评估人体脂肪注射生存能力的裸鼠与微型计算机断层扫描

Abstract

脂肪移植是外科医生的医疗设备为整个身体的软组织缺损治疗的一个重要工具。脂是理想的软组织填充物，因为它是现成的，容易获得的，价格低廉，并且固有生物相容的^。1然而，尽管其新兴普及，脂肪移植由不可预知的结果和可变移植物存活率的阻碍，与已发表 ​​的保留率从10不等的任何地方^-80％。1-3

为了便于对脂肪移植的调查，我们已经因此开发了一种动物模型，该模型允许注入脂​​肪量保留的实时分析。简要地说，一个小的切口由在CD-1裸鼠的头皮和200-400微升处理的吸脂物的被放置在头骨。头皮被选择，因为其缺少天然皮下脂肪作为受体部位，并且由于由颅骨提供的优良的背景的对比度，这有助于分析过程。微型计算机断层（微CT），用于扫描所述接枝在基线和此后每两个星期。在CT图像重建和成像软件用于量化接枝卷。

传统上，技术评估脂肪移植量有必要在实施安乐死的动物研究，通过物理测量体外提供移植的重量和体积只是一个单一的评估。生化和组织学的比较也同样需要研究的动物进行安乐死。这说明成像技术提供了可视化和客观初始嫁接后多个时间点量化量的优势，而无需牺牲动物的研究。该技术是由移植物能够被注入作为更大的移植物的风险的皮肤和脂肪坏死的尺寸的限制。这种方法具有实用性的所有研究评估脂肪移植的可行性和音量保留。它特别适合于providi纳克脂肪移植的可视化表示并按照随时间的变化量。

Protocol

注：实验方案和患者知情同意书获得了脂肪的审查和批准由斯坦福大学的机构审查委员会（协议＃2188）。所有动物的程序批准了根据协议＃9999对实验动物护理（APLAC），斯坦福大学行政专家组。所有实验均进行了严格遵守动物的安全性和人文关怀的指导方针。

1.脂肪收获

1. 使用科尔曼过程^17-19，获取人体脂肪组织从健康的女性患者择期吸脂腹部，胁肋，和/或大腿的区域。
2. 处理吸脂物接枝，通过使脂肪沉降30分钟开始。
3. 脂肪抽吸物通常稳定于三层，与油在顶部，脂肪在中间，和血液在底部。吸并丢弃顶部油层和底血液层。
4. 以进一步除去任何残留的tumesc耳鼻喉科流体或细胞碎片，离心脂肪5分钟，在350×g离心，4℃，并吸出底部水层。
5. 计算所需的接枝的脂肪量，允许20％的输送误差，和脂肪的所需体积转移到50毫升锥形（多个）。乘以400由小鼠的数目在研究，以获得所需的接枝脂肪微升。
6. 在这一点上，如果执行细胞辅助脂肪移植^20,21，代替卷脂肪接枝在冰上。然后收获脂肪来源从剩余的脂肪利用由Zuk 等人^，22中所述的标准技术基质细胞（ASCs）。

2.脂肪移植

1. 获得女，纯合子CD-1裸鼠的实验研究。选择8之间小鼠 - 12周龄。
2. 为了诱导麻醉，放置鼠标与2.5％异氟醚/氧气混合物击倒箱2升/分钟约10分钟。请注意，推荐ISOFlurane剂量随小鼠品系。
3. 当鼠标的呼吸速率有所减缓，确定适当的镇静与脚趾捏。适用兽医润滑眼药膏鼠标的双眼。
4. 如果鼠标没有响应脚趾捏退缩，这证实了麻醉足够的平面。将鼠标的鼻子到鼻锥为1-2升/分钟提供2.5％异氟醚/氧气混合物。如果鼠标从脚趾捏缩回，5分钟后返回击倒框和复试。
5. 根据小鼠建立无菌区，然后消毒头皮用2.5％聚维酮碘，随后用70％乙醇溶液。重复两次以上。
6. 将手术单上的鼠标并注意保持无菌区。无菌器械，手套，和PPE应使用在任何时候。
7. 如果要移植的脂肪量是以前放在冰上，让胖子先调整到RT分娩前。
8. 后送1毫升鲁尔锁注射器用1毫升脂肪。
9. 一14克，8厘米长的脂肪移植插管连接到注射器的末端。
10. 素系统通过按压注射器活塞直到微升脂肪之间200和400保留在注射器中。而压下针筒柱塞确认该套管已通过观察脂肪退出远侧套管孔完全填充有脂肪。
11. 用细镊子，解除背部皮肤中线覆颅骨尾部，最有看点。使1.5毫米的切割用细剪刀皮肤。
12. 通过稍后将用于使伤口边缘一起进行移植后的切口的中间放置一个单一6-0尼龙缝线。不打领带的缝合。
13. 通过皮肤切口插入套管，并通过插管来回扇形图案在颅骨以释放任何结缔组织附着物覆盖皮肤创建皮下囊袋在头骨。
14. 一旦口袋里已经创建，定位的Cannula在小鼠直接在颅骨直至前端的中线在于在哪些应该只是后面的眼睛之间绘制的线的袋的嘴侧最方面。 （ 图1A）
15. 慢慢逆行时尚脂肪注入，推动活塞，同时拉动套管回。使用镊子，把伤口边缘在一起，解除他们保留任何脂肪泄漏的口袋。
16. 配合先前放置，并确保所述第一结在于轻轻抵靠皮肤缝合。领带三个正方形结和切断用3毫米尾巴缝线。 （ 图1B）
17. 确认与可视化，而且口袋里没有装得过满而覆皮口袋里是不是紧张，触诊。如果口袋里已经装得太满，切缝和口袋内取出所有的脂肪。洗口袋用磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4的，重新注入的脂肪较小体积。
18. 从拔下鼠标nesthesia和地点其在一个干净的笼子本身背面或侧面。监测动物的正常呼吸，正常运动，没有出血，疼痛或痛苦的迹象。管理丁丙诺啡0.1毫克/ kg皮下注射，每6小时长达48小时，如果动物是在痛苦中。
19. 确保动物已经醒了足够的前离开它无人值守，保持胸骨斜卧。不要把动物与其他动物的笼子，直到它已完全恢复。
20. 4小时后，确保动物可以吃，喝，移动和呼吸正常，没有从手术部位出血。返回到动物护理设施。

