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Neuroscience

अनुदैर्ध्य के लिए एक रीढ़ की हड्डी में चैंबर दाखिल के लिए एक प्रक्रिया Published: December 3, 2014 doi: 10.3791/52196
Automatic Translation
1,2, 2
1Department of Neurobiology and Behavior, Cornell University, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University

Summary

इस वीडियो में, हम एक लाइव माउस के पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी के ऊपर एक पुरानी ऑप्टिकल इमेजिंग कक्ष दाखिल करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन। कक्ष, शल्य प्रक्रिया, और जीर्ण इमेजिंग की समीक्षा की और प्रदर्शन कर रहे हैं।

Introduction

बरकरार जीवों में विवो माइक्रोस्कोपी में समय चूक ऐसे immunohistochemistry के रूप में पारंपरिक एकल समय बिंदु विश्लेषण करने के लिए दुर्गम हैं कि जटिल जैविक प्रक्रियाओं, के प्रत्यक्ष दृश्य सक्षम बनाता है। विशेष रूप से, बहु फोटॉन माइक्रोस्कोपी (यूके) एक ऐसी 2,3 अप करने के लिए और 4 1 मिमी से अधिक इमेजिंग हासिल किया गया है, जहां कृंतक नियोकॉर्टेक्स, के रूप में, ऊतक बिखरने में इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। एक ही प्रक्रिया महीने के लिए सप्ताह के लिए मस्तिष्क के लिए ऑप्टिकल उपयोग की अनुमति देता 5-7, जिसमें शल्य चिकित्सा की तैयारी के साथ संयुक्त, इन माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्यों 8-11 में मस्तिष्क में गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल व्यवहार assays के दौरान सेलुलर संकल्प कार्यात्मक इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, जाग (यानी, गैर anesthetized) पशुओं में vivo इमेजिंग के लिए प्रदान करते हैं कि 12,13 विकसित किया गया है। इन प्रोटोकॉल comparis के लिए इस्तेमाल किया गया हैसहसंबद्ध neuronal गतिविधि 14 की ऑन, anesthetized और जाग पशुओं में 15 सिगनल अस्थिकणिका कैल्शियम, कार्य विशेष न्यूरोनल समूहों 16 की पहचान, और न्यूरॉन्स की क्षमता गलमुच्छा उत्तेजना 17 पर वस्तु स्थान भेदभाव करने के लिए।

एक रोग तंत्र के रूप में 18 तीव्र axonal अध: पतन की पहचान (एएडी) की अनुमति के लिए माउस रीढ़ की हड्डी (अनुसूचित जाति) के लिए लागू किया गया था स्वस्थ और रोग तंत्र, vivo इमेजिंग में समय चूक स्पष्ट करने के लिए इस दृष्टिकोण की क्षमता को देखते हुए। बाद के अध्ययन पृष्ठीय रूट ganglia (DRG) अक्षतंतु उत्थान 19, अक्षतंतु उत्थान 20 में रक्त वाहिकाओं की भूमिका, चोट 21 के जवाब में glial कीमोटैक्सिस, प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित इंसेफैलोमाईलिटिस में टी सेल माइग्रेशन (EAE) 22, गतिविधि पर परिधीय घावों के प्रभावों की जांच amyotroph के जवाब में microglia की 23,24 और astrocytes 25आईसी पार्श्व काठिन्य (ए एल एस), अनुसूचित जाति चोट (एससीआई) 26 के बाद axonal अंकुरण में स्टेट-3 की भूमिका, और EAE 27 में अक्षतंतु हानि और वसूली का एक तंत्र। इन तरीकों की सफलता के बावजूद, इन सभी अध्ययनों समय बिंदुओं सुलभ की संख्या सीमित है, हर इमेजिंग समय बिंदु पर जानवर की शल्य चिकित्सा के उद्घाटन दोहराया आवश्यक बाकी जिससे अल्पकालिक गतिशीलता के लिए पढ़ाई सीमित है, एक एकल इमेजिंग सत्र या तो सीमित करने के लिए, या गया और confounding प्रयोगात्मक कलाकृतियों की संभावना बढ़ रही है। इन सर्जरी के लिए प्रोटोकॉल पहले से 28,29 प्रकाशित किया गया है।

हाल ही में, हम दोहराने सर्जरी के लिए आवश्यकता के बिना कई हफ्तों से अधिक माउस अनुसूचित जाति में समय व्यतीत एम पी एम इमेजिंग सक्षम है कि एक पुरानी रीढ़ की हड्डी में चैंबर के आरोपण के लिए एक तकनीक 30 प्रकाशित किया। संक्षेप में, इस शल्य चिकित्सा की तैयारी कम वक्ष रीढ़ की हड्डी में laminectomy और एक चार भाग चैंबर के आरोपण के प्रदर्शन में शामिल थे। कक्ष शामिलlaminectomy के आसपास के कशेरुकाओं, और एक गिलास coverslip अनुसूचित जाति के ऊपर रखा और सिलिकॉन elastomer के साथ सुरक्षित clamped कि तीन कस्टम machined भागों स्टेनलेस स्टील। इस तकनीक को दोहराने सर्जरी के लिए आवश्यकता के बिना स्वस्थ और घायल राज्यों में postoperatively के अधिक से अधिक 5 हफ्तों के लिए बाहर दिनचर्या इमेजिंग के लिए अनुमति दी। इमेजिंग समय बिंदुओं की संख्या केवल पशु संवेदनाहारी प्रेरण बर्दाश्त कर सकते हैं, जिस पर आवृत्ति द्वारा सीमित था। इमेजिंग जीवनकाल अनुसूचित जाति की सतह पर एक घने, रेशेदार ऊतक के विकास द्वारा ही सीमित था। इसके अलावा, हम शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपण मोटर समारोह पर कोई दीर्घकालिक प्रभाव था कि सत्यापित।

हमारी प्रारंभिक प्रकाशन के बाद से, यह भी अनुसूचित जाति में लंबी अवधि के इमेजिंग सक्रिय करने के वैकल्पिक तरीकों कहीं और 31-33 में वर्णित किया गया है। इस प्रोटोकॉल हम विकसित रीढ़ की हड्डी में चैम्बर दाखिल करने के लिए हमारी प्रक्रिया को दर्शाता है।

Protocol

नोट: देखभाल और इस पत्र में सभी चूहों की प्रयोगात्मक हेरफेर कॉर्नेल विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. सर्जरी के लिए स्थापित

  1. एक आटोक्लेव या अनुमोदित नसबंदी प्रक्रियाओं का उपयोग सभी आवश्यक उपकरण जीवाणुरहित। कम से कम, एक स्केलपेल, कैंची, Vanna कैंची, संदंश, जौहरी पेचकश, कपास swabs, retractors का एक सेट, प्रत्यारोपण (चित्रा 1 ए) और उसके वितरण प्रणाली (चित्रा -1, ई) शामिल हैं।
  2. 70% इथेनॉल और / या उपयुक्त disinfectants के साथ, किसी भी स्टिरियोस्कोप knobs के सहित सभी सतहों के नीचे साफ कर लें।
  3. कस्टम stereotax (चित्रा -1) overlaying और बाँझ पर्दे के साथ benchtop आसपास के द्वारा एक बाँझ क्षेत्र बनाएँ। एक हीटिंग पैड (नियंत्रित अधिमानतः प्रतिक्रिया) stereotax के शीर्ष पर और बाँझ पर्दे के तहत रखा जाना चाहिए।

2. की तैयारीसर्जरी के लिए माउस

  1. दर साँस लेने में लगभग एक सांस / सेक करने के लिए धीमा कर देती है जब तक एक प्रेरण कक्ष में 5% isoflurane / ऑक्सीजन के तहत एक माउस anesthetize।
  2. Isoflurane के लोगों तक पहुंचाने के लिए जारी करने के लिए एक नाक शंकु का उपयोग कर, बाँझ क्षेत्र से दूर एक मचान क्षेत्र के लिए माउस का स्थानांतरण। 2% isoflurane कम करें। कॉर्निया सुखाने को रोकने के लिए आंख साल्वे लागू करें।
  3. अंग प्रति इंजेक्शन की मात्रा का लगभग 50% पहुंचाने, 30 ग्राम सुइयों और 3/10 सीसी सिरिंज - intramuscularly 29 का उपयोग कर hindlimbs में 0.05 मिलीग्राम / 100 ग्राम माउस पर glycopyrrolate (एक कोलीनधर्मरोधी दवा) प्रशासन।
    नोट: Glycopyrrolate माउस संज्ञाहरण के तहत है, जबकि फेफड़ों में तरल buildup को रोकने के लिए कार्य करता है।
  4. बिजली क़ैंची का उपयोग, 2 सेमी चौड़ा और वक्ष चाप पर केन्द्रित द्वारा माउस के पृष्ठीय पहलू है, लगभग 3 सेमी लंबे समय के एक हिस्से दाढ़ी। अच्छी तरह से दूर मुंडा क्षेत्र से किसी भी छंटनी बालों को साफ।
  5. मुंडा को subcutaneously और बाहर का निम्न इंजेक्शन प्रशासन29 का उपयोग कर पैच - 30 ग्राम सुइयों और 3/10 सीसी सीरिंज: 1 मिलीग्राम / 100 ग्राम माउस 5% ग्लूकोज खारा में (hydration के लिए), 5 मिलीग्राम / किग्रा माउस ketoprofen (analgesia के लिए एक एनएसएआईडी), 0.2 मिलीग्राम / किग्रा माउस dexamethasone ( एक antiinflammatory स्टेरॉयड) सूजन को कम करने के लिए।
  6. कपास swabs का उपयोग करना, washes के बीच में एक मिनट इंतज़ार, आयोडीन और 70% इथेनॉल के तीन बारी washes के प्रदर्शन करते हैं।
  7. चीरा साइट पर दर्द को कम करने के लिए 30 जी सुइयों और मुंडा पैच के केंद्र के लिए 3/10 सीसी सिरिंज - subcutaneously 29 का उपयोग कर 0.125% Bupivacaine (एक परिधीय तंत्रिका ब्लॉक) के 100 μl प्रशासन।
  8. कस्टम stereotax (चित्रा -1) करने के लिए स्थानांतरण माउस, गुदा थर्मामीटर डालें, और bupivicaine प्रभावी करने के लिए लगभग 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।

3. बेनकाब और 3 आसन्न थोरैसिक कशेरुकाओं के पृष्ठीय laminae साफ

  1. स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करना, ब्याज (2A चित्रा) की कशेरुकाओं के ऊपर एक छोटे (5 मिमी या उससे कम) चीरा बनाने के लिए।
  2. एक स्केलपेल या शल्य कैंची का प्रयोग, धीरे त्वचा और अंतर्निहित मांसपेशियों के बीच संयोजी प्रावरणी अलग कर देना।
  3. संभव है (चित्रा 2 बी) के रूप में बड़े रूप में काम कर रहे एक क्षेत्र के लिए अनुमति देता है, त्वचा वापस पकड़ retractors का प्रयोग करें। छाती पर बोझ बढ़ाने के लिए और जिससे सांस लेने में बाधा डालती नहीं ख्याल रखना।
  4. संदंश की एक जोड़ी, पकड़ overlying मांसपेशियों के माध्यम से उजागर किया जाएगा कि व्याख्यान चबूतरे वाला सबसे बांस का उपयोग करना। एक स्केलपेल का प्रयोग, दूर सभी 3 कशेरुकाओं (चित्रा -2) से पृष्ठीय प्रक्रिया के दोनों तरफ के ऊतकों में कटौती।
  5. एक स्केलपेल ब्लेड, कपास swabs, और / या हड्डी खुरचनी के किसी भी संयोजन का उपयोग करना, पृष्ठीय laminae (चित्रा 2 डी) से सभी overlying ऊतक को हटा दें।
  6. शल्य कैंची का प्रयोग, ध्यान दोनों latera पर कशेरुकाओं से जुड़ी tendons दूर कटौतीस्पाइनल कॉलम (चित्रा 2 ई) के एल किनारों।
  7. स्केलपेल का उपयोग करना, धीरे से एक स्वच्छ क्लेम्पिंग सतह प्रदान करने के लिए संभव के रूप में कशेरुका स्तंभ के पार्श्व किनारों से ज्यादा के रूप में ऊतक को हटा दें।
  8. धीरे से एक हड्डी खुरचनी और / या कपास झाड़ू का उपयोग कर किसी भी शेष मुलायम ऊतकों की कशेरुकाओं debride। कहीं और शल्य कैंची (चित्रा 2 एफ) का उपयोग कर किसी भी असंगत ऊतक दूर ट्रिम।
    नोट: यह clamping और कशेरुकाओं सफाई से उजागर कर रहे हैं कि पृष्ठीय laminectomy प्रदर्शन कर दोनों के लिए आवश्यक है। एक cauterizer बाद रक्तस्राव को नियंत्रित करने में उपयोगी हो सकता है।
  9. त्वचा (चित्रा 2 एफ) के अलावा कशेरुका स्तंभ के आसपास के ऊतक वापस पकड़ retractors Shift।
  10. प्रसव के पदों पर prongs के लिए प्रत्यारोपण पक्ष सलाखों देते हैं और (चित्रा 1E के रूप में) के बाद धारकों में इन लोड।
  11. Securel धारण करने के लिए अभी काफी दबाव लागू करने, एक ओर सलाखों का उपयोग तीन कशेरुकाओं दबानावाई (चित्रा 2 जी, एच)। 3 कशेरुकाओं के एक स्तर क्लेम्पिंग सुनिश्चित करने में मदद करने के लिए संदंश का प्रयोग करें। कई प्रयासों के लिए आवश्यक हो सकता है कि ध्यान दें। पक्ष सलाखों के स्तर पर और laminectomy के प्रदर्शन के लिए समानांतर पूर्व दोनों कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें।
  12. ध्यान से स्वच्छ और कपास swabs clamped का उपयोग कशेरुकाओं के पृष्ठीय सतह सूखी।

