בסרטון הזה, אנו מתארים הליך להשתלת חדר הדמיה אופטי כרוני על חוט השדרה הגבי של עכבר חי. קאמרי, ההליך כירורגי, וההדמיה כרונית נבדקים והפגינו.
Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.
זמן לשגות במיקרוסקופיה vivo באורגניזמים שלמים מאפשר ההדמיה הישירה של תהליכים מורכבים ביולוגיים שאינם זמינות לניתוח נקודה אחת בזמן מסורתי, כגון אימונוהיסטוכימיה. באופן ספציפי, מיקרוסקופיה רב הפוטון (MPM) 1 מאפשרת הדמיה בפיזור רקמות, כגון הניאוקורטקס המכרסמים, שבו הדמיה של עד 2,3 ועודף של 4 1 מ"מ הושגה. בשילוב עם הכנות כירורגית 5-7 שבהליך יחיד מאפשר גישה אופטית למוח לשבועות עד חודשים, גישות מיקרוסקופי אלה היו בשימוש ללמוד תהליכים דינמיים במוח במצבים בריאים וחולים 8-11. בנוסף, פרוטוקולים פותחו 12,13 המספקים הדמיה in vivo בבעלי חיים ער (כלומר, שאינם מורדמים), המאפשרים להדמיה תפקודית ברזולוציה סלולרית בעת מבחני התנהגות. פרוטוקולים אלה היו בשימוש לcomparisתוספות של פעילות עצבית מתואמת 14, סידן astrocyte איתות 15 בבעלי חיים מורדמים וערים, זיהוי של אשכולות עצביים משימה ספציפית 16, ואת יכולתם של תאי עצב להפלות מיקום אובייקט על גירוי זיף 17.
לאור הפוטנציאל של גישה זו על מנת להבהיר את המנגנונים בריאים ופתולוגיים, זמן לשגות בתחום ההדמיה vivo היה מוחל על חוט השדרה העכבר (SC), המאפשר לזיהוי ניוון axonal החריף (AAD) כמנגנון מחלה 18. מחקרים מאוחרים יותר חקרו את ההשפעות של נגעים היקפיים בגרעיני שורש הגבי (DRG) התחדשות האקסון 19, תפקידם של כלי דם בהתחדשות האקסון 20, chemotaxis גליה בתגובה לפציעה 21, הגירת T-cell בEncephalomyelitis אוטואימוניות הניסיוני (EAE) 22, פעילות 23,24 של מיקרוגליה והאסטרוציטים 25 בתגובה לamyotrophטרשת ic לרוחב (ALS), את התפקיד של STAT-3 בהנבטת axonal לאחר פציעת SC (SCI) 26, ומנגנון של אובדן האקסון והתאוששות ב -27 EAE. למרות ההצלחה של גישות אלה, כל המחקרים הללו היו מוגבלים לאו פגישת הדמיה יחידה, וכך להגביל את הלימודים לדינמיקה לטווח קצר, או אחר הנדרשים חזרו פתחים כירורגית של בעלי החיים בכל נקודת זמן הדמיה, המגבילים את מספר נקודות זמן נגיש ואגדיל את הסבירות של חפצים ניסיוניים בלבול. פרוטוקולים לניתוחים אלה כבר פורסמו בעבר 28,29.
לאחרונה, פרסמנו טכניקה 30 להשתלה של תאים בעמוד השדרה כרוניים שאפשרו הדמיה MPM הזמן לשגות בSC העכבר מעל שבועות מרובים ללא הצורך בניתוחים חוזרים. בקצרה, הכנת כירורגים זה כלול ביצוע laminectomy בעמוד השדרה החזי הנמוכה וההשתלה של תא ארבעה חלקים. החדר כלולשלושה חלקי פלדת אל-חלד מותאם אישית במכונה שהדקו את החוליות המקיפות את laminectomy, וcoverslip זכוכית מונח על SC ומאובטח עם אלסטומר סיליקון. טכניקה זו אפשרה להדמיה שגרתית ליותר מ 5 שבועות לאחר הניתוח במדינות בריאים ונפצעו ללא צורך בניתוחים חוזרים. מספר נקודות זמן הדמיה היה מוגבל רק על ידי התדר שבו בעלי החיים יכולים לסבול אינדוקציה הרדמה. חיים הדמיה היה מוגבל על ידי הצמיחה של רקמה צפופה, סיבית על פני השטח של SC. בנוסף, אנו מאמתים שהשתל הניתוחי אין השפעה לטווח ארוך על תפקוד מוטורי.
מאז פרסומו הראשוני שלנו, גישות חלופיות גם מאפשרות הדמיה לטווח ארוך בSC תוארו במקום אחר 31-33. פרוטוקול זה מדגים ההליך שלנו להשתלת תא השדרה שפיתחנו.
הטכניקה הפגינה כאן מאפשרת חוזר ונשנה, זמן לשגות, ההדמיה in vivo של SC עכבר גב לשבועות רבים לפרסם אופרטיבי ללא צורך בניתוחים שלאחר מכן. הליך זה מהווה שיפור משמעותי על פני בדיקות הדמיה חוזרת-ניתוח או על פני גישות היסטולוגית portmortem, שבו מידע על דינמיקה סלולרית הולכות לאיבוד. יש לנו בעבר 30 הפגין את הערך של טכניקה זו ללימוד פתולוגיה SCI in vivo.
מידת האורך המרבית של הדמיה נקבעה על ידי הצמיחה של רקמה צפופה, סיבית על פני השטח הגב של SC. לאורך זמן, צמיחה זו הביאה לאובדן של ניגוד תמונה ורזולוציה. גידול זה יש גם בהכנות כירורגית חלופיות 31 ראה. במקרי נקודות, יש לנו ציינו כי צמיחה זו ניתן למזער על ידי שטיפה בזהירות את פני השטח SC הגב כדי להסיר מוצרי דם, איטום פני השטח שלהעצם לחתוך עם cyanoacrylate, איטום קצוות של החדר היטב עם אלסטומר סיליקון, ולמזער את מרחב ביניים בין SC הגב ומכסה הזכוכית.
לאחרונה, גישה אחרת דומה לשלנו באמצעות תא פוליקרבונט הודגמה 32. השימוש בפוליקרבונט הוא יתרון שכן הוא תואם עם X-ray ושיטות הדמיה אקוסטית, שזה לא המקרה עבור חלקי הנירוסטה שלנו. עם זאת, עם הטכנולוגיה בכל מקום עכשיו של מדפסות 3D, יכולים להיות מפוברקים ממגוון רחב של חומרי חלקי תא שיתאימו לצרכימים ספציפיים. לאחרונה יש לנו מודפסים כל החלקים שלנו בphotopolymer ברור.
חסרון מרכזי אחד תא סגור הוא חוסר היכולת לנהל מינונים חוזרים ונשנים של תרופות או צבעים אקסוגניים מתאימים להדמית SC 34. עם זאת, על ידי ניצול היציבות המכנית של המערכת הנוכחית שלנו, יש לנו כבר בשימוש התא הנוכחי שלנו למוצלחly לעגן קטטר intrathecal מחובר ליציאת הזרקה תת-עורית המושתלת, אשר אפשר למשלוח סמים בנקודות זמן מרובים אפילו במערכת סגורה קאמרית (עבודה שלא פורסם). יתר על כן, בשל האופי המודולרי של הצלחת העליונה, גרסאות עתידיות של הכנה זו תכלול תא ניתן לאטימה חוזרת כדי לאפשר ליישום חוזר ונשנה של שני סוכנים טיפוליים ותוויות ניאון. אפשר גם לדמיין צלחות עליונה עם mounts להקלטת אלקטרודות, מוסיף אופטי, ויציאות למשלוח סמים. תוספות כזה עלול להיות מאתגרות יותר ליישום באמצעות מערכת מינימליסטי יותר של Fenrich et al. 31. לסיכום, החדר שלנו מספק פלטפורמת שער שעליו ניתן לבסס ניסויים מגוונים.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-04 | |
forceps, scissors, scalpel, etc. | Fine Science Tools | multiple | |
retractor kit -magnetic fixator | Fine Science Tools | 18200-02 | |
retractor kit -retractor | Fine Science Tools | 18200-09 | other retractors may also be used |
retractor kit -elastomer | Fine Science Tools | 18200-07 | |
feedback controlled heating blanket | CWE Inc. | Model: TC-1000 Mouse Part No. 08-13000 | |
stereotax | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber holders | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
Cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite 495 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder) | Teets | Mfg. Part: 8101 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid) | Teets | Mfg. Part: 8501 | multiple suppliers |
Glycopyrrolate | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602) | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
Bupivacaine | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 029841 (Hospira 116301) | |
Ketoprofen | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193) | |
Dexamethasone | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032) | |
KwikSil Elastomer | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
KwikSil Mixing Tips | World Precision Inc. | KWIKMIX |