Neste vídeo, descrevemos um procedimento para a implantação de uma câmara de imagem óptica crônica sobre a medula espinhal dorsal de um rato vivo. A câmara, procedimento cirúrgico, e imagiologia crônica são revisados e demonstrada.
Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.
Time-lapse em microscopia vivo em organismos intactos permite a visualização direta dos processos biológicos complexos que são inacessíveis para análise de ponto-time única tradicional, tais como imuno-histoquímica. Especificamente, a microscopia multi-fotão (MPM) 1 permite a formação de imagens de tecido de espalhamento, tais como o neocórtex roedor, quando tiver sido alcançado imagiologia até 2,3 e em excesso de 4 de 1 mm. Quando combinado com os preparativos cirúrgicos 5-7 em que um único procedimento permite acesso óptico para o cérebro por semanas a meses, estas abordagens de microscopia foram usados para estudar os processos dinâmicos do cérebro em estados saudáveis e doentes 11/08. Além disso, os protocolos foram desenvolvidos 12,13 que prevêem a imagem in vivo em vigília (ou seja, não anestesiados) animais, permitindo a imagem funcional celular resolução durante ensaios comportamentais. Estes protocolos foram utilizados para comparisons de atividade neuronal correlacionada 14, astrócitos sinalização 15 em animais anestesiados e vigília de cálcio, a identificação de aglomerados neuronais específicos de tarefas 16, bem como a capacidade dos neurônios de discriminar localização objeto sobre suiça de estimulação 17.
Dado o potencial desta abordagem para elucidar os mecanismos saudáveis e patológicas, lapso de tempo de imagem in vivo foi aplicado para a medula espinal de rato (SC), permitindo a identificação de degeneração axonal aguda (DAA), um mecanismo 18 de doença. Estudos subsequentes investigados os efeitos de lesões periféricas em gânglios da raiz dorsal (DRG) de regeneração axonal 19, a função dos vasos sanguíneos na regeneração axonal 20, a quimiotaxia de células gliais em resposta ao ferimento 21, a migração de células T em encefalomielite auto-imune experimental (EAE) de 22, a actividade de 23,24 a microglia e astrócitos 25 em resposta a amyotrophesclerose ica lateral (ALS), o papel de STAT-3 em brotamento axonal após a lesão SC (SCI) 26, e um mecanismo de perda axonal e recuperação 27 na EAE. Apesar do sucesso destas abordagens, todos estes estudos foram limitados a qualquer uma sessão de imagem única, limitando assim os estudos de dinâmica de curto prazo, ou então necessário repetir aberturas cirúrgicas do animal em cada ponto de tempo de imagem, o que limita o número de pontos no tempo acessíveis e aumentando a probabilidade de artefatos experimentais de confusão. Protocolos para estas cirurgias foram previamente publicados 28,29.
Recentemente, publicamos uma técnica de 30 para a implantação de uma câmara espinhal crônica que permitiu time-lapse imaging MPM no rato SC ao longo de várias semanas sem a necessidade de cirurgias repetidas. Resumidamente, esta preparação cirúrgica incluiu a realização laminectomia na coluna vertebral torácica inferior e a implantação de uma câmara de quatro partes. A câmara incluídatrês peças de aço inoxidável custom-usinadas que apertadas as vértebras em torno do laminectomy, e uma lamela de vidro colocado sobre o SC e presa com elastômero de silicone. Esta técnica permitiu para a imagem latente de rotina a mais de cinco semanas de pós-operatório em estados saudáveis e feridos, sem a necessidade de cirurgias repetidas. O número de pontos de tempo de imagem foi limitada apenas pela frequência a que o animal pode tolerar a indução da anestesia. A visualização foi vida limitado pelo crescimento de um denso tecido fibroso sobre a superfície da SC. Além disso, verificou-se que o implante cirúrgico não teve efeito a longo prazo sobre a função motora.
