Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

נוהל השתלה קאמרי בעמוד השדרה לאורך Published: December 3, 2014 doi: 10.3791/52196
Automatic Translation
1,2, 2
1Department of Neurobiology and Behavior, Cornell University, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University

Summary

בסרטון הזה, אנו מתארים הליך להשתלת חדר הדמיה אופטי כרוני על חוט השדרה הגבי של עכבר חי. קאמרי, ההליך כירורגי, וההדמיה כרונית נבדקים והפגינו.

Introduction

זמן לשגות במיקרוסקופיה vivo באורגניזמים שלמים מאפשר ההדמיה הישירה של תהליכים מורכבים ביולוגיים שאינם זמינות לניתוח נקודה אחת בזמן מסורתי, כגון אימונוהיסטוכימיה. באופן ספציפי, מיקרוסקופיה רב הפוטון (MPM) 1 מאפשרת הדמיה בפיזור רקמות, כגון הניאוקורטקס המכרסמים, שבו הדמיה של עד 2,3 ועודף של 4 1 מ"מ הושגה. בשילוב עם הכנות כירורגית 5-7 שבהליך יחיד מאפשר גישה אופטית למוח לשבועות עד חודשים, גישות מיקרוסקופי אלה היו בשימוש ללמוד תהליכים דינמיים במוח במצבים בריאים וחולים 8-11. בנוסף, פרוטוקולים פותחו 12,13 המספקים הדמיה in vivo בבעלי חיים ער (כלומר, שאינם מורדמים), המאפשרים להדמיה תפקודית ברזולוציה סלולרית בעת מבחני התנהגות. פרוטוקולים אלה היו בשימוש לcomparisתוספות של פעילות עצבית מתואמת 14, סידן astrocyte איתות 15 בבעלי חיים מורדמים וערים, זיהוי של אשכולות עצביים משימה ספציפית 16, ואת יכולתם של תאי עצב להפלות מיקום אובייקט על גירוי זיף 17.

לאור הפוטנציאל של גישה זו על מנת להבהיר את המנגנונים בריאים ופתולוגיים, זמן לשגות בתחום ההדמיה vivo היה מוחל על חוט השדרה העכבר (SC), המאפשר לזיהוי ניוון axonal החריף (AAD) כמנגנון מחלה 18. מחקרים מאוחרים יותר חקרו את ההשפעות של נגעים היקפיים בגרעיני שורש הגבי (DRG) התחדשות האקסון 19, תפקידם של כלי דם בהתחדשות האקסון 20, chemotaxis גליה בתגובה לפציעה 21, הגירת T-cell בEncephalomyelitis אוטואימוניות הניסיוני (EAE) 22, פעילות 23,24 של מיקרוגליה והאסטרוציטים 25 בתגובה לamyotrophטרשת ic לרוחב (ALS), את התפקיד של STAT-3 בהנבטת axonal לאחר פציעת SC (SCI) 26, ומנגנון של אובדן האקסון והתאוששות ב -27 EAE. למרות ההצלחה של גישות אלה, כל המחקרים הללו היו מוגבלים לאו פגישת הדמיה יחידה, וכך להגביל את הלימודים לדינמיקה לטווח קצר, או אחר הנדרשים חזרו פתחים כירורגית של בעלי החיים בכל נקודת זמן הדמיה, המגבילים את מספר נקודות זמן נגיש ואגדיל את הסבירות של חפצים ניסיוניים בלבול. פרוטוקולים לניתוחים אלה כבר פורסמו בעבר 28,29.

לאחרונה, פרסמנו טכניקה 30 להשתלה של תאים בעמוד השדרה כרוניים שאפשרו הדמיה MPM הזמן לשגות בSC העכבר מעל שבועות מרובים ללא הצורך בניתוחים חוזרים. בקצרה, הכנת כירורגים זה כלול ביצוע laminectomy בעמוד השדרה החזי הנמוכה וההשתלה של תא ארבעה חלקים. החדר כלולשלושה חלקי פלדת אל-חלד מותאם אישית במכונה שהדקו את החוליות המקיפות את laminectomy, וcoverslip זכוכית מונח על SC ומאובטח עם אלסטומר סיליקון. טכניקה זו אפשרה להדמיה שגרתית ליותר מ 5 שבועות לאחר הניתוח במדינות בריאים ונפצעו ללא צורך בניתוחים חוזרים. מספר נקודות זמן הדמיה היה מוגבל רק על ידי התדר שבו בעלי החיים יכולים לסבול אינדוקציה הרדמה. חיים הדמיה היה מוגבל על ידי הצמיחה של רקמה צפופה, סיבית על פני השטח של SC. בנוסף, אנו מאמתים שהשתל הניתוחי אין השפעה לטווח ארוך על תפקוד מוטורי.

