Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Internalisering og Observasjon av Fluorescent biomolekyler i levende mikroorganismer via Electroporation

Published: February 8, 2015 doi: 10.3791/52208
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Clarendon Laboratory, Department of Physics, University of Oxford, 2Wellcome Trust Sanger Institute, Genome Center

Introduction

De fleste studier fluorescens i levende celler er avhengig av proteinfusjoner med fluorescerende proteiner (FPS), slik som en GFP. Disse fluorescerende merkene lar studier av kopinummer, diffusjon mønster eller lokalisering av proteiner involvert i prosessene som genekspresjon eller membrantransport 2-7. FPS tilbyr høy merking spesifisitet, enkel implementering, og er tilgjengelig i en stor beholdning av varianter med ulike photophysical og kjemiske egenskaper en. Men organiske fluoroforene forbli den førsteklasses valg for in vitro eksperimenter på grunn av deres større fotostabilitet (opptil 100 ganger mer stabil enn FPS) 8,9, liten størrelse (opp til 100 ganger mindre volum enn FPS) og enkel intra merking (i hovedsak ved bruk av cysteinrester). Alle disse faktorene er spesielt viktig for single-molekyl fluorescens og FRET studerer 10.

Flere internalisering metoder Combining fordelene ved økologisk merking og in vivo deteksjon har blitt innført i løpet av det siste tiåret; Men slike fremgangsmåter enten anvende relativt store polypeptider koder (f.eks TMP, halogen, eller 20 kDa SNAP tags) 11-14, krever bruk av unaturlige aminosyrer 15 eller er begrenset til store enkeltmembran eukaryote celler (f.eks. , skrape lasting, sprøyte lasting, mikroinjeksjon) 16-19.

Denne protokollen beskriver en roman, enkel og høy gjennomstrømming intern metode som par fordelene ved økologisk fluoroforene med in vivo observasjon. For å utvikle denne teknikk, har vi tilpasset electroporation prosedyre som vanligvis anvendes for å transformere celler med plasmid-DNA 20,21 for å laste mikroorganismer, slik som E. coli eller S. cerevisiae med økologisk merkede biomolekyler. Protokollen består av fire enkle trinn: inkubasjon av celler med merkede biomolekyler,elektroporering, celle utvinning, og celle vasking for å fjerne ikke-internalisert biomolekyler. Her presenterer vi denne elektroporering protokollen, samt celle bildebehandling og dataanalyse prosesser for å studere cellebasert og single-molekyl fluorescens og gnage signaler.

Elektroporering er avhengig avfyre ​​et høyspent elektrisk felt over en lav ionestyrke cellesuspensjonen for å danne forbigående membranporene gjennom hvilke biomolekyler kan skrive-celler (figur 1) 20,21. Akkurat som med transformasjon av bakterier eller gjær med plasmid-DNA, celler har til å bli fremstilt før elektroporering for å sikre deres electrocompetency. Denne prosedyren, som består av flere vasketrinn med vann, øker membranens permeabilitet og senker ionestyrken av cellen løsning for å unngå lysbuedannelse i electroporation kyvette. I denne protokollen, kan cellene fremstilles som beskrevet nedenfor (Se PROTOKOLL: 1.1) eller kjøpt fra kommersiell leverandørs.

Figur 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av internalise protokollen Fra venstre til høyre:. Legge noen mikroliter av merket biomolekyler til aliquot av elektrokompetente celler (dobbelt-merkede DNA-fragmenter og bakterier i dette eksempel); inkuber 1 til 10 minutter på is og overføre til en pre-kjølt elektroporering cuvette; electroporate og deretter legge 0,5-1 ml rik medium til cellene umiddelbart etter; Inkuber ved 37 ° C (eller den temperatur som kreves av organismen, f.eks, 29 ° C for gjær) for å la cellene komme; utføre fem vasketrinn for å fjerne overflødig ikke-internalis merket molekyler; resuspender endelige pellet i 100-200 mL PBS buffer og pipette 10 pl på en agarose pad; dekke puten med en renset dekkglass og bilde på en fluorescens mikroskop (i bredt felt modus eller HILO modus).

(figur 1). Overskuddet av ikke-merkede internalisert biomolekyler blir først fjernet ved vasking i en buffer inneholdende en forholdsvis høy konsentrasjon av salt og et vaskemiddel (Se protokoll: 3,3). Tilstedeværelsen av salt forstyrrer uspesifikke elektrostatiske interaksjoner dannet av ikke-internalis merket biomolekyler som ellers kan feste på den ytre membran. Tilsvarende nærvær av vaskemiddel i vaskebuffer forstyrrer ikke-spesifikke hydrofobe interaksjoner.

Mens DNA intern er grei (figur 2), forholdsregler må tas når internalisert merkede proteiner ved hjelp elektroporering. For det første kan det hende at lager prøve av organisk merket protein fortsatt inneholde en liten prosentandel av fritt farvestoff. Gratis fargestoffer er mye mindre enn proteiner og kan derfor bli internalisert fortrinnsvis. For å sikre at de aller fleste av de observerte internalisert fluorescerende molekyler som svarer til proteinet av interesse, bør den innledende protein prøven inneholde mindre enn ~ 2% fri fargestoff (figur 5) 22. Overskuddet av ikke-internalisert merkede proteiner kan også holde seg til den ytre cellemembran etter elektroporering; Dette fenomenet er protein-spesifikke og må kontrolleres for hvert nytt protein. Vi foreslår flere alternativer som gjør at fjerning av ikke-internalisert proteiner fra det belastede celleprøve (Se PROTOKOLL: 3.3.3).

Til slutt blir cellene resuspendert i et lite volum av fosfatbuffer og pipettert på en agarose puten, slik at deres avbildning på et fluorescensmikroskop. Immobilisering på agarose pads er en simple og effektiv måte for å avbilde celler på et dekkglass uten å skade deres integritet. Puten bør inneholde en lav-fluorescens kulturmedium.

Celle bildebehandling kan utføres enten i widefield, total intern refleksjon fluorescens (TIRF) eller ved hjelp av HILO (Highly Skrå og Laminert Optisk Sheet) mikroskopi. I HILO konfigurasjon, penetrerer laserstrålen dypere inn i prøven enn i TIRF, men ikke lyser hele prøven som for Widefield, slik at en høyere signal-til-støy-forholdet 23. Avhengig av lasereffekten og tidsoppløsning som brukes, kan internalisert biomolekyler telles (ved hjelp av trinnvis-fotobleking analyse, figur 3), lokalisert eller sporet 24-28. Internalisering av dobbelt merket med et konstrukter FRET par av fluoroforer tillater kvantifisering av FRET både enkelt-celle eller enkelt-molekyl nivåer (figur 6).

Forskjellige parametere kan varieresavhengig av den ønskede effekt, og det biologiske system studeres. For det første kan mengden av internalisert materiale per celle bli innstilt ved å endre konsentrasjonen av merket biomolekyler tilsatt til cellene før elektroporering (figur 2). Elektroporering feltstyrke vil også påvirke begge laste effektivitet og cellenes levedyktighet; som forventet, mens laste effektiviteten øker med økende feltstyrke, levedyktigheten av elektroporerte celler avtar (figur 4A). Begge parametere kan kvantifiseres ved å måle prosentandelen av lastet og delende celler etter elektroporering. Dette levedyktighet analysen kombinert med fluorescens bildebehandling bekrefter også observasjon av internalisert biomolekyler i levende celler og tillate kontinuerlig observasjon over flere generasjoner (Figur 4B).