Desde a nossa primeira publicação, abordagens alternativas que permitam também de imagem a longo prazo na SC foram descritos em outro 31-33. Este protocolo demonstra o nosso procedimento para a implantação da câmara de medula desenvolvemos.
A técnica demonstrada aqui permite repetida, time-lapse, in vivo de imagens do mouse dorsal SC para muitas semanas pós operatório sem a necessidade de procedimentos cirúrgicos subsequentes. Este procedimento representa uma melhoria substancial sobre estudos de imagem repita-cirurgia ou sobre abordagens histológicas portmortem, cuja informação sobre a dinâmica celular é perdido. Temos anteriormente 30 demonstraram o valor desta técnica para estudar SCI patologia in vivo.
A extensão longitudinal máxima de imagens foi determinada pelo crescimento de um denso tecido fibroso sobre a superfície dorsal do SC. Ao longo do tempo, este crescimento resultou na perda de contraste de imagem e resolução. Este crescimento também tem sido visto em preparações cirúrgicas alternativas 31. Curiosamente, observou-se que este crescimento podem ser minimizados lavando cuidadosamente superfície dorsal SC para remover produtos derivados do sangue, a superfície de vedação deo osso corte com cianoacrilato, bordas da câmara de vedação bem com elastômero de silicone, e minimizando o espaço intersticial entre o SC dorsal e a tampa de vidro.
Recentemente, outra abordagem semelhante à nossa própria utilizando uma câmara de policarbonato tem sido demonstrada 32. A utilização de policarbonato é vantajosa uma vez que é compatível com raios-X e modalidades de imagem acústica, que não é o caso para as peças em aço inoxidável. No entanto, com a tecnologia agora ubíqua de impressoras 3D, partes da câmara pode ser fabricada a partir de uma ampla variedade de materiais para atender necessidades específicas. Nós imprimimos recentemente todas as nossas peças em um fotopolímero clara.
Uma desvantagem principal de uma câmara fechada, é a incapacidade de administrar dosagens repetidas de drogas exógenas ou corantes adequados para imagiologia de 34 SC. No entanto, por capitalizando sobre a estabilidade mecânica do nosso sistema atual, nós já usou nossa câmara de presente para o sucessoly ancorar um cateter intratecal ligado a uma porta implantada subcutaneamente por injecção, o que permitiu a administração de fármaco em vários pontos de tempo, mesmo num sistema de câmara fechada (trabalho não publicado). Além disso, devido à natureza modular da placa de topo, as futuras versões desta preparação incluirá uma câmara possa ser fechada novamente para permitir a aplicação repetida de ambos os agentes terapêuticos e marcadores fluorescentes. É também possível prever placas de topo é montado com os eléctrodos para a gravação de inserções, ópticos, e as portas para a entrega de drogas. Essas adições provavelmente seria mais difícil aplicar a usar o sistema mais minimalista de Fenrich et al. 31. Em conclusão, a nossa câmara fornece uma plataforma de gateway em que diversos experimentos podem ser baseadas.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-04 | |
forceps, scissors, scalpel, etc. | Fine Science Tools | multiple | |
retractor kit -magnetic fixator | Fine Science Tools | 18200-02 | |
retractor kit -retractor | Fine Science Tools | 18200-09 | other retractors may also be used |
retractor kit -elastomer | Fine Science Tools | 18200-07 | |
feedback controlled heating blanket | CWE Inc. | Model: TC-1000 Mouse Part No. 08-13000 | |
stereotax | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber holders | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
Cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite 495 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder) | Teets | Mfg. Part: 8101 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid) | Teets | Mfg. Part: 8501 | multiple suppliers |
Glycopyrrolate | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602) | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
Bupivacaine | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 029841 (Hospira 116301) | |
Ketoprofen | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193) | |
Dexamethasone | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032) | |
KwikSil Elastomer | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
KwikSil Mixing Tips | World Precision Inc. | KWIKMIX |