This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.
Granulocytes play a key role in the body’s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).
تمثل المحببة عنصر واحد من نظام المناعة الفطري في الجسم، والذي يوفر خط الدفاع الأول ضد المستضدات الغازية. ركزت الطرق السابقة لتقييم وظيفة محببة على قدرة البلعمة أو الأكسدة انفجار باستخدام طرق منفصلة، مما يجعل من الصعب التأكد بشكل جماعي كيف تغيرت المحببة 1-4. الخلوي وقد أدت التطورات في مجال التدفق في إنتاج الأدوات الفوق قادرة على عالية الدقة، والتصوير متعدد الألوان الخلايا بطريقة إنتاجية عالية 5. القدرة على الجمع بين التصوير مع التدفق التقليدي يمثل الخلوي والتقدم الذي يوفر منصة التكنولوجية اللازمة للابتكار في التدفق الخلوي الحاليين الأساليب واستخراج معلومات جديدة عن جهاز المناعة.
على مدى السنوات العشر الماضية، مختبرنا، من بين أمور أخرى، وقد تركز تماما على تأثير مختلف patte الغذائية والعلاجات ممارسةRNS على وظيفة المناعة الفطرية 6-9. الأسلوب هو موضح في هذه المخطوطة له آثار عملية في مجال علم المناعة السريرية. الطريقة الحالية تعزز من قوة الصورة القائمة على التدفق الخلوي لقياس في وقت واحد من جسيمات البلعمة البكتيرية والأكسدة انفجار. باستخدام هذا النهج، واحد قادر على فصل المحببة تفعيلها باستخدام المتغيرات التي تقدمها الجزء القائم على صورة التحليل. وكانت هذه المجموعات الفرعية يمكن تحديدها إلا بعد تقييم الصور الخلوية على المحببة الفردية. المزيد من الوقت فحص حضانة أثرت على الانتقال بين مجموعات فرعية تفعيل ثلاثة 10. وبالتالي، فمن المعقول أن استخدام مرات حضانة متعددة قد تسمح طريقة لاختبار تغيير في وظيفة محببة بعد العلاج التجريبي محددة. وكان الغرض من هذه المخطوطة لإثبات وسيلة لتقييم وظيفة محببة باستخدام الصورة القائمة على التدفق الخلوي لقياس البلعمة في وقت واحد مع oxidatانفجار إيف.
يمثل هذا الأسلوب صقل الأساليب القائمة لتقييم وظيفة محببة باستخدام التدفق الخلوي 1،3،4،12-14. الخطوات الحاسمة من هذا الاختبار تميل إلى أن تكون ذات صلة الخلط السليم للعينة الدم مع bioparticles وDHE. سوف خلط ناقصة تؤدي إلى نتائج غير دقيقة. في حين خلط كامل أمر بالغ الأهمية، يجب أن تكون طريقة خلط لطيف في الطبيعة. ويقترح أن الاختلاط تحقيقه باستخدام الماصة الإلكترونية مع وظيفة خلط بدلا من خلاط دوامة. آخر خطوة حاسمة في مقايسة هي ضمان دائما عدم وجود الدم الملوثة في النصف العلوي من أنبوب الاختبار. ويمكن إزالة هذا الدم المتبقي باستخدام القطن ذات الرؤوس المعقم قضيب. إزالة كاملة مهمة لأن عدم القيام بذلك قد تلوث إعداد مقايسة نهائي مع خلايا الدم الحمراء هي lysed الامم المتحدة.
قبل استخدام هذا الأسلوب ضوابط التعويض المناسبة ينبغي أن يضاف للسيطرة على سالتداخل ectral بين الكواشف المستخدمة للتعرف على جوانب مختلفة من وظيفة محببة. لهذا الأسلوب، وتشمل الضوابط تعويض جمع عينات الدم التي تم اقترحت 40 دقيقة فحص الحضانة ومن ثم وضع العلامات مع علامة واحدة (أي كولاي، DHE، وما إلى ذلك). بعد وضع العلامات، ويتم جمع الأحداث الإيجابية واحدة ويتم إنشاء مصفوفة التعويض باستخدام المعالج الآلي في برامج التحليل IDEAS. ومن الأهمية بمكان أن إذا تم استخدام هذا الاختبار، يتم الانتهاء من ضوابط التعويض المناسبة لضمان الأداء السليم الفحص.