Oppsummert gir dette protokollen internalisering av fluoresceinmerket DNA og protein molekyler innE. coli eller S. cerevisiae 26. Individuelle molekyler merket med organiske fluoroforene kan spores med høy tid og rom oppløsning for tidsskalaer en størrelsesorden lenger enn FPS. Endelig, denne fremgangsmåten er kompatibel med Widefield, TIRF og konfokal deteksjon, samt pulsede eksitasjon ordninger, slik som ALEX (alternerende laser magnetisering 28,29).

Protocol

1. Cell forberedelse

  1. Utarbeidelse av lab-laget elektrokompetente bakterier
    1. Forberede en 5-10 ml natten forkulturen fra en enkelt koloni av E. coli-stamme av interesse for en lav-fluorescens medium som M9 eller EZ Rich Definert Medium.
    2. I morgen, vaksinere en ny 400 ml kultur med overnatter forkulturen slik at OD 600 nm starter på 0,02. Legg til 400 ml lav-fluorescens mellom 2,5 ml 1 M MgSO4 og 2,5 ml 1 M MgCI2.
    3. Vokse ved 37 ° C og 250 opm inntil OD-600 nm når 0,4 til 0,6.
    4. Stanse veksten ved avkjøling av kulturen i et is-vannbad i 10 til 15 min.
      Merk: Fra nå gjennomføre alle trinn ved 4 ° C (på is).
    5. Sentrifugere kulturen 15 min ved 1000 x g. Kast supernatanten og cellepelleten suspenderes i 250 ml kjølt og sterilt destillert H 2 O.
    6. Gjenta sentrifugering og resuspensjon trinn twice, redusere volumet av vann til 100 ml og deretter 50 ml.
    7. Sentrifugere kulturen 10 min ved 1000 x g. Kast supernatanten og cellepelleten suspenderes i 25 ml kjølt og sterilt destillert H 2 O + 10% glycerol.
    8. Gjenta sentrifugering og resuspensjon trinn tre ganger, redusere volumet av 10% glycerol-løsning til 10 ml, 5 ml, og til slutt til 500 ul.
    9. Delmengde cellene i porsjoner av 20 mL hver, flash-fryse i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C.
  2. Kommersielle elektrokompetente bakterieceller
    1. Fortynne en kommersiell celle porsjon 1: 1 med sterilt kjølt destillert vann. Gjør 20 ul porsjoner og oppbevar ved -80 ° C.
  3. Forbereder elektrokompetente gjær
    Merk: elektrokompetente S. cerevisiae-celler blir fremstilt før hvert eksperiment elektroporering og kan ikke bli lagret ved -80 ° C som for E. coli.
    1. For å starte, vaksinere 50 ml YPD-medium med en enkelt koloni av den ønskede stamme av interesse.
    2. Inkuber ved 30 ° C og 250 opm inntil OD-600 nm når 0,6 til 0,8.
    3. Sentrifuger cellene ved 1000 xg i 5 min ved 4 ° C.
    4. Resuspender pelleten i 25 ml kjølt og sterilt destillert H 2 O.
    5. Gjenta vasketrinn nytt oppslemme to ganger i 25 ml vann og på nytt oppslemme to ganger i 2 ml av en avkjølt oppløsning av sorbitol i 1 M.
    6. Resuspender cellene i 250 pl av 1 M sorbitol og dele cellene i 50 pl aliquoter.

2. Agarose pad forberedelse

  1. Å fjerne bakgrunns fluorescerende partikler, brenne en dekk i en ovn ved 500 ° C i 1 time. "Ren brent" dekkglass kan lagres i uker ved romtemperatur dekket i aluminiumsfolie.
    Merk: Andre vanlige rengjøringsmetoder som plasma rengjøring eller piraja løsning kan brukes så lenge som bakgrunnfluorescens av de rensede lysbilder fortsatt kvasi-null.
  2. Tilbered en lav-fluorescens agarose-løsning ved smelting i en mikrobølgeovn, en 2% agarose - destillert vann-oppløsning (70 ° C). Umiddelbart legge 500 mL av den klare 2% agarose løsning til 500 mL av 2X lav fluorescens kulturmedium og bland forsiktig.
  3. Før den kjøles ned og stivne, straks pipette denne agarose - medium løsning på et objektglass (No 1,5 tykkelse) for å danne en pute av omtrent 2 cm diameter og et par millimeter høyde. Unngå bobler og pop dem med en pipette tips om nødvendig.
  4. Flat ut puten med en annen "brent" dekkglass (No 1,5 tykkelse, se figur 1).
    Merk: Denne øvre dekk hjelper danne en flat homogen pad og beskytte mot støv og tørking mens cellene er under utarbeidelse. Minimal medium så som M9 eller rikt medium, for eksempel EZ Rich Definert Medium som har blitt testet for sin lave fluorescens.

3. Electroporation

  1. Inkubasjon
    1. Legg opp til 5 pl av merkede molekyler som er lagret i en lav-salt-buffer (<50 mM salt) til en enkelt porsjon av kompetente celler (20 ul bakterier eller 50 gjær ul) og inkuberes 10 minutter på is.
      Merk: Konsentrasjonen av fluorescerende merkede molekyler i stamløsninger og således mengden av merkede molekyler til cellen før elektroporering er direkte korrelert med laste effektivitet (figur 3, og diskusjon). Som noen proteiner er mindre kompatible med lav salt tilstand, kan saltkonsentrasjonen i lagringsbuffer økes, men volumet av merkede molekyler tilsatt til cellene før elektroporering må da bli redusert.
    2. Overfør blandingen av celler og merkede biomolekyler til en på forhånd avkjølt electroporation kyvette (0,1 og 0,2 cm mellomrom for bakterier og gjær, henholdsvis). Banke forsiktig på kyvetten på benken for å fjerne eventuelle bobler fra løsningen.
    3. Plasser cuvette inn i electroporator og bruke en høy spenning elektrisk puls til løsningen (0,9 til 1,8 kV / cm, se diskusjon for mer informasjon om hvordan du velger Voltage). En slik puls danner forbigående porer i cellemembraner slik at merket biomolekyler til å diffundere inn i cellene.
    4. Kontroller at tidskonstanten vist på electroporator er mellom 4 til 6 ms. Lavere tidskonstanter er ofte på grunn av for høy saltkonsentrasjon og / eller tilstedeværelse av bobler i kyvetten, og vil føre til svært lav eller ingen lasting av cellene.
  2. Utvinning
    1. Umiddelbart etter elektroporering, tilsett 500 ul av rikt medium, slik som SOC, EZ Rich Definert Medium, YPD eller et rikt medium til cellene.
    2. Inkuber prøven ved 37 ° C for bakterier og 29 ° C for gjær i 2 til 10 min. For levedyktighet målinger, der brukeren ønsker å vurdere hvor stor prosentandel av celler som vokser og deler seg etter elektroporering, bruk en lengre rehabiliteringsperiode (opptil 1 time) som we observere slike etterslep ganger før den første celledeling.
  3. Vasketrinn
    1. Vask cellene for å fjerne eventuelle ikke-internalisert biomolekyler ved å spinne ned cellene i 1 min ved 3300 x g og 4 ° C. Kast supernatanten og resuspender cellene i 500 pl PBS.
      Merk: For hver prøve fremstille en negativ kontroll for celler inkubert med den samme mengde av merket biomolekyler, men ikke elektroporert og vasket på samme måte som hovedprøven.
    2. Gjenta de forrige trinnene 3 ganger.
    3. I tilfelle av protein internalise, optimalisere vaskeprosedyre, avhengig av egenskaper og oppførsel av det merkede proteinet av interesse. Følgende trinn er eksempel på mulige optimaliseringer:
      1. Utføre de første tre vaskesykluser ved bruk av PBS inneholdende 100 mM NaCl og 0,005% Triton X100 for å fjerne ikke-internalisert proteiner som kan feste seg til den ytre cellemembran 22, <sup> 26.
        1. Filtrer de elektroporerte celler med et 0,22 um porediameter filter montert i et 1,5 ml mikrosentrifugerør ved pipettering av elektroporerte celler inn i filteret. Spinne ned i 3 min ved 800 xg og 4 ° C. Kast gjennomstrømning. Legg til 500 mL ny PBS over cellene og spinne dem igjen som før, og gjentar disse trinnene en gang 22.
      2. Tilsett en liten mengde av protease K (10 ng i 500 ul PBS) i løpet av den første vaskesyklus for å tillate spaltning av eventuelle ikke-internalisert protein.
    4. Spinne ned cellene i 1 minutt ved 3 300 x g og 4 ° C. Kast supernatanten og resuspender cellene i 150 pl PBS.
    5. Spre lastet celle løsning på agarose puten ved å fjerne den øvre dekkglass og spredning 10 ul av cellesuspensjonen dråpe av dråpen. Erstatte en ubrukt ren brent dekkglass (No 1,5 tykkelse, matchende mikroskop objektiv spesifikasjon) på than toppen av puten og trykk meget forsiktig på lysbildet.
    6. Beskytt elektroporerte celler fra lys ved å lagre gummifot i en ugjennomsiktig boks mens bildebehandling forskjellige prøver.