מאז פרסומו הראשוני שלנו, גישות חלופיות גם מאפשרות הדמיה לטווח ארוך בSC תוארו במקום אחר 31-33. פרוטוקול זה מדגים ההליך שלנו להשתלת תא השדרה שפיתחנו.

Protocol

הערה: הטיפול ומניפולציה ניסויית של כל העכברים במאמר זה אושר על ידי הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת קורנל.

1. הגדרה לצורך הניתוח

  1. לעקר את כל כלים הנדרשים באמצעות החיטוי או עיקור אושר. לכל הפחות, כולל מערכת האספקה ​​שלה (1D איור, E) אזמל, מספריים, מספריים vanna, מלקחיים, מברג של צורף, צמר גפן, סט של כלי כתיבה, השתל (איור 1 א) ו.
  2. נגב את כל המשטחים, כולל כל כפתורי stereoscope, עם 70% אתנול ו / או חומרי חיטוי מתאימים.
  3. יצירת שדה סטרילי ידי כיסית stereotax המותאם אישית (1D איור) ומקיף benchtop בסדינים מעוקרים. כרית חימום (רצוי משוב המבוקר) צריכה להיות ממוקמת בחלק העליון של stereotax ותחת הסדינים המעוקרים.

2. הכנההעכבר לכירורגיה

  1. הרדימי עכבר מתחת לגיל 5% isoflurane / חמצן בתא אינדוקציה עד קצב הנשימה מאטה כ 1 נשימה / sec.
  2. העבר את העכבר לאזור אחסון זמני מהשדה סטרילי, תוך שימוש בחרטומו להמשיך חשיפת isoflurane. להפחית isoflurane עד 2%. החל משחה העין כדי למנוע התייבשות של קרנית.
  3. לנהל glycopyrrolate (תרופה אנטיכולינרגית) בשעה 0.05 בעכבר g מ"ג / 100 לשריר לhindlimbs באמצעות 29-30 מחטים G ו3/10 מזרק סמ"ק, ומספק כ -50% מכל איבר את עוצמת הזריקה.
    הערה: Glycopyrrolate משמשת למניעת הצטברות נוזלי בריאות בזמן שהעכבר נמצא תחת הרדמה.
  4. באמצעות קוצץ חשמלי, לגלח חלק מהיבט הגב של העכבר, ארוך סנטימטרים כ 3 על ידי 2 סנטימטר רחב ומתמקד בקשת החזה. נקה כל שיער גזוז הרחק מהאזור המגולח.
  5. לנהל את הזריקות הבאות תת עורי ודיסטלי המגולחתיקון באמצעות 29-30 מחטים G ו3/10 מזרקים cc: 1 מיליליטר / 100 עכבר g גלוקוז 5% בתמיסת מלח (לטיפול בהתייבשות), 5 מ"ג / קילוגרם ketoprofen עכבר (NSAID לשיכוך כאבים), 0.2 מ"ג / קילוגרם dexamethasone עכבר ( סטרואידים אנטי-דלקתיים כדי להפחית את הדלקת).
  6. שימוש בצמר גפן, לבצע שלושה שוטף לסירוגין של יוד ו -70% אתנול, מחכה דק '1 בבין שוטף.
  7. לנהל של bupivacaine 0.125% (בלוק עצבים היקפי) תת עורי באמצעות 29 100 μl - 30 מחטים G ו3/10 מזרק סמ"ק למרכז התיקון המגולח כדי להפחית את הכאב באתר החתך.
  8. העברת עכבר כדי stereotax המותאם אישית (1D איור), להכניס מדחום רקטלי, ולהמתין כ 10 דקות לbupivicaine ייכנס לתוקף.

