I den här videon beskriver vi ett förfarande för att implantera en kronisk optisk avbildning kammare över ryggens ryggmärgen hos en levande mus. Kammaren, kirurgiska ingrepp, och kronisk avbildning granskas och demonstreras.
Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.
Time-lapse in vivo mikroskopi i intakta organismer möjliggör direkt visualisering av komplexa biologiska processer som är otillgängliga för traditionell enkeltidpunktsanalysen, såsom immunohistokemi. Specifikt multi-foton mikroskopi (MPM) 1 möjliggör avbildning i spridnings vävnad, såsom gnagare neocortex, där avbildning upp till 2,3 och över 4 1 mm har uppnåtts. I kombination med kirurgiska preparat 5-7 där ett enda förfarande möjliggör optisk access till hjärnan i veckor till månader, har dessa mikroskopi metoder använts för att studera dynamiska processer i hjärnan hos friska och sjukdomstillstånd 8-11. Dessutom har protokoll utvecklats 12,13 som ger för in vivo imaging i vaken (dvs icke sövda) djur, vilket möjliggör cellulär upplösning funktionell avbildning under beteendeanalyser. Dessa protokoll har använts för comparisons för korrelerade nervaktivitet 14, astrocyternas kalcium signalering 15 i bedövade och vakna djur, identifiering av uppgiftsspecifika neuronala kluster 16, och förmågan hos nervceller att diskriminera objekt plats vid morrhår stimulering 17.
Med tanke på den potential denna metod för att belysa hälsosamma och patologiska mekanismer, time-lapse in vivo imaging tillämpades på den musen ryggmärgen (SC), vilket möjliggör identifiering av akut axonal degeneration (AAD) som en sjukdom mekanism 18. Senare studier undersökt effekter av perifera lesioner på dorsalrotsganglier (DRG) Axon förnyelse 19, rollen av blodkärl i Axon förnyelse 20, gliaceller kemotaxi som svar på skada 21, T-cellmigration i experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) 22, aktivitet av mikroglia 23,24 och astrocyter 25 som svar på amyotrophic lateralskleros (ALS), vilken roll STAT-3 i axonal groning efter SC skada (SCI) 26, och en mekanism för axon förlust och återhämtning i EAE 27. Trots framgångarna med dessa metoder, var alla dessa studier begränsade till antingen en enda bildsession, vilket begränsar studier till kortsiktiga dynamiken, annars krävs upprepade kirurgiska öppningar av djuret vid varje avbildning tidpunkt, begränsa antalet tidpunkter tillgängliga och ökar sannolikheten för påverkande experimentella artefakter. Protokollen för dessa operationer har tidigare 28,29 publicerats.
Nyligen publicerade vi en teknik 30 för implantation av en kronisk spinal kammare som möjligtidsförlopp MPM avbildning i musen SC över flera veckor utan behov av upprepade operationer. I korthet inkluderade detta kirurgiska preparat utför laminektomi i nedre bröstryggraden och implantation av en fyrdelad kammare. Kammaren ingårtre special bearbetade detaljer i rostfritt stål som klämda kotorna omger laminektomi, och ett glas täck placeras över SC och säkras med silikon elastomer. Denna teknik tillåtet för rutin avbildning ut till mer än 5 veckor postoperativt hos friska och skadade stater utan behov av upprepade operationer. Antalet imaging tidpunkter begränsades endast av den frekvens vid vilken djuret kan tolerera narkosinduktion. Imaging livstid begränsades av tillväxten av en tät, fibrös vävnad över ytan på SC. Dessutom verifierade vi att det kirurgiska implantatet hade ingen långsiktig effekt på motoriska funktioner.
Sedan vår första publicering, har alternativa tillvägagångssätt också möjliggör långsiktig avbildning i SC beskrivits på annan plats 31-33. Detta protokoll visar vårt förfarande för implantering ryggradskammaren vi utvecklat.
Tekniken demonstreras här tillåter upprepad, Time-lapse, in vivo imaging av ryggens musen SC ut till många veckor efter operativt utan behov av efterföljande kirurgiska ingrepp. Detta förfarande innebär en avsevärd förbättring jämfört med upprepad kirurgi imaging studier eller över portmortem histologiska metoder, där information om cellulära dynamik är förlorad. Vi har tidigare 30 visade värdet av denna teknik för att studera SCI patologi in vivo.
Den maximala längsgående utsträckningen av avbildning bestämdes genom tillväxten av en tät, fibrös vävnad över den dorsala ytan av SC. Med tiden ledde denna tillväxt i förlust av bildens kontrast och upplösning. Denna tillväxt har också setts i alternativa kirurgiska preparat 31. Anekdotiskt, har vi observerat att denna tillväxt kan minimeras genom att försiktigt tvätta ryggens SC ytan för att avlägsna blodprodukter, försegling ytaden skurna ben med cyanoakrylat, tätningskanter kammaren väl med silikonelastomer, och minimera det interstitiella utrymmet mellan den dorsala SC och täckglaset.
Nyligen har en annan metod som liknar vår egen med hjälp av en polykarbonatkammare visats 32. Användningen av polykarbonat är fördelaktigt eftersom det är kompatibelt med röntgen och akustiska avbildningsmodaliteter, vilket inte är fallet för våra delar av rostfritt stål. Men med det nu allestädes närvarande tekniken för 3D-skrivare, kammardelar kan tillverkas av en mängd olika material för att passa specifika behov. Vi har nyligen skrivit ut alla våra delar i en klar fotopolymer.
En viktig nackdel med en sluten kammare är oförmågan att administrera upprepade doser av läkemedel eller exogena färgämnen lämpliga för SC avbildning 34. Men genom att utnyttja den mekaniska stabiliteten i vårt nuvarande system, vi har redan använt vår nuvarande kammare till framgångsrikly förankra en intratekal kateter som är ansluten till en subkutant implanterad injektionsöppning, som tillåtet för läkemedelsavgivning vid flera tidpunkter och med i en sluten kammare system (opublicerat arbete). Vidare, beroende på den modulära naturen hos den övre plattan, kommer framtida versioner av denna beredning innefattar en återförslutningsbar kammare för att möjliggöra upprepad tillämpning av båda terapeutiska medel och fluorescerande markörer. Det är också möjligt att föreställa bästa plattor med fästen för inspelning elektroder, optiska skär och portar för läkemedelstillförsel. Sådana tillägg skulle sannolikt bli mer utmanande att genomföra med hjälp av mer minimalistiska system Fenrich et al. 31. Sammanfattningsvis ger vår kammare en gateway plattform på vilken olika experiment kan baseras.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-04 | |
forceps, scissors, scalpel, etc. | Fine Science Tools | multiple | |
retractor kit -magnetic fixator | Fine Science Tools | 18200-02 | |
retractor kit -retractor | Fine Science Tools | 18200-09 | other retractors may also be used |
retractor kit -elastomer | Fine Science Tools | 18200-07 | |
feedback controlled heating blanket | CWE Inc. | Model: TC-1000 Mouse Part No. 08-13000 | |
stereotax | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber holders | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
Cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite 495 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder) | Teets | Mfg. Part: 8101 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid) | Teets | Mfg. Part: 8501 | multiple suppliers |
Glycopyrrolate | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602) | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
Bupivacaine | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 029841 (Hospira 116301) | |
Ketoprofen | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193) | |
Dexamethasone | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032) | |
KwikSil Elastomer | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
KwikSil Mixing Tips | World Precision Inc. | KWIKMIX |