This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.
Granulocytes play a key role in the body’s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).
Granulocytter representerer en del av kroppens medfødte immunsystem, som gir den første forsvarslinje mot invaderende antigener. Tidligere metoder for å vurdere granulocytt funksjon fokusert på fagocytose kapasitet eller oksidativ burst bruke separate metoder, noe som gjør det vanskelig å fastslå kollektivt hvordan granulocytter har endret 1-4. Fremskritt innen flowcytometri har resultert i produksjon av stasjonære instrumenter i stand til høy oppløsning, multi-farge avbildning av celler i en høy gjennomstrømning måte 5. Evnen til å kombinere bildebehandling med tradisjonelle flowcytometri representerer en fremgang som gir den teknologiske plattformen som trengs for å skape noe nytt innenfor eksisterende flowcytometri metoder og trekke ut ny informasjon om immunsystemet.
I løpet av de siste ti årene, har vårt laboratorium, blant andre, er intenst fokusert på effekten av ulike ernæringsmessige og mosjon behandlinger patteRNS om medfødte immunforsvar 6-9. Metoden demonstrert i dette manuskriptet har praktiske konsekvenser innenfor feltet klinisk immunologi. Den nåværende metoden utnytter kraften i bildebasert flowcytometri å samtidig måle fagocytose av bakteriepartikler og oksidativ burst. Ved hjelp av denne fremgangsmåten, er man i stand til å separere aktivert granulocytter ved hjelp av variabler som leveres av bildebasert del av analysen. Disse undergrupper var bare identifiserbare etter vurdering av de cellulære bilder på de enkelte granulocytter. Ytterligere analyse inkubasjonstid påvirket overgangen mellom de tre undergrupper aktiverings 10. Således er det sannsynlig at anvendelse av flere inkubasjonstider kan tillate en fremgangsmåte for å teste endringen i granulocytt funksjon når en bestemt eksperimentell behandling. Hensikten med dette manuskriptet var å demonstrere en metode for å vurdere granulocytt-funksjon ved hjelp av bildebasert strømningscytometri for samtidig å måle fagocytose med oxidative sprekke.
Den nåværende metoden representerer en videreutvikling av eksisterende metoder for vurdering av granulocytt funksjon ved hjelp av flowcytometri 1,3,4,12-14. De kritiske trinn av denne analysen har en tendens til å være relatert til riktig blanding av blodprøven med bioparticles og DHE. Ufullstendig blanding vil føre til unøyaktige resultater. Mens fullstendig blanding er kritisk, bør blandingsmetoden være forsiktig i naturen. Det er foreslått at blandingen utføres ved hjelp av en elektronisk pipette med en blandefunksjon i stedet for en vortex-blander. En annen kritisk trinn i analysen er alltid å sikre at det ikke er blod forurenser den øvre halvdel av prøverør. Denne blodrester kan fjernes med en steril bomull-tipped applikator. Fullstendig fjerning er viktig fordi unnlatelse av å gjøre dette kan forurense den endelige analysen forberedelse med un-lysert røde blodceller.
Før du bruker denne metoden passende kompensasjon kontroller bør legges til kontrollere for spectral overlapping blant reagenser som brukes for å identifisere de ulike aspekter av granulocytt funksjon. For denne fremgangsmåten, kompensasjons kontroller innebære samle blodprøver som har blitt foreslått i 40 min assay inkubasjon og deretter merking med en enkel markør (det vil si E. coli, DHE, etc.). Etter merking, er enkle positive hendelser innsamlet og en kompensasjon matrise er generert ved hjelp av en automatisert veiviser i IDEER analyseprogramvare. Det er viktig at hvis denne analysen blir brukt, blir passende kompensasjon kontroller gjennomført for å sikre riktig analyse ytelse.