3. לחשוף ונקו את הרבדים הגבי של 3 חזה חוליות סמוכות

  1. שימוש בלהב סכין המנתחים, ליצור (5 מ"מ או פחות) קטנים חתך מעל החוליות של העניין (איור 2 א).
  2. באמצעות אזמל או מספריים כירורגיות, בעדינות לנתק fascia חיבור בין העור והשרירים שמתחת.
  3. השתמש מפשקים להתאפק העור, ומאפשר לשטח עבודה גדול ככל האפשר (איור 2). שים לב שלא להגדיל את העומס על החזה ובכך לחסום את הנשימה.
  4. בעזרת זוג המלקחיים, אחיזה מקורי ביותר החוליה שיהיה חשופה דרך השריר שמעליה. באמצעות אזמל, לחתוך רקמות משם משני צדיו של תהליך הגב מכל 3 החוליות (איור 2 ג).
  5. באמצעות כל שילוב של להב סכין מנתחים, צמר גפן, ו / או מגרד עצם, להסיר את כל הרקמה שמעל מהרבדים הגבי (איור 2 ד).
  6. בעזרת מספריים כירורגיות, לחתוך בזהירות גידים המחוברים לחוליות בשני Lateraקצות l של עמוד השדרה (איור 2E).
  7. שימוש באזמל, בעדינות להסיר כמה שיותר רקמה מהקצוות לרוחב של עמוד השדרה ככל האפשר על מנת לספק משטח הידוק נקי.
  8. בעדינות debride החוליות של כל רקמות רכות שנותרו באמצעות מגרד עצם ו / או מקלון צמר גפן. לחתוך את כל רקמה לא מתאים במקום אחר באמצעות מספריים כירורגית (איור 2F).
    הערה: זה חיוני עבור שני הידוק וביצוע laminectomy הגב שהחוליות נחשפות בצורה נקיה. Cauterizer עשוי להיות שימושי בשליטה דימום שלאחר מכן.
  9. Shift מפשקים להתאפק הרקמות המקיפות את עמוד השדרה, בנוסף לעור (איור 2F).
  10. צרף את צד הברים שתל לשיניים על ההודעות שנכתבו על המשלוח ולטעון אלו לפוסט-הבעלים (כמו באיור 1E).
  11. הצמד את החוליות 3 באמצעות הסורגים בצד, יישום פשוט מספיק לחץ כדי להחזיק securely (איור 2G, ח). שימוש במלקחיים כדי להבטיח הידוק רמה של החוליות 3. שים לב שמספר ניסיונות ייתכן שיהיו צורך. ודא שברי הצד שניהם ברמה ומקבילה לפני ביצוע laminectomy.
  12. זהירות נקייה ויבש על פני השטח הגבי של החוליות הדקו באמצעות צמר גפן.

4. בצע Laminectomy הגבי

  1. הכנס את הטיפים של המספריים Vannas למרחב אפידורל של החוליה הדקה המדיאלי ולסחוט את הידיות באורח קל; אם העצם הוא יבש, זה צריך לפצח לאורך lamina הגב. חזור על תהליך זה בצד הנגדי כדי לשחרר את lamina.
  2. עוקץ בעדינות lamina הרופף על ידי תהליך הגב עם מלקחיים, לחתוך בזהירות משם את כל רקמת חיבור בקצוות מקורי ואת הזנב של lamina ולהרים אותו משם.
  3. שימוש בתמיסת מלח 0.9% ו / או נוזל השדרה מוחין מלאכותי (ACSF), לשטוף ביסודיות משם כל overlyi דםng חוט השדרה. השתמש בצמר גפן לספוג את נוזלים עודפים.
  4. בעזרת מספריים Vannas, לקצץ בזהירות את הקצוות לרוחב של העצם חזרה לסורגים בצד של השתל. שוב, לשטוף ושליטה בדימום תוך שימוש בצמר גפן ומלוח / ACSF.
  5. במקרה שחלק מקרום העצם ניתק וoverlies חוט השדרה, בעדינות להסיר רקמה זו באמצעות צמר גפן ו / או 29 - מחט G 30. הקפד שלא לפגוע בחוט השדרה בחלק זה של ההליך. אל תבלבל את periosteum הרופף עם מאטר הדורה העטוף היטב.
  6. זהירות, לאטום את הקצוות חשופים הנותרים של העצם עם אחד או שני אקריליק שיניים וcyanoacrylate (איור ט 2). קח טיפול מיוחד שלא לאפשר הדבקים לזרום על חוט השדרה החשוף.