3.显微CT

1. 扫描小鼠经手术后第3天的基线量，然后在手术后2周，4，6和8重复扫描。
2. 当成像的小鼠在每个时间点，请为S中前面所述前置和后置程序镇静及动物护理指南TEPS 2.2-2.4和2.17-2.19。
3. 上执行的微CT扫描仪扫描的100微米或更好的一个重建的体素尺寸。
4. 随着80 kVp的峰值透视千伏和450μA的阳极电流，管理约5 centiGy配给量9分钟的扫描，以每只小鼠中。请注意，这些值是不同的，这取决于扫描协议。
5. 之前执行所述第一扫描，校准显微CT与成像幻像空气，水和骨强度之间进行区分。
6. 放置四只小鼠成扫描器与两只小鼠在上面，两个在底部的腹侧的位置。使用60毫升注射器按住鼠标的身体和10ml注射器为鼻锥²³的扫描床可以很容易地构造。
7. 维持麻醉下的小鼠用2.5％异氟烷/氧混合物以每分钟1-2升。
8. 与侦察图像确认该小鼠的整个颅骨，从鼻子到第一颈椎，和从头骨顶部SKU的基LL，将被成像。

4.微型CT分析

1. 用微CT成像分析软件，允许创建感兴趣区的（ROI的），通过选择使用的阈值的像素强度的体素打开重建图像。软件还允许创建三维曲面通过选定像素的插值，并且音量分析。
2. 开始通过加载在二维（2D）冠状，轴向和矢状视图的重建的CT图象。 （ 图2A）
3. 使用轴向切片作为指南，导航到对应于脂肪移植物的最左方面的矢状切片。选择像素强度捕获对应于脂肪移植的所有体素的上部和下部阈值，但不包括在周围组织和骨。 （ 图2B）
4. 定义在使用之前定义的像素强度阈值对应于脂肪移植矢状视图的ROI。 řEPEAT此过程每第五矢状切片，导航，直到移植物的最右边的方面为止。 （ 图2C）
5. 插值所有2D ROI的选择体素成一个单一的，结合3D ROI。 （ 图2D）
6. 由软件计算记录的ROI体积。
7. 渲染3D等值面可视化最终脂肪移植量。 （ 图2E）
8. 在后续的分析中，一定要保持的像素强度的最大和最小阈值的那些相同用于基线分析。

5.脂肪收获

1. 后的小鼠已经扫描了一周8 ^24,25的时间点，麻醉如先前上文步骤2.2-2.4和2.17-2.19描述的小鼠。
2. 下面APLAC准则，通过分开他们的脊柱安乐死的小鼠。
3. 将鼠标在手术视野。采用跟腱切断术剪刀，小心地打开口袋，解剖吨他覆皮肤和结缔组织附件从脂肪移植。
4. 在这一点上，它可能有助于切除覆背部皮肤的贴片中提取接枝的，以帮助。 （ 图3A）
5. 轻轻地保持牵引用钳子移植和移植转从一侧到另一侧，以可视化的张力的连续点需要被释放剪刀。
6. 切除时，尽量减少与接枝采取的结缔组织逗留接近接枝越好。 （ 图3B）
7. 切除移植物后，测量的质量上配衡规模即精确到至少为0.01克。
8. 计算脂肪移植物的使用测量的​​质量值的数量和人体脂肪的平均密度（0.9微克/毫升），为转换率。
9. 比较脂肪移植到使用微CT获得的计算量。
10. 脂肪移植可用于组织学或进一步分析，如果需要进行处理。

Representative Results

脂肪移植逐渐减小的体积过学习的过程中，产生由8周（ 图4A）62.2％的平均存活²⁴在完成8周的扫描，每个脂肪接枝萃取在一个单件。甲Wilcoxan秩和检验被用于比较由两种显微CT获得的或从物理质量计算脂肪移植的体积测量值之间的差。没有显著差异这两种方法（ 双侧 P -值= 0.9362）之间找到。 （ 图4B）