4. Microscope datainnsamling

Merk: Single-celle og single-molekyl fluorescens mikroskopi i levende mikroorganismer kan utføres på en hvilken som helst passende fluorescens mikroskop (spesialbygd eller kommersiell).

  1. Innstillinger
    1. Widefield eller HILO belysning
      1. Bilde prøver med noen TIRF / single-molekyl mikroskop.
        Merk: Som et eksempel, vi bruker i laboratoriet en tilpasset invertert mikroskop med en TIRF oppsett. Bjelker fra en 532 nm, og en 637-nm laser diode forenes og kollimeres før fokus på den bakre fokalplanet til objektivet. Fluorescensen fra prøven blir samlet gjennom samme formål, separert fra eksitasjonslys ved hjelp av en lang-pass og hakk-filter, og delt opp i gjend og grønne kanaler som bruker en dichroic speil. De to kanalene er avbildet på separate halvdeler av en brikke for en elektron multiplisere CCD (EM-CCD) kamera. Videoer tas opp med den kinetiske modus. Hvitt lys bilder oppnås ved hjelp av en lampe med hvitt lys og en kjøler er festet til mikroskopet som en belysningskilde.
      2. For generell enkelt-molekyl observasjon, sett illuminasjonsmodusen mikroskopet til TIRF eller HILO 23 (se diskusjon for flere detaljer om TIRF versus HILO bildebehandling). For å stille inn en HILO modus på en TIRF mikroskop, noe ned innfallsvinkelen av eksitasjonslys å skifte fokus litt høyere enn den dekkflate (image cellens indre snarere enn dens nedre membran er i kontakt med dekkglass, se 4.5.4 ).
      3. For celle-nivå analyse, lang single-molekyl sporing eksperimenter eller trinnvis fotobleking analyse, sett illuminasjonsmodusen mikroskopet til en widefield-modus ensuring kontinuerlig observasjon av hele cellevolumet, og derfor av alle internalisert merkede molekyler.
    2. Typisk bruk eksitasjon krefter rundt 0,5-3 mW (~ 50-400 W / cm 2).
      Merk: Lavere laser krefter er nyttige for å oppnå lang levetid fluorescens observasjon og sporing (over 1 minutt) mens høyere laser makter kan være nødvendig for høyere spatiotemporal oppløsning eller trinnvis fotobleking analyse.
    3. Bruk eksponeringstider fra 15 ms for sporing eksperimenter til 100 ms for mer generell observasjon og intensitet kvantifisering. Merk: Andre bildefrekvens og modusene kan brukes som stroboscopic belysning, spesielt for å studere rask Diffusorelementene arter 30.
    4. I TIRF mikroskop, registrere fluorescens-kanal på et elektron-multiplisere CCD (EMCCD) kamera på en forstørrelse som resulterer i en piksel lengde på ~ 100 nm / pixel. TIRF oppsettet er beskrive i større detaljer i referanse 26.
  2. Datainnsamling
    1. Slå av eller blokkere laserbelysning til starten av forsøket. Slå EMCCD kamera gevinst av for å forhindre skade på kameraet på grunn av overeksponering.
    2. Plasser agarose pad-sandwich opp ned på objektbordet, sammen med den celle dekket side som vender nedover, for å bringe cellen i nærheten av målet. Sette fokus på cellene i overført lysmikroskopi modus 28. Spill et bilde av hver celle av visningen under lett bildebehandling hvit for å finne cellen skisserer før du slår av det hvite lyset.
    3. Beskytt prøven fra laboratoriet omgivelseslyset.
    4. For HILO eksitasjon modus, justere vinkelen på eksitasjon strålen til hver maksimalt signal-til-støy-forholdet ved å belyse bare den delen av prøven nær dekkflaten.
      1. For å oppnå HILO belysning, fokusere laserstrålen inn bak fokusplanet av en 100x NA 1.4 objektiv 28 (høyere numerisk åpninger som 1.45 eller 1.49 er også egnet). Ved å skifte fokuseringslinsen vinkelrett på bjelken, flytter fokus bortsett fra målet sentrum, slik at strålen kommer ut av objektivet med en vinkel.
      2. Juster linseposisjonen for å maksimalisere signal-til-støy-forhold, intracellulær fluorescens-intensitet versus ekstracellulære bakgrunnssignal.
    5. Slå kameraet gevinst og starte datainnsamling før du slår på laseren.
    6. Mens du spiller inn data, erverve et hvitt lys bilde av hver FOV før eller etter opptak fluorescens data; Dette bidrar til å identifisere cellegrensene i fluorescens kanaler.
    7. For levedyktighet estimering
      1. Bruke en lav-fluorescens rik medium i agarose pad for å tillate celler til å vokse etter elektroporering.
      2. Ekvilibrere mikroskopet til den optimale temperatur for den undersøkte mikroorganisme (37 ° C for E. coli, 29 ° C i S. cerevisiae) Med en objektiv varmeapparat system.
      3. Rekord både hvitt lys og fluorescens bilder hvert 30 min, og pass på å holde seg på nøyaktig samme synsfelt under hele dataregistrering. Et lag av ≈1 time er vanligvis observert før cellene begynner å dele seg.
    8. Telle antall intern biomolekyler per celle
      1. Still laser makt til høye verdier (2-3 mW) og lang eksponeringstid (100 ms).
      2. Still belysning til Widefield-modus for å belyse hele cellen.
      3. Opp filmer som beskrevet i trinn 4.2 og pass på å ta opp ytterligere rammer (50-100 rammer) etter ferdigstillelse av fluorescens fotobleking.