Analysen er utført ved hjelp av funksjonen finder og samlokalisering veivisere for å identifisere at lyse detalj intensitet er den beste variabel for å skille populasjoner og også identifisere hvor mye overlapping mellom oksidativt burst og fagocytose signaler. Nærmere bestemt, ved bruk av bildebasert cytometri gitt evnen til å segregere aktiverte granulocytter i tre undergrupper. Thans undergruppe sammenbrudd ble bestemt ved hjelp av lys detalj intensiteten av fagocytose vs. oksidativ burst. I tillegg til å undersøke disse enkeltcellefunksjoner, ble cellene som viste begge hendelser på samme tid i samme anatomiske plassering (samlokalisering) identifisert. Granulocytter som falt inn i "high-aktiv" undergruppe var den eneste fenotype som demonstrerte konsistent samlokalisering mellom fagocytose og oksidativ burst. Denne identifikasjonen av aktiverte granulocytter undergrupper er det største området der er nødvendig med feilsøking. Det er svært viktig for en ny bruker å ta tid å forstå prøven prosessen arbeidsflyt i IDEER og å forstå mekanikken i gating cellepopulasjoner med bildebehandling komponent. Andre modifikasjoner at en bruker kan søke å gjøre omfatte valg av alternative eller supplerende analyse inkubasjonstidene. Den nåværende metode foreslår anvendelse av varigheten av 10 til 40 min; men avhengig av den eksperimentelle modell hvor denne metoden ersom skal brukes, kan det være nødvendig å velge lenger analysevarigheter. En slik endring ville trenge å bli vurdert på individuelt grunnlag.
Videre ble det fastslått at varigheten av analysen inkubasjon har en betydelig effekt på utseendet av de tre aktiverte undergrupper. Tilnærmingen er beskrevet i denne rapporten representerer en utvidelse av hvilke opplysninger som kan være tidligere opparbeidet av granulocytt funksjon 3,4,13,15. Andre laboratorier har vist betydningen av å vurdere endringer i granulocytt funksjon som en del av en helhetlig vurdering av immunitet og sykdom 15-17. Til tross for potensialet av denne analysen er det ikke uten begrensninger. En av de store begrensningene er kostnads- og tids etterspørsel forbundet med høyt prøvegjennomløp behandling. Ved en studie utforming krever et stort antall prøver i en gitt dag, disse kan være vanskelig å behandle. Processing er strømlinjeformet ved bruk av elektroniske pipetter og dispensere,men disse har en tendens til å være dyrt og er ikke nødvendigvis tilgjengelig i alle laboratorier.
Vårt område av forskning fokuserer på en studie av hvordan trening og kostvaner påvirker immunsystemet helse og fungere 6,8-10,18-20. Slike mål har betydelige praktiske konsekvenser for en rekke områder av menneskers helse. Utover studiet av trening og ernæringsmessige effekter fagocytose metoden demonstrert i dette manuskriptet kan være nyttig i andre områder av klinisk immunologi hvor overvåkningen av fagocytose funksjon er avgjørende for behandlingsresultatene. Den foreliggende assay er den første av mange som immunologiske analyser med mulighet for å bli re-oppfunnet ved å ta fordel av de unike bildeinformasjon som kan være mulig fra en bildebasert strømningscytometer.
The authors have nothing to disclose.
The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Vacutainers | BD Life Sciences | used for blood collection | |
WBC Fixative / RBC Lysis solution | eBioscience | 00-5333-57 | |
CD66b-APC | eBioscience | clone G10F5 | |
CD45-APCeFluor780 | eBioscience | clone 2D1 | |
s.aureus bioparticles | Life Technologies | A10010 | |
dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008 | |
N-ethylmalemide | Sigma-Aldrich | 4259 | |
7AAD | EMD Millipore | ||
Hematology Analyzer | Mindray | BC-3200 | |
96-channel pipet | Integra Biosciences | ViaFlo | |
Bead Bath Incubator | LabArmour | BeadBath | |
Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | Amnis FlowSight | |
INSPIRE Software | EMD Millipore | Amnis INSPIRE | |
IDEAS Software | EMD Millipore | Amnis IDEAS | |
X-Pierce Piercable Plate Sealer | Excel Scientific, Inc. | X-Pierce | |
Dell Precision Workstation | Dell Computers | Various | Used for IDEAS analysis |