이 비디오에서는, 우리는 라이브 마우스의 등쪽 척수를 통해 만성 광학 영상 실을 주입하는 절차에 대해 설명합니다. 실, 수술, 만성 이미징 검토하고 증명한다.
Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.
그대로 생물 생체 현미경 시간 경과는 면역 조직 화학 염색과 같은 기존의 단일 시점 분석에 액세스 할 수없는 복잡한 생물학적 과정의 직접 시각화 할 수 있습니다. 구체적으로, 다중 광자 현미경 (MPM) (1)는 2,3- 최대 4 1mm 초과 촬상이 달성 된 설치류 신피질로, 조직을 산란 이미징을 허용한다. 하나의 절차 개월 주 동안 뇌에 광 액세스 할 수 있습니다 5-7있는 수술 준비와 결합하면, 이러한 현미경 접근 방식이 건강하고 병에 걸린 상태 8-11 뇌의 동적 프로세스를 연구하는 데 사용되었다. 또한, 분석 프로토콜은 행동 동안에 셀룰러 – 해상도 이미징 기능을 허용 웨이크 (즉, 비 마취) 동물에서 생체 내 이미징 제공 12,13 개발되었다. 이러한 프로토콜은 comparis 사용되어왔다신경 활성 상관 (14)의 기능은, 마취 된 동물에서 깨어 15 시그널링 성상 세포는 칼슘, 작업 별 신경 클러스터 (16)의 식별 및 신경 세포의 능력은 휘스커 자극 17에 객체 위치를 판별한다.
질병기구 (18)와 같은 급성 축삭 변성의 식별 (AAD)를 허용 마우스 척수 (SC)에인가 된 건강 및 병리 기전, 생체 내 이미징 경과 해명이 접근법의 전위를 부여. 후속 연구는 후근 신경절 (DRG) 축삭 재생 (19), 축삭 재생 (20)에 혈관의 역할, 부상 (21)에 대응 아교 화성, 실험자가 면역 뇌척수염의 T – 세포 이동 (EAE) (22), 활동에 주변 병변의 효과를 조사 amyotroph에 대한 응답으로 미세 아교 세포의 23, 24 및 성상 세포 (25)IC 측삭 경화증 (ALS), SC 손상 (SCI) 26 후 축삭 발아에서 STAT-3의 역할 및 EAE 27 축삭 손실 및 복구 메커니즘. 이러한 방법의 성공에도 불구하고, 이러한 모든 연구 시점 액세스에게의 수를 제한하는 모든 촬상 시점에서 동물의 수술 개구 반복 필요한 다른 이에 단기 역학 연구를 제한 한 촬상 세션 중 하나에 한정하거나시켰다 혼동 및 실험적 인공물의 가능성을 증가시킨다. 이러한 수술에 대한 프로토콜은 이전에 28,29 발표되었다.
최근에, 우리는 반복 수술이 필요없이 여러 주 동안 마우스 SC에서 시간 경과 MPM 이미징을 활성화 만성 척추 챔버의 주입하는 기술 (30)을 발표했다. 간단히 말해서,이 수술 준비는 낮은 흉부 척추 후궁 절제술 및 네 부분으로 된 챔버의 주입을 수행 포함되어 있습니다. 챔버 포함후궁 절제술을 둘러싼 척추 및 유리 커버 슬립 위에 배치 SC 실리콘 엘라스토머를 클램프로 고정 세 맞춤 스테인리스 가공 부품. 이 기술은 반복 수술이 필요없이 건강하고 부상당한 상태에서 수술 후 이상 오주 밖으로 루틴 이미징 허용. 촬상 시점의 개수는 동물이 마취 유도를 허용 할 수있는 주파수로 제한되었다. 이미징 수명 SC의 표면 위에 고밀도의 섬유 조직의 성장에 의해 제한되었다. 또, 외과 용 임플란트가 운동 기능에는 장기적인 효과를 가지고 있다는 것을 확인.
당초 발행 된 이후에, 또한 SC 장기 이미징을 가능 대안 적 방법은 다른 장소 31-33 설명되었다. 이 프로토콜은 우리가 개발 한 척추 실을 주입에 대한 우리의 과정을 보여줍니다.