4. एक पृष्ठीय Laminectomy सम्पन्न

  1. औसत दर्जे का clamped बांस की एपीड्यूरल अंतरिक्ष में Vannas कैंची के सुझावों डालें और हल्के ढंग से संभालती निचोड़; हड्डी सूखी है, तो यह पृष्ठीय लामिना की लंबाई के साथ दरार चाहिए। लामिना जारी करने के लिए contralateral पक्ष पर इस प्रक्रिया को दोहराएँ।
  2. धीरे ध्यान से लामिना का व्याख्यान चबूतरे वाला और दुम सिरों पर किसी भी संयोजी ऊतक दूर कटौती और इसे दूर लिफ्ट, संदंश के साथ पृष्ठीय प्रक्रिया द्वारा ढीला लामिना मनोरंजक।
  3. 0.9% खारा और / या कृत्रिम मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी द्रव (ACSF) का उपयोग करना, अच्छी तरह से किसी भी रक्त overlyi दूर धोनेरीढ़ की हड्डी एनजी। अतिरिक्त तरल पदार्थ को अवशोषित करने के लिए कपास swabs का प्रयोग करें।
  4. Vannas कैंची का प्रयोग, ध्यान से वापस प्रत्यारोपण के पक्ष सलाखों के लिए हड्डी के पार्श्व किनारों ट्रिम। फिर, दूर धोने और कपास swabs और खारा / ACSF का उपयोग कर खून बह रहा नियंत्रित करते हैं।
  5. 30 ग्राम सुई - periosteum के एक हिस्से को अलग और रीढ़ की हड्डी overlies गया है कि घटना में, धीरे कपास swabs और / या 29 का उपयोग करते हुए इस ऊतक को हटा दें। प्रक्रिया के इस हिस्से में रीढ़ की हड्डी की चोट पहुंचाना नहीं ख्याल रखना। कसकर लपेटा ड्यूरा मेटर के साथ ढीला periosteum भ्रमित मत करो।
  6. ध्यान से, एक या दंत एक्रिलिक और cyanoacrylate (चित्रा 2I) के दोनों साथ हड्डी के शेष उजागर किनारों को सील। Glues के उजागर रीढ़ की हड्डी पर प्रवाह करने की अनुमति देने के लिए नहीं विशेष ध्यान रखना।

5. सील चैंबर

  1. 4 स्लॉट पक्ष सलाखों पर चार छेद के साथ अप लाइन और कहा कि उद्घाटन उजागर स्पिन overlies तो ध्यान से ऊपर थाली स्थित करेंअल कॉर्ड (चित्रा 1 बी और 2J)।
  2. जौहरी पेचकश का प्रयोग, ध्यान संदंश की एक और जोड़ी के साथ एक प्रकार का शराबी की शाफ्ट स्थिर, पहला पेंच शुरू करते हैं। इस स्तर पर पेंच कसने, लेकिन पहले कुछ धागे लगे हुए हैं, इसलिए है कि यह न डालें। अन्य तीन शिकंजा के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
    नोट: यह इस स्तर पर स्थिति शिकंजा मदद करने के लिए टाइटेनियम या अन्य गैर magnetizable संदंश का उपयोग करने के लिए उपयोगी है।
  3. जगह में सभी चार शिकंजा के साथ शिकंजा मजबूती से (चित्रा 2K) सुरक्षित हैं जब तक प्रत्येक छोटे वेतन वृद्धि में एक ही राशि के द्वारा बारी-बारी से पेंच कस लें। ऊपर थाली इस प्रक्रिया के दौरान फ्लेक्स के लिए यह असामान्य बात नहीं है कि ध्यान दें। पेंच सिर तोड़ सकते हैं और अत्यधिक नीचे दबाव दबाना बेदखल और / या रीढ़ की हड्डी में चोट में परिणाम देगा के रूप में, बहुत ज्यादा शिकंजा कसने के लिए नहीं ख्याल रखना।
  4. रीढ़ की हड्डी और कांच की खिड़की के बीच की जगह को भरने के लिए एक सिलिकॉन elastomer का प्रयोग करें। यह हरिणी क्योंकिइलाज के दौरान एसिटिक एसिड का उत्पादन नहीं है, KwikSil ब्रांड इलास्टोमेर और मिश्रण सुझावों का उपयोग करें। उजागर रीढ़ की हड्डी के लिए सिलिकॉन की एक उदार हिस्से को लागू करें। मिश्रण सिरे से पूर्व रीढ़ की हड्डी के लिए आवेदन करने के लिए हवाई बुलबुले युक्त किसी भी सिलिकॉन से छुटकारा पाने के लिए ध्यान रखना।
  5. कार्य जल्दी, धीरे ऊपर थाली में इनसेट में एक 5 मिमी # 0 coverslip दबाएँ। धीरे-धीरे रीढ़ की हड्डी के चारों ओर तरल इलास्टोमेर निचोड़ है, लेकिन रीढ़ की हड्डी संपीड़न (चित्रा 2L) में परिणाम नहीं करने के लिए पर्याप्त दबाव लागू करें। इलास्टोमेर के लिए समय निर्धारित करना इतना coverslip के तेजी से लागू किया जाता है, यकीन है कि लगभग 90 सेकंड है।
  6. 5.5 - एक असफल सील की घटना में, इलास्टोमेर की स्थापना की है, जब तक धीरे संदंश के साथ प्रत्यारोपण से इसे हटाने, और 5.4 दोहराने प्रतीक्षा करें।
  7. दंत एक्रिलिक / cyanoacrylate साथ exuded इलास्टोमेर के किनारों को कवर और रीढ़ की हड्डी की सतह पर स्थानांतरण से इलास्टोमेर को रोकने के लिए जितना संभव आसपास के हड्डी का पालन करें।
  8. Retractors निकालें और प्रत्यारोपण के किनारे के आसपास त्वचा को खींच। Cyanoacrylate का प्रयोग, प्रत्यारोपण (चित्रा 2 एम, एन) के किनारों को त्वचा पालन करें।
  9. डालें # 0-80 - 1/4 "ऊपर थाली के पंखों (चित्रा 1C और 2 ओ) में शिकंजा निर्धारित किया है।
  10. दंत एक्रिलिक का प्रयोग, ऊपर थाली (चित्रा 2P) के पेंच स्लॉट में किसी भी अंतराल सील।

6. पश्चात की देखभाल

  1. एक बड़े साफ पिंजरे में संज्ञाहरण और जगह से पशु निकालें। पिंजरे चैम्बर पर कुछ भी रोड़ा नहीं होगा कि पर्याप्त बड़ी है सुनिश्चित करें कि पिंजरे भर में सामान्य हरकत के दौरान (जैसे एक पानी की बोतल और / या भोजन के लिए वी के आकार डुबकी के रूप में)।
    ध्यान दें: एक मानक चूहा पिंजरे आदर्श है।
  2. पशु ठीक हो जाए, जबकि एक गर्म सतह पर पिंजरे रखें। यह पूरी तरह से ठीक हो गया है, जब तक अन्य जानवरों की कंपनी के लिए माउस वापस नहीं करते।
  3. पशु beha जाँचेंदर्द या संकट और प्रत्यारोपण अखंडता के संकेत के लिए 2 घंटा postoperation - 1 भीतर vior।
    नोट: सामान्य परिस्थितियों के अंतर्गत, पशु आंदोलन करने के लिए मामूली perturbations साथ ambulate करने में सक्षम होना चाहिए।
  4. वजन को मापने और व्यवहार की निगरानी, ​​पहले 72 घंटे के लिए 12 घंटा - पशु हर 8 जाँच करने के लिए आगे बढ़ें। जानवरों रात के दौरान सक्रिय और मोबाइल हैं कि जाँच करें। जमीन के रूप में गीला भोजन पानी या पोषण जैल, चाउ छर्रों के साथ मिश्रित चाउ, और पीने के पानी जमीनी स्तर पर प्रदान की जानी चाहिए। चमड़े के नीचे या intraperiotoneal इंजेक्शन द्वारा अतिरिक्त जलयोजन आवश्यक के रूप में प्रदान की जानी चाहिए।
  5. Postoperatively, 24 और 48 घंटा समय बिंदुओं पर 5 मिलीग्राम / किग्रा माउस ketoprofen और 0.2 मिलीग्राम / किग्रा माउस dexamethasone subcutaneously प्रशासन। इसके अतिरिक्त, .005-0.010 मिलीग्राम / 100 ग्राम माउस 72 घंटा के लिए चमड़े के नीचे इंजेक्शन से हर 8 घंटा प्रशासित किया जाना चाहिए।

7. vivo इमेजिंग में

  1. के तहत एक माउस anesthetizeदर साँस लेने तक एक प्रेरण कक्ष में 5% isoflurane / ऑक्सीजन लगभग एक सांस / सेक करने के लिए धीमा कर देती है।
  2. आपके सुझाव नियंत्रित हीटिंग पैड के साथ कस्टम stereotax (चित्रा -1) करने के लिए माउस स्थानांतरण और गुदा थर्मामीटर डालें। 2% isoflurane कम करें।
  3. अंग प्रति इंजेक्शन की मात्रा का लगभग 50% पहुंचाने, 30 ग्राम सुइयों और 3/10 सीसी सिरिंज - 29 का उपयोग कर hindlimbs में glycopyrrolate 0.05 मिलीग्राम / 100 ग्राम माउस intramuscularly प्रशासन।
  4. Subcutaneously खारा में 1 मिलीग्राम / (hydration के लिए) 100 ग्राम माउस 5% ग्लूकोज एक बार घंटा प्रति प्रशासन।
  5. सर्जरी (चित्रा 1F) के लिए इस्तेमाल पद धारकों में पिरोया चैम्बर धारकों डालें। ऊंचाई समायोजित करें और ऊपर थाली में सेट शिकंजा पर पदों मोड़।
  6. दोनों धारकों संलग्न के साथ सीने आज़ादी से प्रेरणा पर विस्तार कर सकते हैं, जब तक पद धारकों में धारकों तरक्की।
    नोट: धारकों की फर्म लगाव और छाती significan से मुक्त विस्तार दोनोंtly साँस लेने की वजह से गति कलाकृतियों को कम।
  7. के रूप में वांछित इमेजिंग प्रदर्शन।
  8. इमेजिंग पूरा हो गया है, कम पदों, चैम्बर धारकों बंद मोड़ ठीक करने के लिए एक गर्म सतह पर गुदा थर्मामीटर, और जगह माउस को हटा दें। यह पूरी तरह से ठीक हो गया है, जब तक अन्य जानवरों की कंपनी के लिए माउस वापस नहीं करते।

Representative Results

उपरोक्त प्रक्रिया का पालन करके, सर्जरी के प्रत्येक चरण चित्रा 2 में उल्लिखित सर्जरी के प्रत्येक चरण के लिए परिणाम की नकल करना चाहिए। विशेष देखभाल कांच के तहत हवाई बुलबुले को खत्म करने के लिए सिलिकॉन elastomer जब आवेदन ले लिया है या कम से कम वे कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए रुचि के क्षेत्र (चित्रा 2L) की परिधि में स्थित है। एक अनुभवी सर्जन के लिए, शल्य चिकित्सा के दौरान या पहले 24 घंटा postsurgery के भीतर या तो इच्छामृत्यु की आवश्यकता होती है शल्य जटिलताओं में आपरेशन के लगभग 20% होते हैं। इन जटिलताओं सबसे अक्सर अत्यधिक नरम ऊतक ख़ून का बहाव या सुरक्षित रूप से कशेरुका स्तंभ के लिए चैम्बर संलग्न करने की विफलता से उत्पन्न होती हैं।

सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित कक्षों में, खिड़की आम तौर पर कई सप्ताह (चित्रा 3) के लिए ऑप्टिकली पारदर्शी बनी हुई है। सर्वश्रेष्ठ प्रयासों के बावजूद, एक अपारदर्शी, रेशेदार, नियोप्लास्टिक विकास अक्सर आंशिक obscuri में जिसके परिणामस्वरूप, कुछ दिनों के भीतर रूपोंखिड़की के एनजी (चित्रा -3 सी - एफ, काले धराशायी लाइन)। फ्लोरोसेंट संरचनाओं इस रेशेदार ऊतक के नीचे 2PEF माइक्रोस्कोपी का उपयोग को देखने के लिए मुश्किल है। हम सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित खिड़कियों के लगभग 50% postoperatively के अधिक से अधिक 5 हफ्तों के लिए स्पष्ट शेष के साथ, परिणामों के एक bimodal वितरण मिल जाए, और लगभग 50% 1 के भीतर समझने में कठिन होता जा रहा है - 3 सप्ताह। 2PEF इमेजिंग में बाधा नहीं है, जो - देखने खिड़की अनुभव में या ड्यूरा (एफ, हरी तारक चित्रा 3 डी) के ऊपर neovascularization का केवल एक मामूली डिग्री के भीतर स्पष्ट है, ज्यादातर स्थानों रहते हैं कि खिड़कियों के लिए। हमारे पिछले अध्ययन में 30 कपाल खिड़की की तैयारी 5 में देखा है कि के अनुरूप हल्के सूजन का संकेत, खिड़की और आसन्न कशेरुकाओं के तहत एक microglia में वृद्धि नहीं बल्कि अस्थिकणिका घनत्व दिखाया।

पृष्ठीय रूट gangl के एक सबसेट में पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों मेंआइए (DRG) न्यूरॉन्स (YFPH लाइन, जैक्सन लैब्स), एक्सोन स्पष्ट रूप से बाद operatively सप्ताह के लिए अलग पहचाना थे (चित्रा -4 ए और बी) और के रूप में लंबे समय से एक जानवर में चार महीने के रूप में (डेटा) नहीं दिखाया। रक्त वाहिकाओं (चित्रा -4 ए और बी) रक्त प्लाज्मा में dextran के लेबल वाले रेट्रो orbitally इंजेक्शन लगाने फ्लोरोसेंट टेक्सास लाल द्वारा दिखाई किए गए थे। Microglia भी एक CX3CR1 तोड़े में माउस में GFP व्यक्त चूहों में कल्पना थे (CX3CR1-GFP; जैक्सन लैब्स) YFPH रेखा (चित्रा 4C) को पार कर गया। इसके विपरीत है और संकल्प की वजह से पहले से 30 में वर्णित एक रेशेदार अतिवृद्धि के गठन के लिए समय (चित्रा 4C) पर विनय बिगड़ी है। हम नियमित रूप से हर 12 घंटे के रूप में के रूप में अक्सर मृत्यु दर के बिना एक ही सत्र में तीन घंटे के लिए imaged और। सत्र की अवधि और आवृत्ति प्रयोगशाला जानवरों को दर्द और संकट के साथ नैतिक विचारों के साथ संवेदनाहारी प्रेरण, सहवर्ती के लिए जानवर की सहिष्णुता द्वारा सीमित है।

< रख-together.within पृष्ठ = "हमेशा">: के लिए पी वर्ग = "jove_content" चित्रा 1
Figure1। एक कस्टम शल्य सूट आरोपण के दौरान चेंबर डिलीवरी की सुविधा और बाद इमेजिंग सत्र के दौरान चेंबर स्थिर। दो पक्ष-बार और एक शीर्ष प्लेट (ए) रीढ़ की हड्डी में चैम्बर (सी) में छोटे शिकंजा का उपयोग कर (बी) इकट्ठा कर रहे हैं। बढ़ाई पदों (डी) के साथ एक शल्य तालिका पकड़े पिन का उपयोग कर कशेरुकाओं (ई) की ओर सलाखों के वितरण और clamping के लिए अनुमति देता है। बाद इमेजिंग सत्र के बजाय प्रत्यारोपण (एफ) के पंखों पर सेट शिकंजा के माध्यम से चैम्बर के लिए संलग्न करने के लिए आंतरिक रूप से पिरोया पदों का उपयोग करें। इस आंकड़े के पैनल बी प्रकृति प्रकाशन समूह से अनुमति के साथ Farrar एट अल।, प्रकृति के तरीके, 2012 में 30 से संशोधित किया गया है।96 / 52196fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2. एक पृष्ठीय laminectomy प्रदर्शन किया है और एक पुरानी इमेजिंग कक्ष रीढ़ की हड्डी के लिए ऑप्टिकल पहुँच प्रदान करने के लिए प्रत्यारोपित किया जाता है। प्रक्रिया असेंबल में वर्णित है। सबसे पहले, त्वचा (पैनल ए, बी, प्रोटोकॉल वर्गों 3.1-3.4) और मांसपेशियों (सी; 3.5) तीन अंतर्निहित कशेरुकाओं का पर्दाफाश करने से मुकर रहे हैं। इन तीन कशेरुकाओं overlying ऊतक निकाल दिया जाता है (डी, ई, एफ, 3.6-3.10) वे दोनों पक्षों (; 3.12 जी, एच) पर clamped रहे हैं और इससे पहले कि पार्श्व प्रक्रियाओं साफ scraped कर रहे हैं। ध्यान से, केंद्रीय बांस के पृष्ठीय लामिना हटा दिया है और हड्डी के किनारों (मैं सील (जम्मू; 5.1) लागू किया जाता है और शिकंजा स्थिति (कश्मीर, 5.3) में बांधा सिलिकॉन elastomer और कांच कवर (; 5.5 एल) के साथ चैम्बर सील करने से पहले चैम्बर सुरक्षित करने के लिए। प्रसव पिन (एम; 5.8) को हटा रहे हैं के बाद, त्वचा चैंबर के पक्षों से चिपके है (एम, एन, 5.8) और सेट शिकंजा पंखों (हे; 5.9) में डाला जाता है। (P; 5.10) अंत में, पेंच स्लॉट दंत एक्रिलिक के साथ सील कर रहे हैं। और माउस को ठीक करने के लिए एक साफ पिंजरे में रखा गया है इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3

चित्रा 3. एक पुरानी रीढ़ की हड्डी में चैम्बर ऑप्टिकली पारदर्शी ov रहता हैकई हफ्तों एर। कई मिनट (ए) से postoperatively के तीन सप्ताह (एफ) को लेकर रीढ़ की हड्डी के व्हाइट प्रकाश छवियों,। संवहनी स्थलों सब समय अंक (पीले तीर) में पहचाने जाने योग्य हैं। थोड़ा परिवर्तन एक दिन postsurgery (बी) में देखा जाता है। घने रेशेदार अतिवृद्धि (सी - सही कम पर धराशायी लाइन से घिरा एफ, वर्तमान) के रूप में जल्दी के रूप में तीन दिन और इमेजिंग क्षेत्र के आंशिक घबराहट में परिणाम है। हल्के neovascularization (डी, ई, एफ, हरी तारक) भी मौजूद है, लेकिन। सफेद रोशनी या 2PEF इमेजिंग में मूल वाहिका अस्पष्ट नहीं करता इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4

आंकड़ा एक पुरानी रीढ़ की हड्डी में चैम्बर दोहराने सर्जरी के लिए आवश्यकता के बिना दोहराया बहु फोटॉन इमेजिंग के लिए अनुमति देता है 4.। रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय funiculi में DRG के एक्सोन (हरा) के एक सबसेट में YFP व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों के दोहराया इमेजिंग कॉर्ड और intravascular डाई इंजेक्शन (ए, बी) द्वारा लेबल वाहिका (लाल)। microglia (चमकीला गुलाबी) की गतिविधि भी Thy1-YFP / CX3CR1-GFP के डबल ट्रांसजेनिक चूहों (सी) में समय के साथ लगाया जा सकता है। Axons और microglia दृश्यमान रहते हैं, समय के साथ विनय विपरीत और संकल्प गिरावट (सी)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहाँ का प्रदर्शन तकनीक दोहराया, समय चूक के लिए अनुमति देता है, कई हफ्तों के लिए बाहर पृष्ठीय माउस अनुसूचित जाति के vivo इमेजिंग बाद सर्जिकल प्रक्रियाओं के लिए आवश्यकता के बिना ऑपरेशन के बाद। इस प्रक्रिया को दोहराएँ सर्जरी इमेजिंग अध्ययन से अधिक या सेलुलर गतिशीलता पर जानकारी खो जाती है, जहां portmortem ऊतकीय दृष्टिकोण से काफी सुधार का प्रतिनिधित्व करता है। हम पहले 30 विवो में एससीआई विकृति के अध्ययन के लिए इस तकनीक का मूल्य प्रदर्शन किया है।

इमेजिंग की अधिकतम अनुदैर्ध्य हद तक अनुसूचित जाति के पृष्ठीय सतह पर एक घने, रेशेदार ऊतक के विकास के द्वारा निर्धारित किया गया था। समय के साथ, इस वृद्धि छवि के विपरीत और संकल्प के नुकसान के परिणामस्वरूप। यह वृद्धि भी वैकल्पिक शल्य चिकित्सा की तैयारी 31 में देखा गया है। Anecdotally, हम ध्यान की सतह सील, रक्त उत्पादों को दूर करने के पृष्ठीय अनुसूचित जाति सतह धोने से इस वृद्धि को कम किया जा सकता है कि मनायाcyanoacrylate साथ कटौती की हड्डी, सिलिकॉन elastomer के साथ अच्छी तरह से चैंबर के किनारों सील, और पृष्ठीय अनुसूचित जाति और गिलास को कवर के बीच मध्य अंतरिक्ष कम से कम।

हाल ही में, एक polycarbonate कक्ष का उपयोग अपने स्वयं के लिए इसी तरह की एक और दृष्टिकोण 32 प्रदर्शित किया गया है। यह हमारे स्टेनलेस स्टील भागों के लिए ऐसा नहीं है जो एक्स-रे और ध्वनिक इमेजिंग तौर तरीकों के साथ संगत है के बाद से पॉली कार्बोनेट का उपयोग लाभदायक है। हालांकि, 3 डी प्रिंटर की अब सर्वव्यापी तकनीक के साथ, चैम्बर भागों विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुरूप सामग्री की एक विस्तृत विविधता से निर्मित किया जा सकता है। हमने हाल ही में एक स्पष्ट photopolymer में हमारे सभी भागों छपा है।

एक बंद चैंबर के एक प्रमुख नुकसान दवाओं या अनुसूचित जाति इमेजिंग 34 के लिए उपयुक्त बहिर्जात रंगों के दोहराया खुराकों प्रशासन की अक्षमता है। हालांकि, हमारे वर्तमान प्रणाली के यांत्रिक स्थिरता पर capitalizing करके, हम पहले से ही सफल करने के लिए हमारे वर्तमान कक्ष का इस्तेमाल किया हैly के भी एक बंद कक्ष प्रणाली (अप्रकाशित काम) में एक से अधिक समय बिंदुओं पर दवा वितरण के लिए अनुमति दी है जो एक subcutaneously प्रत्यारोपित इंजेक्शन बंदरगाह से जुड़ा एक intrathecal कैथेटर, लंगर। इसके अलावा, कारण ऊपर थाली की मॉड्यूलर प्रकृति के कारण, इस तैयारी के भविष्य के संस्करणों चिकित्सीय एजेंटों और फ्लोरोसेंट लेबल दोनों के दोहराया आवेदन के लिए अनुमति देने के लिए एक resealable कक्ष शामिल होंगे। यह दवा वितरण के लिए इलेक्ट्रोड, ऑप्टिकल सम्मिलित करता है, और बंदरगाहों की रिकॉर्डिंग के लिए mounts के साथ शीर्ष प्लेटों की कल्पना करना भी संभव है। इस तरह के जोड़ की संभावना Fenrich एट अल। 31 से अधिक minimalist प्रणाली का उपयोग कर लागू करने के लिए और अधिक चुनौतीपूर्ण होगा। अंत में, हमारे चैम्बर विविध प्रयोगों के आधार पर किया जा सकता है, जिस पर एक प्रवेश द्वार के मंच प्रदान करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vannas scissors Fine Science Tools 15000-04
forceps, scissors, scalpel, etc. Fine Science Tools multiple 
retractor kit -magnetic fixator Fine Science Tools 18200-02
retractor kit -retractor Fine Science Tools 18200-09 other retractors may also be used
retractor kit -elastomer Fine Science Tools 18200-07
feedback controlled heating blanket CWE Inc. Model: TC-1000 Mouse              Part No. 08-13000
stereotax see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
spinal chamber see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
spinal chamber holders see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
Cyanoacrylate glue Loctite Loctite 495 multiple suppliers
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder) Teets Mfg. Part: 8101 multiple suppliers
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid) Teets Mfg. Part: 8501 multiple suppliers
Glycopyrrolate MWI Veterinary Supply MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767
Bupivacaine MWI Veterinary Supply MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)
Ketoprofen MWI Veterinary Supply MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)
Dexamethasone MWI Veterinary Supply MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)
KwikSil Elastomer World Precision Inc. KWIK-SIL
KwikSil Mixing Tips World Precision Inc. KWIKMIX

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 94 रीढ़ की हड्डी, multiphoton माइक्रोस्कोपी पशु शल्य चिकित्सा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी जैव चिकित्सा प्रकाशिकी
अनुदैर्ध्य के लिए एक रीढ़ की हड्डी में चैंबर दाखिल के लिए एक प्रक्रिया<em&gt; Vivo</em&gt; माउस स्पाइनल कॉर्ड की इमेजिंग
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Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A… More

Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (94), e52196, doi:10.3791/52196 (2014).

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