5. Data analyse

  1. Generell analyse
    1. Analysere innspilte bilder og filmer, både i hvitt lys og fluorescens excitations, ved hjelp av et bildebehandlingsprogrammer, slik som fri programvare ImageJ.
      1. I ImageJ, åpne bilder eller filmer som er spilt på mikroskopet (TIF format) i Fil> Åpne> Filen plassering.
      2. Til kvalitativt sammenligne fluorescensintensiteter på en dataskjerm, sørg for at alle fluorescens bilder vises med de samme lysstyrke og kontrast i Image> Juster> Lysstyrke / kontrast. Justere manuelt eller automatisk innstillingene for et valgt bilde, trykk på "Set" knappen og velg "Overfør til alle de andre bildene" alternativet.
      3. Angi typen informasjon for å trekke ut: Analyser> Set Målinger, og velger (minst) "Area", "Standard avvik", "Min & max grå verdi" og "Mean grå verdi".
      4. Å sammenligne celle fluorescensintensiteter, velger du området s av interesse å bruke Freehand valgknappen av ImageJ og pakke ut celle intensiteter i Analyze> Mål. Den resulterende tabellen inneholder måleverdiene ogkan lagres og / eller kopieres til annen programvare. Den "Mean" verdi tilsvarer gjennomsnittlig intensitet per piksel i det valgte området, og kan sammenlignes direkte mellom celler eller mellom en celle og bakgrunnen.
      5. I en elektroporert celleprøve, blir en celle anses lastet hvis dens gjennomsnittlige intensitet per piksel er større enn den gjennomsnittlige intensitet per piksel til den negative kontrollen pluss tre ganger standardavviket (Av (I lastet celle)> Av (I -EP) + 3 * stdDev (jeg -EP)).
    2. Bygg falsk-fargede fluorescens overlay bilder og filmer for å vurdere kvaliteten og lasting av prøvene.
      1. I ImageJ, overlay bilder som det hvite lyset bildet og fluorescens bilde som tilsvarer den samme FOV i Bilde> Farger> Merge kanaler. Velg en farge for hvert bilde (C4 (grå) for det hvite lyset, C1 (rød) for rød kanal, C2 (grønn for grønne kanalen ... osv.).
      2. Sjekkpå overlay bilde som fluorescensen ligger innenfor cellegrensene (hvitt lys bilde), og at bakgrunnsfluorescensen er lav og homogene (uten lyspunkter utenfor cellegrensene).
      3. Før analyse av et stort antall celler, kontrollerer kvalitativt bilder svarende til den negative prøven er lik den tomme cellen vise langt lavere intensitet enn de elektroporerte celler.
    3. For levedyktighet eksperimenter, telle manuelt prosenter av å dele, ikke-dele men synlig intakt (identisk) og skadet (døde) celler fra samme synsfelt vokser over tid (se 4.2.6).
    4. Evaluere levedyktighet på minst 200 celler per prøve (elektroporert, negativ kontroll og tomme celler) for å samle nok statistikk.
  2. Cellebasert analyse
    1. Telle antall intern biomolekyler per celle ved trinnvis fotobleking analyse
      1. Segment celler ved selecting området av interesse å bruke Freehand valgknappen av ImageJ og tegne en figur rundt nettopp den cellen (tilsvarer cellemembranen).
      2. Pakk celle intensiteter over tid i Image> Stabler> Plot Z-aksen profil. Den resulterende diagrammet representerer den gjennomsnittlige intensitet per piksel for området innenfor cellegrensen versus hver filmramme som resulterer i en fotobleking kurve for den bestemte cellen. Den inneholder en første eksponentiell reduksjon av celleintensiteten og nådde en lavere asymptote (bakgrunnsfluorescens). Måleverdier og kan lagres og / eller kopieres til annen programvare ved å klikke på "Lagre" eller "Copy".
      3. Kopier og lim inn bleke verdier i et regneark kolonne (jeg rå).
      4. Beregne gjennomsnittlig autofluorescens per piksel som er tilbake etter fotobleking (I auto) ved å ta gjennomsnittet I- rå oppnådde verdier for de siste 50-100 rammer (lavere) asymptote.
      5. Subtract gjennomsnittlig autofluorescence per piksel som gjenstår etter fotobleking for at cellen fra den første fotobleking kurve: Jeg bleking = jeg rå - jeg auto.
      6. Bruk baseline-subtrahert fotobleking timetraces (I bleking versus ramme) viser mindre enn 10 kvantiserte skritt for å vurdere den gjennomsnittlige trinnstørrelse (enhetlig fluoroforen intensitet) på grunn av bleking av en enkelt fluorofor 26.
      7. Evaluere antallet internalisert molekyler per celle ved å dele den opprinnelige referansekorrigert celle intensitet (I bleking ved t = 0) ved den enhetlige fluoroforen intensitet.
    2. Encellede FRET effektivitet
      1. Måle gjennomsnittlig celler intensitet per piksel i både donor og akseptor utslippskanaler (på donor eksitasjon) og innen cellegrensen for hver kanal som forklarer i 5.1.1.4.
      2. Måle gjennomsnittlig pikselintensiteten for bakgrunnen i hver lmAnnel fra et tomt område av lysbildet.
      3. Trekk fra denne bakgrunnen intensiteten fra gjennomsnittlig intensitet per piksel. Bruk disse bakgrunnskorrigert fluorescensintensiteter å beregne FRET for hver celle ved å beregne bakgrunnen korrigert akseptor intensitet delt på totalt (akseptor + donor) bakgrunn korrigert intensitet på donor eksitasjon: Jeg ACCEPTOR / (jeg ACCEPTOR + I donor)
  3. Single-molekylet analyse
    1. Single-molekylet sporing og diffusjon analyse
      Merk: Protokollen for sporing spre fluorescerende molekyler i levende celler og å vurdere deres tilsynelatende diffusjonskoeffisient har blitt beskrevet 26, 28.
      1. Kort, passer bilder av enkelt fluoroforene i hver ramme av en 2D elliptisk Gaussian. Link lokalisert molekyler til et spor hvis de først i etterfølgende rammer innenfor et vindu på 5-7 piksler (0,48 til 0,67 mikrometer). Bruk en memory parameter av en ramme for å redegjøre for den forbigående forsvinningen av en Fluoroforen grunn til å blinke eller savnet lokalisering.
    2. In vivo smFRET analyse
      1. Manuelt identifisere lokaliserte molekyler inne celler fra filmer ved å gå gjennom en film i ImageJ og identifisere immobile (eller ganske immobile) molekyler i FRET (akseptor) kanal.
      2. Å pakke ut intensiteter i akseptor og donor kanalen som svarer til en immobile molekyl, velger du området rundt molekylet i hver kanal ved hjelp av "Oval" valgknappen av ImageJ (sirkel rundt hver enkelt fluorophore, ved hjelp av en ~3-pixel radius) og pakke ut molekylet intensiteter i Analyze> Mål. Den resulterende tabellen inneholder måleverdiene og kan lagres og / eller kopieres til annen programvare.
      3. Beregne bakgrunnsverdier per kanal fra gjennomsnittlig pikselintensiteten fra en sirkel av samme størrelse i et tomt område på gli over alle rammer som ble analysert.
      4. Bruk bakgrunns-subtrahert fluorescens-verdier i donor og akseptor kanaler (på giver eksitasjon) for fluorescens og FRET tids spor, som i den encellede FRET tilfelle (se 5.2.1.7).
        Merk: Automatisert og robust analyse og algoritmer har blitt beskrevet i Referanser 26-28, 31.