여기에 입증 기술은 반복, 시간 경과를 허용, 몇 주에 밖으로 지느러미 마우스 SC의 생체 내 이미징은 이후 수술 절차가 필요없이 작동 가능 게시합니다. 이 절차를 반복 수술 영상 검사를 통해 또는 휴대 역학에 대한 정보가 손실 portmortem 조직 학적 접근 방법을 통해 상당한 개선을 나타냅니다. 우리는 이전에 (30)는 생체 내에서 SCI 병리학을 공부하는이 기술의 가치를 증명하고있다.
영상의 최대 길이 범위는 SC의 등 표면 위에 고밀도의 섬유 조직의 성장에 의해 결정 하였다. 시간이 지남에 따라,이 성장은 이미지 콘트라스트와 해상도의 손실의 결과. 이러한 성장은 다른 수술 준비 (31)에서 볼 수있다. 일화, 우리는주의 깊게의 표면을 밀봉, 혈액 제품을 제거하기 위해 지느러미 SC 표면을 세척하여 이러한 성장이 최소화 될 수 있음을 발견했다시아 노 아크릴 레이트와 잘라 뼈, 실리콘 엘라스토머와 잘 챔버의 가장자리를 밀봉하고, 등쪽 SC과 커버 유리 사이의 격자 공간을 최소화한다.
최근 폴리 카르 보 네이트를 사용하여 챔버 자체와 유사한 또 다른 방법 (32)을 보여왔다. 우리의 스테인레스 스틸 부품의 경우가 X 선 및 음향 영상 방식과 호환 때문에 폴리 카보네이트의 사용은 유리하다. 그러나, 3 차원 프린터의 현재 유비쿼터스, 챔버 부품은 필요에 맞는 다양한 재료로부터 제조 될 수있다. 우리는 최근에 명확한 포토 폴리머 우리의 모든 부분을 인쇄했습니다.
밀폐 된 챔버의 한 가지 중요한 단점은 약물이나 SC 영상 (34)에 적합한 외생 염료의 반복 투여 량을 관리 할 수 없다는 것입니다. 그러나, 우리의 현재 시스템의 기계적 안정성을 활용하여, 우리는 이미 성공에 우리의 현재 챔버를 사용했다LY 심지어 밀폐 챔버 방식 (출판 서적)에서 여러 시점에서 약물 전달을 허용 피하 주입 주입구에 접속 막내 카테터를, 앵커. 또한, 인해 상판의 모듈 형 특성으로 이러한 준비의 미래 버전 치료제 및 형광 라벨 모두의 반복 응용 프로그램 수 있도록 다시 봉합 할 수있는 챔버를 포함 할 것이다. 이는 약물 전달 용 전극, 광학 삽입하고, 포트를 기록하기위한 설치대 가기 판을 구상 할 수있다. 이러한 추가 가능성 Fenrich 등. (31)의 더 멀 시스템을 사용하여 구현하기가 더 어려울 수있다. 결론적으로, 우리의 챔버는 다양한 실험의 기반이 될 수있는 게이트웨이 플랫폼을 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-04 | |
forceps, scissors, scalpel, etc. | Fine Science Tools | multiple | |
retractor kit -magnetic fixator | Fine Science Tools | 18200-02 | |
retractor kit -retractor | Fine Science Tools | 18200-09 | other retractors may also be used |
retractor kit -elastomer | Fine Science Tools | 18200-07 | |
feedback controlled heating blanket | CWE Inc. | Model: TC-1000 Mouse Part No. 08-13000 | |
stereotax | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber holders | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
Cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite 495 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder) | Teets | Mfg. Part: 8101 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid) | Teets | Mfg. Part: 8501 | multiple suppliers |
Glycopyrrolate | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602) | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
Bupivacaine | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 029841 (Hospira 116301) | |
Ketoprofen | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193) | |
Dexamethasone | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032) | |
KwikSil Elastomer | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
KwikSil Mixing Tips | World Precision Inc. | KWIKMIX |