इस वीडियो में, हम एक लाइव माउस के पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी के ऊपर एक पुरानी ऑप्टिकल इमेजिंग कक्ष दाखिल करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन। कक्ष, शल्य प्रक्रिया, और जीर्ण इमेजिंग की समीक्षा की और प्रदर्शन कर रहे हैं।
Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.
बरकरार जीवों में विवो माइक्रोस्कोपी में समय चूक ऐसे immunohistochemistry के रूप में पारंपरिक एकल समय बिंदु विश्लेषण करने के लिए दुर्गम हैं कि जटिल जैविक प्रक्रियाओं, के प्रत्यक्ष दृश्य सक्षम बनाता है। विशेष रूप से, बहु फोटॉन माइक्रोस्कोपी (यूके) एक ऐसी 2,3 अप करने के लिए और 4 1 मिमी से अधिक इमेजिंग हासिल किया गया है, जहां कृंतक नियोकॉर्टेक्स, के रूप में, ऊतक बिखरने में इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। एक ही प्रक्रिया महीने के लिए सप्ताह के लिए मस्तिष्क के लिए ऑप्टिकल उपयोग की अनुमति देता 5-7, जिसमें शल्य चिकित्सा की तैयारी के साथ संयुक्त, इन माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्यों 8-11 में मस्तिष्क में गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल व्यवहार assays के दौरान सेलुलर संकल्प कार्यात्मक इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, जाग (यानी, गैर anesthetized) पशुओं में vivo इमेजिंग के लिए प्रदान करते हैं कि 12,13 विकसित किया गया है। इन प्रोटोकॉल comparis के लिए इस्तेमाल किया गया हैसहसंबद्ध neuronal गतिविधि 14 की ऑन, anesthetized और जाग पशुओं में 15 सिगनल अस्थिकणिका कैल्शियम, कार्य विशेष न्यूरोनल समूहों 16 की पहचान, और न्यूरॉन्स की क्षमता गलमुच्छा उत्तेजना 17 पर वस्तु स्थान भेदभाव करने के लिए।
एक रोग तंत्र के रूप में 18 तीव्र axonal अध: पतन की पहचान (एएडी) की अनुमति के लिए माउस रीढ़ की हड्डी (अनुसूचित जाति) के लिए लागू किया गया था स्वस्थ और रोग तंत्र, vivo इमेजिंग में समय चूक स्पष्ट करने के लिए इस दृष्टिकोण की क्षमता को देखते हुए। बाद के अध्ययन पृष्ठीय रूट ganglia (DRG) अक्षतंतु उत्थान 19, अक्षतंतु उत्थान 20 में रक्त वाहिकाओं की भूमिका, चोट 21 के जवाब में glial कीमोटैक्सिस, प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित इंसेफैलोमाईलिटिस में टी सेल माइग्रेशन (EAE) 22, गतिविधि पर परिधीय घावों के प्रभावों की जांच amyotroph के जवाब में microglia की 23,24 और astrocytes 25आईसी पार्श्व काठिन्य (ए एल एस), अनुसूचित जाति चोट (एससीआई) 26 के बाद axonal अंकुरण में स्टेट-3 की भूमिका, और EAE 27 में अक्षतंतु हानि और वसूली का एक तंत्र। इन तरीकों की सफलता के बावजूद, इन सभी अध्ययनों समय बिंदुओं सुलभ की संख्या सीमित है, हर इमेजिंग समय बिंदु पर जानवर की शल्य चिकित्सा के उद्घाटन दोहराया आवश्यक बाकी जिससे अल्पकालिक गतिशीलता के लिए पढ़ाई सीमित है, एक एकल इमेजिंग सत्र या तो सीमित करने के लिए, या गया और confounding प्रयोगात्मक कलाकृतियों की संभावना बढ़ रही है। इन सर्जरी के लिए प्रोटोकॉल पहले से 28,29 प्रकाशित किया गया है।
हाल ही में, हम दोहराने सर्जरी के लिए आवश्यकता के बिना कई हफ्तों से अधिक माउस अनुसूचित जाति में समय व्यतीत एम पी एम इमेजिंग सक्षम है कि एक पुरानी रीढ़ की हड्डी में चैंबर के आरोपण के लिए एक तकनीक 30 प्रकाशित किया। संक्षेप में, इस शल्य चिकित्सा की तैयारी कम वक्ष रीढ़ की हड्डी में laminectomy और एक चार भाग चैंबर के आरोपण के प्रदर्शन में शामिल थे। कक्ष शामिलlaminectomy के आसपास के कशेरुकाओं, और एक गिलास coverslip अनुसूचित जाति के ऊपर रखा और सिलिकॉन elastomer के साथ सुरक्षित clamped कि तीन कस्टम machined भागों स्टेनलेस स्टील। इस तकनीक को दोहराने सर्जरी के लिए आवश्यकता के बिना स्वस्थ और घायल राज्यों में postoperatively के अधिक से अधिक 5 हफ्तों के लिए बाहर दिनचर्या इमेजिंग के लिए अनुमति दी। इमेजिंग समय बिंदुओं की संख्या केवल पशु संवेदनाहारी प्रेरण बर्दाश्त कर सकते हैं, जिस पर आवृत्ति द्वारा सीमित था। इमेजिंग जीवनकाल अनुसूचित जाति की सतह पर एक घने, रेशेदार ऊतक के विकास द्वारा ही सीमित था। इसके अलावा, हम शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपण मोटर समारोह पर कोई दीर्घकालिक प्रभाव था कि सत्यापित।
हमारी प्रारंभिक प्रकाशन के बाद से, यह भी अनुसूचित जाति में लंबी अवधि के इमेजिंग सक्रिय करने के वैकल्पिक तरीकों कहीं और 31-33 में वर्णित किया गया है। इस प्रोटोकॉल हम विकसित रीढ़ की हड्डी में चैम्बर दाखिल करने के लिए हमारी प्रक्रिया को दर्शाता है।