Representative Results

Prøveopparbeidelse

De forskjellige trinnene i protokollen blir presentert som skjematisk i figur 1. Som et eksempel representeres vi lasting av bakterier med dobbelt merket (donor og akseptor-fargestoff) DNA-fragmenter. Representative resultater for DNA-internalisering er vist i figur 2. For hver elektroporert prøven, ble data for tomme celler og ikke-elektroporerte celler også registrert (Figur 2). "Tomme celler" tilsvare elektrokompetente celler verken ruges med fluorescerende biomolekyler heller elektroporert; sin intensitet i det fluorescerende kanalen reflekterer autofluorescens nivå under identiske eksperimentelle betingelser (lasereffekt, tidsoppløsning, temperatur, etc.). "Non-electroporated celler" (også kalt -EP, dvs. minus EP) tilsvarer en negativ kontroll der elektrokompetente celler har blitt inkubert med fluorescerende biomolecules men ikke elektroporert. Disse ikke-celler elektroporert bør oppvise en fluorescens-nivå lik autofluorescens av de tomme celler, og betydelig lavere enn fluorescensintensiteten vises av belastede, elektroporerte celler. Dette bekrefter fjerning av eventuelle ikke-internalisert merket biomolekyler som kan ha tilknytning til den ytre cellemembran.

Figur 2
Figur 2: Representative resultater for internalisering av dsDNA merket med forskjellige fluoroforene på ulike konsentrasjoner i bakterier (AE) og gjær (F) Venstre til høyre:. Hvitt lys, fluorescens og overleggsbilder. - / + EP betegner inkubasjon uten / med elektroporering. Skala barer: 3 mikrometer. A. Cy3B dsDNA, 10 pmol, E. coli. B. ATTO647N dsDNA, 10 pmol, E. coli. C. Alexa647 dsDNA, 5 pmol, E. coli. D. Cy3B dsDNA, 100 pmol, E. coli. E. ATTO647N dsDNA, 100 pmol, E. coli. F. ATTO647N dsDNA, 30 pmol, gjær. Dette tallet har blitt modifisert fra referanse 26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Telle antall intern biomolekyler per celle

Fremgangsmåten for å anslå antallet internalisert merkede biomolekyler per celle ved hjelp av fotobleking analysen er presentert i figur 3 og Tilsetnings Film 2, sammen med representative resultater oppnådd med forskjellige konsentrasjoner av merket DNA. Celle lasting effektivitet øker med den opprinnelige beløpet av inkuberes merket DNA, slik at brukeren kan justere antall merkede molekyler per celle fra en "single-molekyl" nivå (<10, Supplementary Movie 2B) til en "ensemble" nivå (> 10 , Supplerende Movie 2A). En robust måte å beregne prosentandelen av lastede celler er to telle antall elektroporerte celler som viser en celle intensitet over den gjennomsnittlige celleintensiteten av ikke-elektroporert celler pluss tre ganger deres standardavvik (dvs. Av (I-EP) + 3 * stdDev (I-EP), hvor Av = gjennomsnitt I = intensitet per piksel, Std. Dev. = standardavvik og -EP = non-elektroporert) som vist i Figur 3.

Figur 3
Figur 3:. Telle antall intern molekyler ved hjelp av fotobleking analyse (A) Single-celle fotobleking analyse. Eksempler på fluorescens intensitet timetraces (blå: rå informasjoner, red: fit, innfellinger: WL og fluorescens bilder av E. coli lastet med ATTO647N-merket dsDNA før og etter bleking). Top: single-trinns bleking hendelsen. Midten: celle med ± 3 molekyler som viser blekingog blinker. Nederst: celle inneholdende> 10 trinn svarende til minst 10 molekyler (B) histogram av enkeltvise intensiteter høyde fra et automatisert trinn sittende algoritme fra 57 celler inneholdende mindre enn 6 skjelnes trinn.. Single-gaussisk form er sentrert ved 11 ± 3 au, svarende til et enhetlig fluorofor intensitet på 8100 fotoner per sekund. Stjernen markerer bin samle alle trinn høyder over eller lik 50 au (C) Histogram av internalisert molekyler per celle elektroporerte med ulike mengder ATTO647N dsDNA, beregnet etter deling den innledende fluorescens intensitet av den enhetlige fluorophore intensitet. Topp til bunn: tomme celler (dvs. ikke ruges med fluorescerende molekyler og ikke elektroporerte), ikke-electroporated (men inkuberes med fluorescerende molekyler, kalt -EP), og elektroporerte celler inkubert med 10 og 100 pmol dsDNA (oppkalt + EP). Tomme og ikke-electroporated celler tilsvarertil autofluorescence, mens elektroporerte cellene vise en bred distribusjon av intern molekyler, med en høyere andel av høyt belastede celler på 100 pmol (≥ 4 molekyler, se stjerne-merket bin). Internalise effektivitet (fraksjon av celler med Int.> Betyr + 3x Std. Dev. Av ikke -EP prøve) for 10 og 100 pmol prøvene var 94% og 90%, respektivt. Gjennomsnittlig antall intern molekyler per celle: 121 ± 106 molekyler for 10 pmol dsDNA, og 176 ± 187 molekyler for 100 pmol dsDNA. Innstillinger: 100 ms eksponerings, widefield belysning. Skala barer: 1 mikrometer. Dette tallet har blitt modifisert fra referanse 26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Celle lasting og levedyktighet

I tillegg til å endre mengden av merket biomolekyler tilsatt til cellene før elektroporering avbrukeren kan justere mengden av intern molekyler ved å velge forskjellige feltstyrker under elektroporering (figur 4, Supplerende Movie 1). Høyere feltstyrker føre til større internalise effektivitet, men føre til en svak nedgang på celle levedyktighet. For internalise protein, kan bruken av et filtreringstrinn bidra til å fjerne ikke-internalisert merkede proteiner (se 3.3.3.1.1). I slike tilfeller sørger celle filtrering som observerte fluorescerende proteiner er faktisk internalisert inne i bakterie cytoplasma; vi imidlertid oppmerksom på at filtrering har også en negativ innvirkning på celle levedyktighet (for mer informasjon, se NR 22).

Figur 4
Figur 4: Influence of elektroporering spenning på celle lasting og levedyktighet (A) Bar diagram som representerer effekten av elektroporering feltstyrken på lasting effic.iency (røde søyler) og levedyktighet av cellene (grønne søyler). 84 ± 8% av den ikke-elektroporert celle (0 kV / cm) deles etter 1 h på en agarose puten ved 37 ° C. Under de samme betingelser, 78 ± 3% og 49 ± 3% av cellene elektroporerte på 0,9 kV / cm og 1,8 kV / cm henholdsvis deles etter 1 time. For lasting effektivitet, er 73 ± 8% av cellene lastet på 0,9 kV / cm, mens 92 ± 6% av cellene er lastet på 1,8 kV / cm. Feilstolpene representerer standardavviket beregnet ut fra tre uavhengige målinger; mer enn 200 celler ble analysert for hver prøve og hver gjentagelse. Totalt lasting effektivitet øker med elektroporering spenning til liten skade cellenes levedyktighet. (B) Cell-baserte fluorescens målinger over flere generasjoner viser at den samlede fluorescens intensitet deles likt mellom begge dattercellene. Celle 1 og 2 refererer til celletallet i hvitt lys bilde (venstre) og fluorescens bilde ved t = 0. Scalebar: 1 mikrometer). Dette tallet har blitt modifisert fra referanse 26.