5. חותם הלשכה

  1. מקם את הצלחת העליונה בזהירות כדי ש4 החריצים בקנה אחד עם 4 חורים על הסורגים בצד והפתיחה overlies הספין נחשףכבל אל (איור 1 וי 2).
  2. באמצעות המברג של צורף, להתחיל בזהירות את הבורג הראשון, ייצוב המוט של המברג עם עוד זוג מלקחיים. אל תהדק את הבורג בשלב זה, אבל להכניס אותו, כך שכמה האשכולות הראשונים עוסקים. חזור על תהליך זה עבור 3 ברגים האחרים.
    הערה: כדאי להשתמש בטיטניום או מלקחיים magnetizable אחרים שאינו כדי למקם את הברגים בשלב זה.
  3. עם כל 4 הברגים במקום, להדק כל אחד מהברגים לסירוגין באותו הסכום במרווחים קטנים עד ברגים מאובטחים היטב (איור 2K). שים לב שזה לא יוצא דופן עבור הצלחת העליונה להגמיש במהלך תהליך זה. הקפד שלא להדק את הברגים יותר מדי, כראש הבורג יכול לשבור ולחץ כלפי מטה מוגזם יהיה לעקור את המהדק ו / או לגרום לפגיעה בחוט השדרה.
  4. השתמש אלסטומר סיליקון כדי למלא את החלל שבין חוט השדרה וחלון הזכוכית. כי זה איילהs לא לייצר חומצה אצטית במהלך ריפוי, להשתמש אלסטומר מותג KwikSil וטיפים ערבוב. החל חלק ליברלי של סיליקון לחוט השדרה החשוף. תשמור על עצמך להיפטר מכל סיליקון המכיל בועות אוויר מקצה הערבוב לפני יישום לחוט השדרה.
  5. העבודה במהירות, לחץ בעדינות coverslip # 0 5 מ"מ להבלעה בצלחת העליונה. החל מספיק לחץ כדי לסחוט בהדרגה את הנוזלים אלסטומר להקיף את חוט השדרה, אך לא לגרום לדחיסת חוט השדרה (איור 2L). הגדרת זמן לאלסטומר היא כ 90 שניות, כדי לוודא coverslip מיושם במהירות.
  6. במקרה של איטום נכשל, לחכות עד אלסטומר קבע, בעדינות להסיר אותו מהשתל עם מלקחיים, ולחזור על 5.4-5.5.
  7. לכסות את הקצוות של אלסטומר הקרין עם אקריליק / cyanoacrylate שיניים ולדבוק העצם שמסביב ככל האפשר כדי למנוע אלסטומר מעובר מעל פני השטח של חוט השדרה.
  8. הסר מפשקים ולמשוך את העור סביב הקצה של השתל. באמצעות cyanoacrylate, לדבוק העור לקצוות של השתל (איור 2M, N).
  9. הכנס 0-80 # - 1/4 "להגדיר ברגים לתוך כנפי הצלחת העליונה (איור 1 ג ו -2 O).
  10. באמצעות אקריליק שיניים, לאטום כל פערים בחריצי הבורג של הצלחת העליונה (איור 2P).

6. לאחר ניתוח טיפול

  1. הסר בעלי חיים מהרדמה והמקום בכלוב גדול ונקי. ודא שהכלוב הוא גדול מספיק שהתא לא לתפוס על כל דבר (כמו הטבילה בצורת V לבקבוק מים ו / או מזון) במהלך תנועה נורמלית בכל הכלוב.
    הערה: כלוב חולדה סטנדרטי הוא אידיאלי.
  2. מניחים את הכלוב על משטח מחומם בעוד החיה משחזרת. לא מחזיר את העכבר לחברה של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש באופן מלא.
  3. בדוק Beha בעלי החייםvior בתוך 1 - postoperation שעה 2 לסימנים של כאב או מצוקה ויושרה שתל.
    הערה: בתנאים רגילים, בעלי החיים צריכים להיות מסוגלים ambulate עם הפרעות צנועות לתנועה.
  4. תמשיך לבדוק בעלי חיים כל 8 - 12 שעות לשעה 72 הראשונה, מדידת משקל וניטור התנהגות. בדוק שבעלי החיים פעילים וניידים במהלך הלילה. מזון רטוב בצורה של קרקע Chow מעורבב עם מים או ג'לים תזונתי, כדורי לעיסה, ומי שתייה צריך להיות מסופק בגובה קרקע. הידרציה נוספות על ידי זריקות תת עורית או intraperiotoneal צריכה להינתן בהתאם לצורך.
  5. לנהל 5 מ"ג / קילוגרם ketoprofen עכבר ו -0.2 מ"ג / קילוגרם תת עורי dexamethasone העכבר ב 24 ו 48 נקודות זמן hr, לאחר הניתוח. בנוסף, .005-0.010 מ"ג / 100 גרם עכבר צריך להינתן בכל שעה 8 בזריקה תת עורית במשך 72 שעות.