यहाँ का प्रदर्शन तकनीक दोहराया, समय चूक के लिए अनुमति देता है, कई हफ्तों के लिए बाहर पृष्ठीय माउस अनुसूचित जाति के vivo इमेजिंग बाद सर्जिकल प्रक्रियाओं के लिए आवश्यकता के बिना ऑपरेशन के बाद। इस प्रक्रिया को दोहराएँ सर्जरी इमेजिंग अध्ययन से अधिक या सेलुलर गतिशीलता पर जानकारी खो जाती है, जहां portmortem ऊतकीय दृष्टिकोण से काफी सुधार का प्रतिनिधित्व करता है। हम पहले 30 विवो में एससीआई विकृति के अध्ययन के लिए इस तकनीक का मूल्य प्रदर्शन किया है।
इमेजिंग की अधिकतम अनुदैर्ध्य हद तक अनुसूचित जाति के पृष्ठीय सतह पर एक घने, रेशेदार ऊतक के विकास के द्वारा निर्धारित किया गया था। समय के साथ, इस वृद्धि छवि के विपरीत और संकल्प के नुकसान के परिणामस्वरूप। यह वृद्धि भी वैकल्पिक शल्य चिकित्सा की तैयारी 31 में देखा गया है। Anecdotally, हम ध्यान की सतह सील, रक्त उत्पादों को दूर करने के पृष्ठीय अनुसूचित जाति सतह धोने से इस वृद्धि को कम किया जा सकता है कि मनायाcyanoacrylate साथ कटौती की हड्डी, सिलिकॉन elastomer के साथ अच्छी तरह से चैंबर के किनारों सील, और पृष्ठीय अनुसूचित जाति और गिलास को कवर के बीच मध्य अंतरिक्ष कम से कम।
हाल ही में, एक polycarbonate कक्ष का उपयोग अपने स्वयं के लिए इसी तरह की एक और दृष्टिकोण 32 प्रदर्शित किया गया है। यह हमारे स्टेनलेस स्टील भागों के लिए ऐसा नहीं है जो एक्स-रे और ध्वनिक इमेजिंग तौर तरीकों के साथ संगत है के बाद से पॉली कार्बोनेट का उपयोग लाभदायक है। हालांकि, 3 डी प्रिंटर की अब सर्वव्यापी तकनीक के साथ, चैम्बर भागों विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुरूप सामग्री की एक विस्तृत विविधता से निर्मित किया जा सकता है। हमने हाल ही में एक स्पष्ट photopolymer में हमारे सभी भागों छपा है।
एक बंद चैंबर के एक प्रमुख नुकसान दवाओं या अनुसूचित जाति इमेजिंग 34 के लिए उपयुक्त बहिर्जात रंगों के दोहराया खुराकों प्रशासन की अक्षमता है। हालांकि, हमारे वर्तमान प्रणाली के यांत्रिक स्थिरता पर capitalizing करके, हम पहले से ही सफल करने के लिए हमारे वर्तमान कक्ष का इस्तेमाल किया हैly के भी एक बंद कक्ष प्रणाली (अप्रकाशित काम) में एक से अधिक समय बिंदुओं पर दवा वितरण के लिए अनुमति दी है जो एक subcutaneously प्रत्यारोपित इंजेक्शन बंदरगाह से जुड़ा एक intrathecal कैथेटर, लंगर। इसके अलावा, कारण ऊपर थाली की मॉड्यूलर प्रकृति के कारण, इस तैयारी के भविष्य के संस्करणों चिकित्सीय एजेंटों और फ्लोरोसेंट लेबल दोनों के दोहराया आवेदन के लिए अनुमति देने के लिए एक resealable कक्ष शामिल होंगे। यह दवा वितरण के लिए इलेक्ट्रोड, ऑप्टिकल सम्मिलित करता है, और बंदरगाहों की रिकॉर्डिंग के लिए mounts के साथ शीर्ष प्लेटों की कल्पना करना भी संभव है। इस तरह के जोड़ की संभावना Fenrich एट अल। 31 से अधिक minimalist प्रणाली का उपयोग कर लागू करने के लिए और अधिक चुनौतीपूर्ण होगा। अंत में, हमारे चैम्बर विविध प्रयोगों के आधार पर किया जा सकता है, जिस पर एक प्रवेश द्वार के मंच प्रदान करता है।
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-04 | |
forceps, scissors, scalpel, etc. | Fine Science Tools | multiple | |
retractor kit -magnetic fixator | Fine Science Tools | 18200-02 | |
retractor kit -retractor | Fine Science Tools | 18200-09 | other retractors may also be used |
retractor kit -elastomer | Fine Science Tools | 18200-07 | |
feedback controlled heating blanket | CWE Inc. | Model: TC-1000 Mouse Part No. 08-13000 | |
stereotax | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber holders | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
Cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite 495 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder) | Teets | Mfg. Part: 8101 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid) | Teets | Mfg. Part: 8501 | multiple suppliers |
Glycopyrrolate | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602) | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
Bupivacaine | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 029841 (Hospira 116301) | |
Ketoprofen | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193) | |
Dexamethasone | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032) | |
KwikSil Elastomer | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
KwikSil Mixing Tips | World Precision Inc. | KWIKMIX |