Protein intern

Representative resultater for protein internalisering er i figurene 5A-B. Det er spesielt viktig å fjerne så mye av den gjenværende frie (ureagerte) fargestoff fra proteinprøven som mulig før elektroporering. I eksemplene i figurene 5A & B, Cy3b merkede Klenow Fragment prøven (Cy3b-KF hvor KF er Klenow-fragmentet av E. coli DNA polymerase I, 66 kDa) inneholder bare 1% fritt fargestoff; et slikt fargestoff bidrag til den totale celle lasting er ubetydelig. Sammenligninger av den elektroporert prøve av interesse med både de ikke-celler elektroporert (inkubert med den samme mengden av merket protein) samt celler elektroporert med den ekvivalente mengden av fritt farvestoff utgjør to nødvendige kontroller for å sikre at den observerte fluorescerende molekylerer faktisk internalisert merkede proteiner.

Figur 5
Figur 5: Protein intern i levende bakterier (A) Representant fluorescens overlegg felt av synspunkter.. Celler elektroporert til 1,4 kV spenning med 50 pmol RNAP ω subenheten fra et protein lager løsning som inneholdt bare 1% fri Cy3b fargestoff. Ikke-elektroporert (ikke -EP) og tomme celler er definert som tidligere. Fri fargestoff ble internalisert i samme konsentrasjon som i den RNAP ω elektroporert prøven. Imaging i bredt felt modus, 532-nm eksitasjon ved 1 mW, 50 ms eksponering. (B) Fordeling av ikke-korrigert celle-gjennomsnitt intensiteter for prøver i (A), gitt i andel av den totale celletall. Mer enn 400 celler per prøve ble segmentert. Dette tallet har blitt modifisert fra referanse 22. (C) internalisering av unlaBeled T7 RNA-polymerase (T7-RNAP, 98 kDa) inn i elektrokompetente DH5a bærer pRSET-EmGFP plasmid som koder for emerald GFP (EmGFP) under kontroll av en T7-promoter. Venstre: Skjematisk av analysen. Midten: fluorescens overlegg. Høyre: histogrammer av cellebaserte fluorescensintensiteter for den ikke-elektroporert prøven (øverst) og cellene inkubert og elektroporert med T7-RNAP (nederst); omtrent 11% av de elektroporerte celler viser høy fluorescensintensitet (fraksjon av celler med Int.> betyr + 3x Std. Dev. av ikke -EP prøve) som indikerer ekspresjon av EmGFP. Stjernene indikerer binger samle alle intensiteter over eller lik 1100 au Skala: 3 mikrometer. Dette tallet har blitt modifisert fra referanse 26.

Figur 5C viser en annen anvendelse av protein elektroporering. Her er den elektroporert protein umerkede, men dens intern utløser en observerbar fluorescerende respons. Dette eksperimentet verifiserer prefølelse og funksjonalitet av elektroporerte proteiner i cellen cytoplasma. Umerket T7 RNA polymerase (98 kDa) ble internalisert inn i E. coli-stamme DH5a inneholdende et plasmid som koder for fluorescerende protein EmGFP under kontroll av en T7 promoter 26. Som genet for T7 RNA-polymerase er fraværende i DH5a, EmGFP ekspresjon i våre eksperimenter krever at funksjonelle T7 RNA-polymerase blir introdusert inn i celler via elektroporering (figur 5C). Etter elektroporering med 1 pmol T7-RNAP,> 11% av cellene (blå søyle, figur 5C) viste fluorescens høyere enn den negative kontroll (inkubert med den samme mengde av T7-RNAP, men ikke elektroporert). Dette resultatet fastslår at en andel av T7 RNAP molekyler internalisert av elektroporering beholde sin integritet in vivo og kan utføre sine tiltenkte funksjoner i cellen cytoplasma.

In vivo slite i single-molekyletog encellede nivåer

Til slutt blir den internalise og analyse av dobbeltmerkede arter i levende bakterier presentert i Figur 6 og Tilsetningsfilm 3. Som fluorescerende proteinfusjoner er ikke ideelt for in vivo-studier smFRET, evnen til å levere dobbelt merket biomolekyler i levende celler ved hjelp av elektroporering er én av de store eiendeler i denne metoden. Figur 6A presenterer encellede FRET analyse av bakterier lastet med forskjellige FRET DNA-standarder (ved hjelp Cy3B og Atto647N fluoroforene som donor-akseptor FRET par). Cellene elektroporert med 20 pmol av tre korte dobbelt-merket dsDNA FRET standarder med åpen FRET effektivitet (E *) på 0,17, 0,48 og 0,86 in vitro (tidligere bestemt 26). Alle DNA inn i cellene effektivt (Figur 6A, venstre) og den viktigste toppen av hver enkelt celle E * fordeling stemmer godt overens med de in vitro resultater (Figur 6A, Høyre). I de mellomliggende-og høy-FRET prøver, cellepopulasjoner med lavere E * enn ventet er observert, sannsynligvis på grunn av en kombinasjon av akseptor bleking og photophysical inaktivitet, variabel celle lasting (og dermed variabelt signal-til-støy-forhold), og DNA-nedbrytning .

Figur 6
Figur 6:.. Representative resultater for encellede og single-molekyl FRET observasjon i levende bakterier Ensemble og smFRET studier i enkelt bakterier (A) Analyse av celler lastet med 20 pmol hver av tre DNA FRET standarder stiller lav (~ 0,17), intermediat (~ 0,48) og høy (~ 0,86) FRET (som målt ved hjelp av in vitro enkelt-molekyl-målingene; se ref 26). Venstre: hvitt lys og grønn / rød (FRET) fluorescens overleggsbilder (Scale bar: 3 mikrometer). Eksempler på FRET-verdier fra forskjellige celler, er angitt (hvit). Rigg ht (topp til bunn):. ukorrigert cellebasert FRET (E *) histogram for donor bare (mørk grønn), lav (lys grønn), middels (gul), og høy (rød) FRET DNA-standarder (B-D) in vivo smFRET. Celler blir lastet med 0,25 pmol mellom-FRET-DNA (felt B), 0,25 pmol høy-FRET-DNA (felt C), og 5 pmol dobbelt-merket KF (panel D). Venstre kolonne: grønn / rød fluorescens overlay av enkelt ramme før og etter akseptor fotobleking. USA kolonne: tidstraser svarende til molekyl i gul sirkel. FRET effektivitet, donor utslippsintensitet, og akseptor utslippsintensitet vises i blått, grønt og rødt, henholdsvis. Høyre kolonne: FRET histogrammer av donor bare molekyler (grønn) og donor-akseptor molekyler (gul, rød, og grå) fra 20 tidstraser for hver prøve. Skala barer: 3 mikrometer for A, 1 mikrometer for B-D. Dette tallet har blitt modifisert fra referanse 26.208fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Å observere smFRET in vivo for DNA eller proteinprøver, lave mengder (0,25 pmol) av mellomliggende-og høy-FRET DNA-standarder (Figur 6B, C) ​​eller 5 pmol av dobbel-merket KF (Alexa647 / Cy3B fluoroforene som FRET par, figur 6D) er elektroporert til E. coli. Slike konsentrasjoner førte til mange celler lastet med få (n = 1-10) merket molekyler, slik at direkte lokalisering, sporing, og ergre overvåking for enkle molekyler. Noen molekyler diffunderer fritt, mens andre synes immobile eller diffuse sakte (Supplerende Movie 3). Timetraces av immobilisert dobbelt-merkede biomolekyler (Figur 6, middel) sist for 1 til 30 s og viser kjennetegnene til smFRET: anticorrelated endringer i donor og akseptor fluorescens ved akseptor bleking (for eksempel t ~ 16 sek, figur 6B, midten ), etterfulgt av én-trinns donor bleking (for eksempel t ~; 19 sekunder; figur 6B). FRET distribusjoner generert fra slike timetraces (figur 6, høyre) resultat i en middelverdi som er i utmerket avtale med publisert i vitro studier 26,31,32. Disse resultatene etablere mulighet for kvantitative smFRET studier på intern DNA og proteiner, og tyder på at proteiner opprettholde sin integritet og struktur på elektroporering og internalisering (som støttes av T7 RNAP internalise eksperimenter).