7. בVivo Imaging

  1. הרדימי עכבר תחת5% isoflurane / חמצן בתא אינדוקציה עד קצב הנשימה מאט כ 1 נשימה / sec.
  2. העבר את העכבר לstereotax המותאם אישית (1D איור) עם כרית חימום משוב מבוקר ולהכניס מדחום רקטלי. להפחית isoflurane עד 2%.
  3. לנהל 0.05 מ"ג / 100 לשריר עכבר g glycopyrrolate לhindlimbs באמצעות 29-30 מחטים G ו3/10 מזרק סמ"ק, ומספק כ -50% מכל איבר את עוצמת הזריקה.
  4. נהל 1 מיליליטר / 100 גלוקוז 5% עכבר g (לטיפול בהתייבשות) תת עורי במלח אחת לשעה.
  5. הכנס את המחזיקים קאמריים מושחלים לתוך הפוסט-הבעלים המשמשים לניתוח (איור 1F). התאם את הגובה ולסובב את ההודעות על ברגי הסט בצלחת העליונה.
  6. עם שני המחזיקים מצורפים, לרומם את המחזיקים בעידן הפוסט-המחזיקים עד החזה יכול להרחיב באופן חופשי על השראה.
    הערה: שניהם הקובץ המצורף האיתן של הבעלים וההתרחבות ללא משמעותית החזהtly להפחית ממצא תנועה בשל נשימה.
  7. לבצע הדמיה לפי הצורך.
  8. כאשר ההדמיה תושלם, הודעות נמוכות, לסובב את מחזיקי תא, להסיר את מדחום רקטלי, ועכבר מקום על משטח מחומם להתאושש. לא מחזיר את העכבר לחברה של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש באופן מלא.

Representative Results

על ידי ביצוע ההליך הנ"ל, כל שלב בניתוח צריך לחקות את התוצאות עבור כל שלב בניתוח שתואר באיור 2. יש לנקוט זהירות מיוחדת בעת החלת אלסטומר סיליקון לחסל בועות אוויר מתחת לזכוכית או לפחות להבטיח שהם ממוקם בפריפריה של האזור של עניין (איור 2L). למנתח מנוסה, סיבוכים ניתוחיים, הדורשות הרדמה או במהלך ניתוח או תוך 24 שעות לאחר הניתוח הראשון מתרחשים בכ- 20% מפעילות. סיבוכים אלה בתדירות הגבוהה ביותר נובעים מדימום מוגזם ברקמות רכות או כישלון לצרף מאובטח הקאמרית לעמוד השדרה.

בתאים מושתלים בהצלחה, בדרך כלל נשאר החלון שקוף אופטי למספר שבועות (איור 3). למרות מיטב מאמצים, גידול אטום, סיבי, גידולים לעתים קרובות יוצר בתוך כמה ימים, וכתוצאה מכך obscuri החלקיng של החלון (איור 3 ג - F, קו מקווקו שחור). מבני ניאון קשים לראות באמצעות מיקרוסקופ 2PEF מתחת רקמה סיבית זה. אנו מוצאים הפצת bimodal של תוצאות, עם כ -50% מחלונות מושתלים בהצלחה נותרו ברורים ליותר מ 5 שבועות לאחר הניתוח, וכ -50% הופכים לטשטש בתוך 1-3 שבועות. לחלונות שנותרו רוב המקומות ברורים, תוך ניסיון חלון הצפייה תואר צנוע בלבד של neovascularization באו מעל הדורה (איור 3D - F, כוכביות ירוקות), שאינו מפריעה הדמיה 2PEF. המחקר קודם שלנו 30 הראה עלייה במיקרוגליה, אך לא בצפיפות astrocyte מתחת לחלון וחוליות סמוכות, המצביע על דלקת קלה דומה לזו שנצפתה בהכנות חלון גולגולתי 5.

בעכברים מהונדסים מבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) בתת-קבוצה של Gangl השורש הגביIA (DRG) נוירונים (קו YFPH; מעבדות ג'קסון), אקסונים היו בבירור להבחין במשך שבועות לאחר ניתוח (איור 4 א 'וב') וכל עוד ארבעה חודשים בחיה אחת (מידע לא מוצג). כלי דם (איור 4 א 'וב') נעשו גלויים על ידי ניאון הזרקת orbitally רטרו טקסס האדום שכותרת dextran לפלזמת הדם. Microglia גם היו דמיין בעכברים להביע GFP בעכבר לדפוק בCX3CR1 (CX3CR1-GFP; ג'קסון Labs) חצה את קו YFPH (איור 4C). לעומת זאת, ורזולוציה התדרדרו בצניעות לאורך הזמן (איור 4C) עקב היווצרות של יתר סיבי שתואר קודם לכן 30. אנחנו באופן שגרתי הדמיה במשך 3 שעות בפגישה אחת ללא תמותה ולעתים קרובות כמו כל 12 שעות. משך הפעלה ותדר מוגבל על ידי הסובלנות של בעלי החיים לזירוז הרדמה, בד בבד עם השיקולים האתיים המלווים כאב ומצוקה לחיות מעבדה.

< p class = "jove_content" fo: לשמור-together.within-page = "תמיד"> איור 1
Figure1. חדרי ניתוח מותאם אישית מאפשרים קאמרי אספקה ​​במהלך השתלה ומייצב את התא במהלך פגישות הדמיה הבאות. שני תופעות ברים וצלחת עליונה (A) הם התאספו (B) באמצעות ברגים קטנים לתוך תא השדרה (C). שולחן כירורגית עם הודעות להארכה (D) מאפשר המשלוח והידוק של הצד-הברים בחוליות באמצעות סיכות החזקה (E). פגישות הדמיה לאחר במקום להשתמש בהודעות שנכתבה על הליכי פנימיים לצרף לתא באמצעות ברגי סט על כנפי השתל (F). ב לוח של נתון זה שונה מפראר et al., שיטות טבע, 2012 30 באישור קבוצת הוצאה לאור טבע.96 52196fig1large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. laminectomy גב מבוצע וחדר הדמיה כרוני מושתל כדי לספק גישה אופטית לחוט השדרה. ההליך מתואר במונטאז '. ראשון, (פנלים, B; סעיפי פרוטוקול 3.1-3.4) עור ושרירים (C; 3.5) הם חזרו בי לחשוף שלוש חוליות הבסיסיות. הרקמה שמעל שלוש חוליות אלה הוסרה (D, E, F; 3.6-3.10) והתהליכים לרוחב מגורדים נקיות לפני שהם הידקו בשני הצדדים (G, H; 3.12). זהירות, lamina הגב של החוליה המרכזית הוא שהוסר ואת הקצוות של העצם אטום (אני (J; 5.1) וברגים מהודקים למקומו (K; 5.3) כדי לאבטח את החדר לפני איטום החדר עם אלסטומר סיליקון ומכסה זכוכית (L; 5.5). לאחר סיכות המשלוח יוסרו (M; 5.8), העור דבוק לצדדים של החדר (M, N; 5.8) וברגי הסט מוכנסים לתוך הכנפיים (O; 5.9). לבסוף, חריצי הבורג חתומים עם אקריליק שיניים (P; 5.10). והעכבר ממוקם בכלוב נקי להתאושש אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3

איור 3. תא השדרה כרוני נותר ov השקוף אופטי אה שבועות מספר. תמונות אור לבנה של חוט השדרה, שנעו בין כמה דקות (A) לשלושה שבועות לאחר הניתוח (F). ציוני הדרך בכלי דם לזיהוי בכל נקודות הזמן (חיצים צהובים). שינוי קטן נראה ביום אחד לאחר ניתוח (B). יתר צפוף סיבי (C - F, מתוחם בקו מקווקו על ימין למטה) קיים כבר בשלושה ימים ותוצאות בערפול חלקי של אזור ההדמיה. neovascularization קל (D, E, F, כוכביות ירוקות) הוא גם הווה, אך אינו מסתיר את כלי הדם המקוריים באור לבן או ההדמיה 2PEF. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4