ويتم إنجاز التحليل باستخدام ميزة مكتشف وشارك في توطين المعالجات لتحديد أن كثافة التفاصيل مشرق هو أفضل المتغير للفصل بين السكان، وكذلك تحديد كيفية وجود الكثير من التداخل بين انفجار الأكسدة وإشارات البلعمة. على وجه التحديد، شريطة استخدام الخلوي الصورة القائمة على القدرة على فصل المحببة إلى ثلاث مجموعات فرعية تفعيلها. تيتم تحديد له فرعية انهيار باستخدام كثافة التفاصيل مشرق البلعمة مقابل الأكسدة انفجار. بالإضافة إلى دراسة هذه الوظائف خلية واحدة، وقد تم تحديد الخلايا التي عرضت كلا الحدثين في نفس الوقت في نفس الموقع التشريحي (شارك في التعريب). كانت المحببة التي سقطت في فرعية "عالية النشطة" النمط الظاهري الوحيد الذي أثبت بما يتفق شارك في التعريب بين البلعمة والأكسدة انفجار. هذا تحديد مجموعات فرعية محببة تفعيلها هي أكبر منطقة التي تحتاج إلى استكشاف الأخطاء وإصلاحها. من المهم جدا للمستخدم جديد إلى يستغرق وقتا طويلا لفهم إجراءات العمل عينة في الأفكار وفهم آليات النابضة السكان الخلية باستخدام عنصر التصوير. وتشمل التعديلات الأخرى التي يمكن للمستخدم أن تسعى لجعل اختيار الأوقات فحص حضانة بديلة أو إضافية. وتشير الطريقة الحالية استخدام فترات من 10-40 دقيقة. ومع ذلك، اعتمادا على النموذج التجريبي حيث هذه الطريقةلاستخدامها، قد يكون من الضروري لتحديد فترات أطول الفحص. بحاجة الى مثل هذا التعديل ليتم تقييمها على أساس فردي.
وعلاوة على ذلك تقرر أن مدة الحضانة فحص له تأثير كبير على ظهور مجموعات فرعية ثلاثة تفعيلها. النهج المبينة في هذا التقرير يمثل امتدادا لما هي المعلومات التي يمكن الحصول عليها في وقت سابق بشأن محببة وظيفة 3،4،13،15. وقد أثبتت مختبرات أخرى على أهمية تقييم التغيرات في وظيفة محببة كجزء من تقييم شامل للمناعة والامراض 15-17. وعلى الرغم من إمكانات هذا الاختبار ليس من دون قيود. واحدة من القيود الرئيسية من حيث التكلفة والوقت الطلب المرتبطة عينة عالية التجهيز الإنتاجية. عندما يتطلب تصميم الدراسة على عدد كبير من العينات في يوم معين، يمكن أن تكون هذه من الصعب معالجة. هو تبسيط معالجة عن طريق استخدام pipets الإلكترونية وموزعات،ولكن هذه تميل إلى أن تكون مكلفة وليست بالضرورة متوفرة في كل مختبر.
لدينا مجال البحث تركز على دراسة كيفية ممارسة الرياضة والعادات الغذائية تؤثر على الصحة الجهاز المناعي وظيفة 6،8-10،18-20. هذه الأهداف لها آثار عملية هامة لمجموعة متنوعة من مجالات صحة الإنسان. ما وراء دراسة ممارسة الرياضة والتغذية آثار طريقة البلعمة أظهر في هذه المخطوطة يمكن أن تكون مفيدة في مناطق أخرى من المناعة السريرية حيث رصد وظيفة البلعمة أمر بالغ الأهمية لنتائج العلاج. الفحص الحالي هو الأول من كثيرين أن المقايسات المناعية مع القدرة على إعادة اختراع من خلال استغلال المعلومات التصوير الفريدة التي يمكن أن تكون وسعها من تدفق القائم على صورة عداد الكريات.
The authors have nothing to disclose.
The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Vacutainers | BD Life Sciences | used for blood collection | |
WBC Fixative / RBC Lysis solution | eBioscience | 00-5333-57 | |
CD66b-APC | eBioscience | clone G10F5 | |
CD45-APCeFluor780 | eBioscience | clone 2D1 | |
s.aureus bioparticles | Life Technologies | A10010 | |
dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008 | |
N-ethylmalemide | Sigma-Aldrich | 4259 | |
7AAD | EMD Millipore | ||
Hematology Analyzer | Mindray | BC-3200 | |
96-channel pipet | Integra Biosciences | ViaFlo | |
Bead Bath Incubator | LabArmour | BeadBath | |
Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | Amnis FlowSight | |
INSPIRE Software | EMD Millipore | Amnis INSPIRE | |
IDEAS Software | EMD Millipore | Amnis IDEAS | |
X-Pierce Piercable Plate Sealer | Excel Scientific, Inc. | X-Pierce | |
Dell Precision Workstation | Dell Computers | Various | Used for IDEAS analysis |