Supplerende Movie 1:. Celleviabilitet Venstre: Hvite lyse bilder. Høyre: fluorescens bilder. Animerte GIF animerte viser divisjon etter elektroporering (1,8 kV / cm) av bakterier lastet med 10 pmol Atto647 merket DNA. Den totale tilsynelatende reduksjon av fluorescens er på grunn av fortynning av merket DNA på celledeling og delvis også til fotobleking som oppstår under hvertmåling.

Supplerende Movie 2: Cell-baserte fotoblekings studier A.. Representativt eksempel på en tungt lastet celle (som inneholder> 100 Atto647N-merket DNA-molekyler). Øverst til venstre, hvitt lys bilde av cellen av interesse (rød firkant). Øverst til høyre, film av det belastede celler som viser deres fluorescens forfall over flere minutter. Bunn, tid spor av den totale fluorescens intensitet nedbrytning av cellen av interesse. Organiske fluoroforene kan vise fotobleking levetid to størrelsesordener høyere enn FPS (her, ~ 41 sek for Atto647N). B. representativt eksempel på en celle lastet med mindre enn 10 merkede molekyler (tre i dette tilfellet). Top, samme som panel A. Bunn, tid spor av den totale fluorescens intensiteten av cellen av interesse som viser enkelttrinnsbleking og / eller blinkende tilsvarende enkle organiske fluoroforer. Den gjennomsnittlige høyden av disse trinnene tilsvarer single-molekylet enhetlig intensitet (her ~12 au) brukes til å estimere den første antall internaliserte molekyler per celle. Filmer under kontinuerlig rød laser eksitasjon ved 300 μW makt og 100 msek per bilde.

Supplerende Movie 3: Jeg n vivo single-molekyl FRET Top:. Celler lastet med 0,25 pmol høy FRET DNA (som i figur 6C) kontinuerlig overvåket på 50 ms per bilde henhold nTIRF belysning ved hjelp av en mW grønn (532 nm) laser. Hver ramme er en grønn / rød (FRET) fluorescens overlegg for hver kanal. Diffuserende og immobile rødt (intakt) og grønn (enkel aktiv etikett) DNA-molekyler som kan observeres. Bunn: Tid trase svarende til molekyl i gul sirkel. FRET effektivitet, donor utslippsintensitet, og akseptor utslippsintensitet vises i blått, grønt og rødt, henholdsvis. Anti-korrelert akseptor bleking hendelse (rød-til-grønne overganger) tilsvarer signaturen av enkelt-molekyl gnage.

Discussion

Mange parametere kan varieres i løpet av celle elektroporering og datainnsamling, avhengig av det biologiske system av interesse og den nøyaktige natur av eksperimentet (celle-nivå eller enkelt-molekyl-analyse). For eksempel, når electroporating DNA inn i bakterier, 0,25 til 5 pmol av merket dsDNA-fragmenter fører til en lav virkningsgrad internalisering, som tillater direkte påvisning enkelt-molekylet (det vil si., Uten behov for fotobleking på forhånd). Over 5 pmol dsDNA, celler har en tendens til å være tungt lastet, et regime bedre egnet for encellede analyse. Alle merkede DNA bør også være tidligere gelrenset for å fjerne ethvert spor av frie fargestoff (ikke-omsatt fluorofor) fra DNA-stamløsning. Dessuten potensielle problemer med DNA degradering, spesielt for smFRET eksperimenter, kan løses ved hjelp av DNA med unaturlige nukleinsyrer, eller motiver som beskytter exonuclease tilgjengelige termini som hårnål sløyfer.

En annen juste parameter i elektroporering er feltstyrken påføres under elektroporering. Lav feltstyrke (~ 1 kV / cm), vil føre til en lav lasteeffektivitet egnet for enkelt-molekyl studier. Høyere feltstyrker (opp til 1,8 kV / cm) vil øke lasteeffektivitet; men det er en invers korrelasjon mellom feltstyrke og celleviabilitet etter elektroporering (se figur 4). For referanse, en vanlig feltstyrke som brukes for bakterier og gjær elektroporering er ~ 1,5 kV / cm. Tidskonstanten, som representerer lengden av denne råte, er en enkel parameter til følge, fordi tidskonstanten dråper så snart noen lysbuedannelse fenomen forekommer i kyvetten. Under normale innstillinger, bør tidskonstanten være større enn 4 ms; lavere verdier vil føre til lav lasteeffektivitet eller ikke-lastet skadede celler. De fleste electroporators tilby andre frihetsgrader (for eksempel "puls avkutting" eller "puls form") som kan endres for å tune bådecelle lasting og levedyktighet. Vi har anvendt denne metode for både bakterier og gjær, men lignende prosedyrer bør også tillate internalisering av merkede biomolekyler inn i pattedyrceller ved hjelp av egnede electroporator innstillinger siden deres membran er faktisk mindre kompleks (enkelt lipidbilag) og siden elektroporering har allerede blitt anvendt med slike celler 21.

Når internalisert merkede proteiner, må alle frie fargestoff å bli fjernet fra de merkede proteinstamløsning før elektroporering. Frie fargestoffmolekyler på grunn av deres mindre størrelse, kan internaliseres fortrinnsvis i løpet av proteiner av interesse, og er vanskelige å skille ved dataanalyse (til tross for deres forventede raskere diffusjon). Som en rettesnor, for et utvalg av organisk merkede protein for å være egnet for elektroporering, bør mengden av gjenværende fritt fargestoff være under 2% (påvist ved anvendelse av fluorescerende skanning av en SDS-PAGE) 22. Denne fremgangsmåte er spesielt viktig,som noen molekyler kan holde seg til de ytre membraner av elektroporerte bakterier eller gjær. I denne forbindelse bør det negative kontrollprøven viser fluorescens-intensitet per celle klart lavere enn elektroporerte celler, ideelt så lavt som autofluorescens nivået av tomme celler (celler som ikke er inkubert med eventuelle fluorescensmerkede biomolekyler eller elektroporerte, figur 2).