class = "jove_content"> איור 4. תא השדרה כרוני מאפשר הדמיה רב-פוטון חוזר ונשנה ללא הצורך בניתוחים חוזרים. הדמיה חוזרת ונשנית של עכברים הטרנסגניים לבטא YFP בתת-קבוצה של אקסונים DRG (ירוק) בfuniculi הגב של עמוד השדרה כבל וכלי דם (אדום) שכותרתו על ידי הזרקה תוך-צבע (A, B). הפעילות של מיקרוגליה (סגול) יכולה גם להיות במעקב לאורך הזמן בThy1-YFP / CX3CR1-GFP עכברים הטרנסגניים כפולים (C). בעוד אקסונים ומיקרוגליה יישארו גלויים, ניגודיות ורזולוציה ירידה בצניעות לאורך זמן (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

הטכניקה הפגינה כאן מאפשרת חוזר ונשנה, זמן לשגות, ההדמיה in vivo של SC עכבר גב לשבועות רבים לפרסם אופרטיבי ללא צורך בניתוחים שלאחר מכן. הליך זה מהווה שיפור משמעותי על פני בדיקות הדמיה חוזרת-ניתוח או על פני גישות היסטולוגית portmortem, שבו מידע על דינמיקה סלולרית הולכות לאיבוד. יש לנו בעבר 30 הפגין את הערך של טכניקה זו ללימוד פתולוגיה SCI in vivo.

מידת האורך המרבית של הדמיה נקבעה על ידי הצמיחה של רקמה צפופה, סיבית על פני השטח הגב של SC. לאורך זמן, צמיחה זו הביאה לאובדן של ניגוד תמונה ורזולוציה. גידול זה יש גם בהכנות כירורגית חלופיות 31 ראה. במקרי נקודות, יש לנו ציינו כי צמיחה זו ניתן למזער על ידי שטיפה בזהירות את פני השטח SC הגב כדי להסיר מוצרי דם, איטום פני השטח שלהעצם לחתוך עם cyanoacrylate, איטום קצוות של החדר היטב עם אלסטומר סיליקון, ולמזער את מרחב ביניים בין SC הגב ומכסה הזכוכית.

לאחרונה, גישה אחרת דומה לשלנו באמצעות תא פוליקרבונט הודגמה 32. השימוש בפוליקרבונט הוא יתרון שכן הוא תואם עם X-ray ושיטות הדמיה אקוסטית, שזה לא המקרה עבור חלקי הנירוסטה שלנו. עם זאת, עם הטכנולוגיה בכל מקום עכשיו של מדפסות 3D, יכולים להיות מפוברקים ממגוון רחב של חומרי חלקי תא שיתאימו לצרכימים ספציפיים. לאחרונה יש לנו מודפסים כל החלקים שלנו בphotopolymer ברור.

חסרון מרכזי אחד תא סגור הוא חוסר היכולת לנהל מינונים חוזרים ונשנים של תרופות או צבעים אקסוגניים מתאימים להדמית SC 34. עם זאת, על ידי ניצול היציבות המכנית של המערכת הנוכחית שלנו, יש לנו כבר בשימוש התא הנוכחי שלנו למוצלחly לעגן קטטר intrathecal מחובר ליציאת הזרקה תת-עורית המושתלת, אשר אפשר למשלוח סמים בנקודות זמן מרובים אפילו במערכת סגורה קאמרית (עבודה שלא פורסם). יתר על כן, בשל האופי המודולרי של הצלחת העליונה, גרסאות עתידיות של הכנה זו תכלול תא ניתן לאטימה חוזרת כדי לאפשר ליישום חוזר ונשנה של שני סוכנים טיפוליים ותוויות ניאון. אפשר גם לדמיין צלחות עליונה עם mounts להקלטת אלקטרודות, מוסיף אופטי, ויציאות למשלוח סמים. תוספות כזה עלול להיות מאתגרות יותר ליישום באמצעות מערכת מינימליסטי יותר של Fenrich et al. 31. לסיכום, החדר שלנו מספק פלטפורמת שער שעליו ניתן לבסס ניסויים מגוונים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vannas scissors Fine Science Tools 15000-04
forceps, scissors, scalpel, etc. Fine Science Tools multiple 
retractor kit -magnetic fixator Fine Science Tools 18200-02
retractor kit -retractor Fine Science Tools 18200-09 other retractors may also be used
retractor kit -elastomer Fine Science Tools 18200-07
feedback controlled heating blanket CWE Inc. Model: TC-1000 Mouse              Part No. 08-13000
stereotax see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
spinal chamber see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
spinal chamber holders see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
Cyanoacrylate glue Loctite Loctite 495 multiple suppliers
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder) Teets Mfg. Part: 8101 multiple suppliers
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid) Teets Mfg. Part: 8501 multiple suppliers
Glycopyrrolate MWI Veterinary Supply MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767
Bupivacaine MWI Veterinary Supply MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)
Ketoprofen MWI Veterinary Supply MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)
Dexamethasone MWI Veterinary Supply MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)
KwikSil Elastomer World Precision Inc. KWIK-SIL
KwikSil Mixing Tips World Precision Inc. KWIKMIX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 μm in living brains by use of a Ti: Al 2 O 3 regenerative amplifier. Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  3. Kobat, D., Durst, M. E., Nishimura, N., Wong, A. W., Schaffer, C. B., Xu, C. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
  4. Horton, N. G., Kobat, D., Wang, K. In Vivo, Deep Tissue Three-Photon Imaging at the 1700-nm Spectral Window. Biomedical Optics. 7 (3), (2012).
  5. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  6. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
  7. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7 (12), 981-984 (2010).
  8. Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 7 (6), 449-463 (2006).
  9. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  10. Kerr, J. N. D., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Reviews Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).
  11. Lichtman, J. W., DENK, W. The Big and the Small: Challenges of Imaging the Brain's Circuits. Science. 334 (6056), 618-623 (2011).
  12. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake, Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  13. Wienisch, M., Blauvelt, D. G., Sato, T. F., Murthy, V. N. Two-Photon Imaging of Neural Activity in Awake, Head-Restrained Mice. Neuromethods. 67 (18), 45-60 (2011).
  14. Greenberg, D. S., Houweling, A. R., Kerr, J. N. D. Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats). Nature Neuroscience. 11 (7), 749-751 (2008).
  15. Thrane, A. S., Thrane, R. V., Zeppenfeld, D., Lou, N., Xu, Q., Nagelhus, E. A., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (46), 18974-18979 (2012).
  16. Dombeck, D. A., Graziano, M. S., Tank, D. W. Functional Clustering of Neurons in Motor Cortex Determined by Cellular Resolution Imaging in Awake Behaving Mice. Journal Of Neuroscience. 29 (44), 13751-13760 (2009).
  17. Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
  18. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nature Medicine. 11 (5), 572-577 (2005).
  19. Ylera, B., Ertürk, A., et al. Chronically CNS-Injured Adult Sensory Neurons Gain Regenerative Competence upon a Lesion of Their Peripheral Axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  20. Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (23), 9459 (2009).
  21. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
  22. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
  23. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. Plos One. 6 (3), 17910 (2011).
  24. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3, 1227 (2012).
  25. Dibaj, P., Steffens, H., Zschüntzsch, J., Kirchhoff, F., Schomburg, E. D., Neusch, C. In vivo imaging reveals rapid morphological reactions of astrocytes towards focal lesions in an ALS mouse model. Neuroscience Letters. 497 (2), 148-151 (2011).
  26. Bareyre, F. M., Garzorz, N., Lang, C., Misgeld, T., Buning, H., Kerschensteiner, M. In vivo imaging reveals a phase-specific role of STAT3 during central and peripheral nervous system axon regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (15), 6282-6287 (2011).
  27. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17 (4), 495-499 (2011).
  28. Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nature Protocols. 2 (2), 263-268 (2007).
  29. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. 59, 2760 (2012).
  30. Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  31. Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).
  32. Figley, S. A., et al. A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model. Plos One. 8 (3), 58081 (2013).
  33. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 82, 50826 (2013).
  34. Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes. Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).

Tags

Neuroscience גיליון 94 חוט השדרה, מיקרוסקופיה multiphoton ניתוח של בעלי חיים מיקרוסקופ פלואורסצנטי אופטיקה ביו-רפואית
נוהל השתלה קאמרי בעמוד השדרה לאורך<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של כבל עכבר השדרה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A… More

Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (94), e52196, doi:10.3791/52196 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter