In diesem Video, beschreiben wir ein Verfahren zum Implantieren einer chronischen optischen Abbildungskammer über der dorsalen Rückenmark von einer Live-Maus. Die Kammer, chirurgischen Eingriff und chronische Bildgebung werden überprüft und demonstriert.
Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.
Zeitraffer-in-vivo-Mikroskopie in intakten Organismen ermöglicht die direkte Visualisierung von komplexen biologischen Prozesse, die zu den traditionellen Einzelzeitpunktanalyse nicht zugänglich sind, wie Immunhistochemie. Insbesondere Mehrphotonenmikroskopie (MPM) 1 erlaubt für die Bildgebung in streuendem Gewebe, wie beispielsweise Nager Neocortex, wobei Abbildungs bis zu 2,3 und mehr als 4 1 mm erreicht wurde. Wenn mit chirurgischen Vorbereitungen 5-7, in dem ein einziges Verfahren ermöglicht einen optischen Zugang zum Gehirn für Wochen bis Monate kombiniert wurden diese Mikroskopie Ansätze verwendet worden, um dynamische Prozesse im Gehirn von gesunden und erkrankten Zuständen 8-11 studieren. Darüber hinaus wurden Protokolle entwickelt 12,13, die für In-vivo-Bildgebung in wach (dh nicht narkotisierten) Tiere, so dass für zelluläre auflösenden funktionellen Bildgebung bei Verhaltenstests. Diese Protokolle wurden für Comparis verwendetons korrelierter neuronaler Aktivität 14, Astrozyten Calcium-Signal 15 in narkotisierten und wachen Tieren, die Identifizierung von aufgabenspezifischen neuronalen Cluster 16, und die Fähigkeit der Neuronen zur Lage des Objekts auf Whisker Stimulation 17 unterscheiden.
Angesichts der Möglichkeit dieses Ansatzes zu gesunden und pathologischen Mechanismen, Zeitraffer-in-vivo-Bildgebung wurde dem Rückenmark der Maus (SC) aufgebracht aufzuklären, die die Identifizierung von akuten axonale Degeneration (AAD) als Krankheitsmechanismus 18. Anschließende Studien untersuchten Wirkungen der peripheren Läsionen auf Spinalganglien (DRG) Axonregeneration 19, die Rolle von Blutgefäßen in Axonregeneration 20, glial-Chemotaxis als Reaktion auf Verletzung 21, T-Zell-Migration in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) 22, Aktivität Mikroglia und Astrozyten 23,24 25 in Reaktion auf amyotrophic lateraler Sklerose (ALS), die Rolle von STAT-3 in axonalen Sprossung nach SC Verletzungen (SCI) 26 und einen Mechanismus der Axon Verlust und Wiederherstellung in EAE 27. Trotz des Erfolgs dieser Ansätze wurden alle diese Studien, entweder eine einzelne Abbildungs Sitzung beschränkt, wodurch Untersuchungen zur kurzfristigen Dynamik Begrenzung oder auch erforderlichen wiederholten chirurgischen Öffnungen des Tieres bei jedem Abbildungszeitpunkt, wodurch die Anzahl von Zeitpunkten zugänglich und die Erhöhung der Wahrscheinlichkeit einer Verwechslung experimentellen Artefakte. Protokolle für diese Operationen wurden zuvor 28,29 veröffentlicht.
Kürzlich veröffentlichten wir eine Technik, 30 für die Implantation einer chronischen Wirbelsäulen Kammer, die Zeitraffer MPM Bildgebung in der Maus SC über mehrere Wochen freigegeben ohne die Notwendigkeit wiederholter Operationen. Kurz gesagt enthalten diese chirurgische Vorbereitung Durchführung Laminektomie in der unteren Brustwirbelsäule und die Implantation von einer vierteiligen Kammer. Die Kammer enthaltendrei individuelle bearbeiteten Teile aus Edelstahl, der die Wirbel umgebenden Laminektomie und ein Deckglas über das SC plaziert und mit Silikonelastomer gesichert eingespannt ist. Diese Technik erlaubt für Routine-Bildgebung, um mehr als 5 Wochen nach der Operation bei gesunden und verletzten Staaten ohne die Notwendigkeit für Wiederholungsoperationen. Die Anzahl der Bilderzeugungszeitpunkten wurde nur von der Frequenz, mit der das Tier zur Narkoseeinleitung tolerieren beschränkt. Imaging Lebensdauer wurde durch das Wachstum einer dichten, fibrösen Gewebe über die Oberfläche des SC beschränkt. Darüber hinaus überprüft man, daß das chirurgische Implantat hatte keine langfristigen Auswirkungen auf die Motorfunktion.
Seit unserer ersten Veröffentlichung wurden alternative Ansätze auch ermöglicht langfristige Bildgebung in der SC-31-33 an anderer Stelle beschrieben. Dieses Protokoll zeigt unser Verfahren zum Implantieren des Rückenkammer von uns entwickelte.
Die Technik hier gezeigt ermöglicht wiederholt, Zeitraffer, in vivo-Bildgebung des Rücken Maus SC aus, um viele Wochen nach der Operation ohne die Notwendigkeit für eine nachfolgende chirurgische Eingriffe. Dieses Verfahren stellt eine wesentliche Verbesserung gegenüber wiederholter Chirurgie Imaging-Studien oder über portmortem histologischen Ansätzen, bei denen Informationen über zelluläre Dynamik verloren. Wir haben zuvor gezeigt, 30 den Wert dieser Technik zur Untersuchung SCI Pathologie in vivo.
Die maximale Längserstreckung der Bildgebung durch das Wachstum einer dichten, faseriges Gewebe über die dorsale Oberfläche des SC bestimmt. Im Laufe der Zeit ergab sich dieses Wachstum in dem Verlust von Bildkontrast und die Auflösung. Dieses Wachstum wurde auch in alternative chirurgische Präparate 31 gesehen. Gerüchten zufolge wir durch vorsichtiges Waschen des dorsalen SC Oberfläche zu Blutprodukten zu entfernen, Abdichtung der Oberfläche beobachtet haben, dass dieses Wachstum minimiert werden kannder geschnittene Knochen mit Cyanoacrylat Dichtkanten der Kammer gut mit Silikonelastomer und den Zwischenraum zwischen der Rücken SC und dem Deckglas minimieren.
Vor kurzem ein anderer Ansatz ähnlich wie unsere eigene mit einem Polycarbonat Kammer hat sich gezeigt, 32. Die Verwendung von Polycarbonat ist vorteilhaft, da sie mit der X-ray und akustische Bildgebungsverfahren, das nicht der Fall ist für unsere Edelstahlteile kompatibel ist. Doch mit der heute allgegenwärtigen Technologie der 3D-Drucker, Kammerteile können aus einer Vielzahl von Materialien hergestellt werden, um speziellen Anforderungen entsprechen. Vor kurzem haben wir eine klare Photopolymer gedruckt allen Teilen.
Ein wesentlicher Nachteil einer geschlossenen Kammer ist die Unfähigkeit, wiederholte Dosierungen von Medikamenten oder exogene Farbstoffe geeignet für SC-Bildgebung 34 zu verabreichen. Jedoch durch Nutzung der mechanischen Stabilität unserem gegenwärtigen System haben wir bereits unsere Gegenwart Kammer zur erfolgreichen verwendetlich verankern einen intrathekalen Katheter an eine subkutan implantierte Injektionsöffnung verbunden, die für die Arzneimittelabgabe auch in einer geschlossenen Kammer Systems (unveröffentlichte Arbeit) erlaubt zu mehreren Zeitpunkten. Außerdem ist es aufgrund des modularen Aufbaus der oberen Platte werden zukünftige Versionen dieser Zubereitung enthalten eine wiederverschließbare Kammer für wiederholte Anwendung von sowohl therapeutischen Mittel und fluoreszierende Markierungen ermöglichen. Es ist auch möglich, die oberen Platten mit Aufnahmen zur Aufnahme von Elektroden, optische Einsätze und Ports für die Arzneimittelabgabe vorstellen. Solche Zusätze wäre wahrscheinlich schwieriger zu implementieren mit dem minimalistischer System Fenrich et al. 31. Abschließend bietet unseren Kammer ein Gateway Plattform, auf der diverse Experimente basieren.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-04 | |
forceps, scissors, scalpel, etc. | Fine Science Tools | multiple | |
retractor kit -magnetic fixator | Fine Science Tools | 18200-02 | |
retractor kit -retractor | Fine Science Tools | 18200-09 | other retractors may also be used |
retractor kit -elastomer | Fine Science Tools | 18200-07 | |
feedback controlled heating blanket | CWE Inc. | Model: TC-1000 Mouse Part No. 08-13000 | |
stereotax | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber holders | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
Cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite 495 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder) | Teets | Mfg. Part: 8101 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid) | Teets | Mfg. Part: 8501 | multiple suppliers |
Glycopyrrolate | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602) | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
Bupivacaine | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 029841 (Hospira 116301) | |
Ketoprofen | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193) | |
Dexamethasone | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032) | |
KwikSil Elastomer | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
KwikSil Mixing Tips | World Precision Inc. | KWIKMIX |