Som med dsDNA er internalise effektiviteten av merkede proteiner bundet til mengden av biomolekyler tilsatt til cellene før elektroporering. Men andre parametre, som størrelse og kostnad, spille en rolle i internalisering. Små proteiner oppviser høy effektivitet internalisering, mens større proteiner (opp til 98 kDa) med hell kan internaliseres, men med lavere effektivitet (figur 5) 26. Den isolelectric punktet av proteinet, potensielle interaksjoner med cellemembranen og andre fysiske og kjemiske parametere ogsåinnflytelse celle lasting under elektroporering. Som et resultat, brukerne trenger å optimalisere eksperimenter for sitt eget system, vel vitende om at en høy initiell konsentrasjon av merket protein (> 50 mm) vil gi den beste muligheten for vellykket lasting. Electroporation tilbyr også et nytt verktøy for å forurolige og analysere cellefunksjon ved å innføre proteiner og andre biomolekyler i celler (enten merket eller umerket). T7-RNA-polymerase eksperimenter (figur 5C) er tilstede, for eksempel av et eksempel på et eksperiment hvor vi kan innføre et biomolekyl som kan endre genekspresjon in vivo ved hjelp av elektroporering.

Ved utføring av enkeltmolekyl fluorescens eksperimenter, er TIR belysning vanligvis foretrekkes fremfor andre belysnings modi som det gir det beste signal-til-støy-forholdet ved bare å eksitere fluoroforer i en tynn seksjon over dekkflaten (~ 100 nm). Men bilde merket biomolekyler diffunderer inne levende mikroorganismer kan reKor dypere belysning (opptil 0,8 mikrometer for E. coli). Dypere belysning oppnås i HILO modus, og samtidig bevare et høyt signal-til-støy-forholdet. På den annen side er bredt felt avbildning spesielt viktig for trinnvis fotobleking analyse, hvor brukeren estimere antall internalisert molekyler ved fotobleking et helt lastet celle med høy lasereffekt og å dividere den første celle fluorescensintensitet ved den enhetlige intensiteten produsert av et enkelt molekyl (enkel fotobleking trinn, figur 3). Widefield avbildning er også nødvendig for langtids molekyl sporing for å lokalisere de diffunderer molekyler av interesse, selv om deres baner dekke hele cellevolumet.

I denne protokollen, presenterer vi hvordan elektroporering en standard teknikk for biologer og biochemists for avgivelse av nukleinsyrer i celler, utgjør en enkel metode for å levere fluorescerende biomolekyler i ulike celletyper. Ther romanen, og tilbyr høy gjennomstrømming teknikk et unikt verktøy for å observere merkede molekyler i sitt opprinnelige miljø. I tillegg biomolekyler merket med fluoroforer som dekker et bredt område av bølgelengder, elektroporering kan levere molekyler modifisert med mange kjemiske grupper, for eksempel unaturlige nukleotider og aminosyrer, metallchelatorer, tverrbindingsmidler, og caging grupper. Hvis det biologiske system av interesse er ikke vesentlig for celleutvikling, kan genet som koder for mål-protein også bli slettet (eller slått ned), slik at proteinene observert etter internalise representerer alle (eller de) av det intracellulære protein bassenget . I hovedsak kan elektroporering "transplantasjon" fleksibiliteten til in vitro bioconjugates i levende celler og derfor nytte innsats i syntetisk biologi, systembiologi, og in vivo single-molekyl deteksjon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ElectroMax DH5-alpha Comptent cells Invitrogen 11319-019 or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast.
EZ Rich Defined Madia Teknova M2105 low fluorescence rich media
MicroPulser Electroporation Apparatus  Biorad 165-2100 or any classical electroporator for microorganism transformation
Certified Molecular Biology agarose Biorad 161-3100 low fluorescence agarose for agarose pad
Microscope coverslips No 1.5 thickness Menzel BB024060SC remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h
Single-molecule fluorescence microscope Home-built described in REFs
Localization software Custom-written, available online MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. 
Tracking software Available online MATLAB implementation by Blair and Dufresne. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  2. Leake, M. C., et al. Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes. Nature. 443, 355-358 (2006).
  3. Taniguchi, Y., Kawakami, M. Application of HaloTag protein to covalent immobilization of recombinant proteins for single molecule force spectroscopy. Langmuir. 26, 10433-10436 (2010).
  4. Xie, X. S., Choi, P. J., Li, G. W., Lee, N. K., Lia, G. Single-molecule approach to molecular biology in living bacterial cells. Annual review of biophysics. 37, 417-444 (2008).
  5. Lee, J. H., et al. Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ. Science. 343, 1360-1363 (2014).
  6. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  7. Sauer, M. Localization microscopy coming of age: from concepts to biological impact. J Cell Sci. 126, 3505-3513 (2013).
  8. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Hao Chen, K., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localizationbased super-resolution imaging. Nat Meth. 8, 1027-1041 (2011).
  9. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Meth. 2, 905-909 (2005).
  10. Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization. Nat. Methods. 9, 480-482 (2012).
  11. Jaitin, D. A., et al. Massively Parallel Single-Cell RNA-Seq for Marker-Free Decomposition of Tissues into Cell Types. Science. 343, 776-779 (2014).
  12. Aldridge, S., et al. AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation. Genome Biol. 14, R124 (2013).
  13. Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).
  14. Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nat. Methods. 7, 717-719 (2010).
  15. Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).
  16. McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. J Cell Biol. 98, 1556-1564 (1984).
  17. Clarke, M. S., McNeil, P. L. Syringe loading introduces macromolecules into living mammalian cell cytosol. J Cell Sci. 102, 533-541 (1992).
  18. Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nat. Methods. 7, 203-205 (2010).
  19. Taylor, L. S. Electromagnetic syringe. IEEE Trans. Biomed. Eng. 25, 303-304 (1978).
  20. Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 16, 6127-6145 (1988).
  21. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
  22. Sustarsic, M., et al. Optimized delivery of fluorescently labeled proteins in live bacteria using electroporation. Histochem Cell Biol. , (2014).
  23. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nat. Methods. 5, 159-161 (2008).
  24. Sinha, A., et al. A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium. Nature. 000, 1-5 (2014).
  25. English, B. P., et al. Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E365-E373 (2011).
  26. Crawford, R., et al. Long-lived intracellular single-molecule fluorescence using electroporated molecules. Biophys J. 105, 2439-2450 (2013).
  27. Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Single-molecule DNA repair in live bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8063-8068 (2013).
  28. Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking. J Vis Exp. , (2014).
  29. Hohlbein, J., Gryte, K., Heilemann, M., Kapanidis, A. N. Surfing on a new wave of single-molecule fluorescence methods. Phys Biol. 7, 031001 (2010).
  30. Xie, X. S., Yu, J., Yang, W. Y. Perspective - Living cells as test tubes. Science. 312, 228-230 (2006).
  31. Santoso, Y., et al. Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 715-720 (2010).
  32. Hohlbein, J., et al. Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion. Nature communications. 4, 2131 (2013).

Tags

Microbiology elektroporasjon fluorescens slite in vivo enkelt-molekyl bildebehandling bakterier Escherichia coli gjær internalisering merket DNA merkede proteiner
Internalisering og Observasjon av Fluorescent biomolekyler i levende mikroorganismer via Electroporation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aigrain, L., Sustarsic, M.,… More

Aigrain, L., Sustarsic, M., Crawford, R., Plochowietz, A., Kapanidis, A. N. Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation. J. Vis. Exp. (96), e52208, doi:10.3791/52208 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter