman noktasında hayvanın cerrahi açıklıklar tekrarlanan gerekli başka böylelikle kısa vadeli dinamikleri çalışmaları sınırlayan, tek bir görüntüleme oturumu ya sınırlı ya da alındı ve karıştırıcı deneysel eserler olasılığını arttırır. Bu ameliyatlar için protokoller önceden 28,29 yayınlanmıştır.
Son zamanlarda, biz tekrar ameliyatları için gerek kalmadan birden fazla haftalarda fare SC zaman atlamalı MPM görüntüleme etkin bir kronik omurilik odasının implantasyonu için bir teknik 30 yayınladı. Kısaca, bu cerrahi hazırlık alt torakal laminektomi ve dört parçalı odasının implantasyonu performans dahil. odası dahillaminektomi çevreleyen omurlar ve bir cam lamel SC üzerine yerleştirilir ve silikon elastomer ile güvenli kelepçeli üç özel işlenmiş paslanmaz çelik parçalar. Bu teknik, tekrar ameliyatları için gerek kalmadan sağlıklı ve yaralı devletler postoperatif fazla 5 hafta dışarı rutin görüntüleme için izin verdi. Görüntüleme zaman noktalarının sayısı sadece hayvan anestezi indüksiyon tahammül hangi frekansı ile sınırlı idi. Görüntüleme süresi SC yüzeyi üzerine yoğun, fibröz doku büyümesi ile sınırlı kalmıştır. Ayrıca, cerrahi implant motor fonksiyon üzerinde uzun süreli etkisi olduğu belirlenmiş.
Bizim ilk yayınlanmasından bu yana, aynı zamanda SC uzun vadeli görüntüleme sağlayan alternatif yaklaşımlar başka 31-33 tarif edilmiştir. Bu protokol, geliştirdiğimiz omurga bölme yerleştirilmesi için prosedürü gösterir.
Burada gösterilen tekniği tekrarlanan, time-lapse sağlar, birçok hafta dışarı dorsal fare SC in vivo görüntüleme sonraki cerrahi prosedürler için gerek kalmadan ameliyat sonrası. Bu prosedür tekrar cerrahi görüntüleme çalışmaları üzerinde veya hücresel dinamikleri hakkında bilgiler kaybolur portmortem histolojik yaklaşımlar üzerinde önemli bir gelişme gösterir. Biz daha önce 30 in vivo SKY patolojiyi incelemek için bu tekniğin değerini göstermiştir var.
görüntüleme maksimum uzunluk boyutu SC dorsal yüzeyi üzerinde yoğun, fibröz doku büyümesi ile saptanmıştır. Zamanla, bu büyüme görüntü kontrastı ve çözünürlük kaybı ile sonuçlandı. Bu büyüme, aynı zamanda alternatif cerrahi hazırlıkları 31 görülmüştür. Biraraya, dikkatli bir şekilde bir sızdırmazlık yüzeyi, kan ürünleri çıkarmak için, dorsal SC yüzeyinin yıkama ile bu büyüme minimize edilebilir gözlediksiyanoakrilat ile kesilmiş kemik, silikon elastomer iyice odasının kenarları sızdırmazlık ve dorsal SC ve cam kapak arasındaki interstisyel boşluk en aza indirir.
Son zamanlarda, bir polikarbonat odacığı kullanılarak kendi benzer başka bir yaklaşım 32 gösterilmiştir. Bizim paslanmaz çelik parçalar için durum böyle değildir X-ışınını akustik görüntüleme cihazları ile uyumlu olduğundan, polikarbonatın kullanılması avantajlıdır. Ancak, 3D yazıcılar şimdi her yerde teknoloji ile, oda parçaları belirli ihtiyaçlarını karşılamak için geniş bir malzeme çeşitli imal edilebilir. Biz son zamanlarda açık bir fotopolimer bizim tüm parçaları baskılı var.
Kapalı odasının Bir anahtar dezavantajı ilaçlar veya SC görüntüleme 34 için uygun eksojen boyaların tekrarlanan dozlarda yönetmek için yetersizlik. Ancak, bugünkü sistemin mekanik stabilite yararlanarak, biz zaten başarılı bizim şimdiki odasına kullandıkly da kapalı bir bölme sistemi (yayınlanmamış çalışma), çoklu zaman noktalarında ilaç verme izin veren bir deri altından implante edilen enjeksiyon portuna bağlı bir intratekal kateter çapa. Üstelik, üst plaka modüler doğası, bu hazırlık gelecekteki versiyonları terapötik maddeler ve floresan etiketler iki tekrarlı uygulama için izin vermek için açılıp kapanabilir bir bölmeyi içerir. Bu ilaç iletimi için elektrotlar, optik geçme ve bağlantı noktaları kayıt için bağlantı elemanları ile üst plakaları tasavvur edilmesi de mümkündür. Bu tür eklemeler olasılıkla Fenrich ark. 31 daha minimalist sistemini kullanarak uygulamak daha zor olacaktır. Sonuç olarak, bizim odası farklı deneyler dayalı olabilir bunun üzerine bir ağ geçidi platform sağlar.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-04 | |
forceps, scissors, scalpel, etc. | Fine Science Tools | multiple | |
retractor kit -magnetic fixator | Fine Science Tools | 18200-02 | |
retractor kit -retractor | Fine Science Tools | 18200-09 | other retractors may also be used |
retractor kit -elastomer | Fine Science Tools | 18200-07 | |
feedback controlled heating blanket | CWE Inc. | Model: TC-1000 Mouse Part No. 08-13000 | |
stereotax | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber holders | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
Cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite 495 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder) | Teets | Mfg. Part: 8101 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid) | Teets | Mfg. Part: 8501 | multiple suppliers |
Glycopyrrolate | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602) | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
Bupivacaine | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 029841 (Hospira 116301) | |
Ketoprofen | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193) | |
Dexamethasone | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032) | |
KwikSil Elastomer | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
KwikSil Mixing Tips | World Precision Inc. | KWIKMIX |