用5 centiGy每次扫描和五个扫描的时间点，各小鼠接收不超过总共25 centiGy过的研究过程中更。与此相一致，没有小鼠显示皮肤辐射烧伤的任何毛证据。

图1（A） 。（B）的裸鼠在完成脂肪移植术，与单个的尼龙缝合线用于使伤口边缘在一起。口袋里已经坐满，但不紧张。

图2.（A）的重建图像最初显示为轴向，冠状，矢状和意见。（B）使用轴向观为指导，以导航到上矢状鉴于移植的最左的方面。设置像素强度的阈值，使得所选择的阈值范围内的所有体素将表示脂肪组织，从而允许在脂肪移植体积的划分。（C）的投资回报率的上开始于移植物的最左方面矢状视图中定义，并继续以往ý第五片移动到接枝的另一端。（D）中从二维的ROI的内插成一个单一的3D ROI所有选定体素。（E）的一种三维表面用三次样条插值以可视化的总脂肪接枝卷上创建。

图3.（A）脂肪移植外植前，用皮去掉背补丁。（B）外植发后的移植物。

图4（A）微型CT容积分析表明脂肪移植量逐渐丧失了8周。（B）最终脂肪移植量，如通过微CT测量，对应紧密合作，从植发移植群众计算的体积秒。人体脂肪（0.9微克/毫升）的平均密度被用作转换率。

表1.计算的微CT卷与实际测量脂肪量²⁴

Discussion

直到这一点上，大多数的研究人员一直依赖于非成像方式来量化脂肪移植的长期生存，但这些方法需要在研究动物的牺牲，并产生仅一个单次测量^。3,10-12我们的研究表示一种改进的分析方法，其允许在小鼠模型中的目标，实时脂肪移植存活的定量。

关键在这个过程确保充分免疫受损的小鼠用于该研究，因为这可以防止如果小鼠用完整的免疫系统被用于将发生的移植排斥反应。保留脂肪诚信是在收获，加工，安置嫁接阶段至关重要。按照传统公认的标准，应该由吸吸脂（SAL）获得脂肪移植术。在安置，脂肪应以稳定的流量速度不超过0.5毫升/秒注入。 A 14号插管是首选的移植我呐鼠标，但较大直径的套管，可以使用没有任何伤害的脂肪。小套管和针头，尤其是那些窄于16号，被放置在劝阻，因为他们可能会导致脂肪分解，由于增加剪切应力。虽然我们描述的优选技术，用于处理以上，沉淀，离心和/或过滤的任意组合可以，只要油和血液层被充分之前接枝从脂肪中分离出来使用。

脂肪移植物应该至少200微升的尺寸以最小化方差在结果中，由于脂肪移植的不一致的性质。较大的移植物高达400微升的尺寸都可以使用，但这个量以上，受损的血管供应和过度的皮肤张力可能导致脂肪和皮肤坏死。最终，最大脂肪接枝大小将由表面积和口袋的体积来确定。为了提高移植物的体积可以被安全地交付，宝cket可以通过更广泛解剖进行扩展。然而，这可能使脂肪超出头骨的顶部，这将使得移植物和周围的组织不清晰的对比度的边界。因此，随后的体素的选择将变得更加困难。

如果初始皮肤切口足够小，缝线可以不只要需要脂肪仍然包含的，并且不可见泄漏的口袋。如果缝线放置，必须小心，不要束缚第一结得太紧，否则可能会出现皮肤破裂。不可吸收的单纤维缝合线，例如尼龙是优选的，因为它限制了炎症反应和不太可能怀有感染。将发生在24至48小时后的可操作再上皮的切口，且缝合线可以在此时被除去。吸收和编织缝线不应使用。皮肤应始终需要最少的部队处理，外科医生应注意不要挤压皮肤同时举行了伤口边缘。

根据研究者的成像分析软件，像素强度和组织的密度之间的确切关系可以变化。调查人员应选择像素强度阈值，以获得最准确地区别于周围组织的脂肪移植物的最大和最小范围内。相同的最大和最小阈值应该被用来在所有体积的分析，以保持一致性。

有多种方法来选择接枝量一次像素强度阈值已被设定。虽然我们发现画用毛笔工具在矢状认为最好在我们手中，其他的体素的选择方法来创建一个投资回报率，可以使用如与样条曲线工具或绘画在轴向立面图，效果图。优选，如果一个人执行所有体积尽可能一致的分析，以减少测量误差。

非这种方法和接枝进化的实时可视化的侵入性性质提供优于传统技术显著优点。然而，该技术是在其识别残余移植物的存活和健康的能力受到限制。此外，它不能表现出移植物的相对血管重建。虽然外观变化和接枝密度可能暗示脂肪坏死，感染，囊肿形成，或液化，因此很难单独得出精确的结论，从显微CT。

我们希望这项技术将作为一个基础，人们未来的研究可以进行更好地了解致病因素，脂肪移植物的存活和损失。有关这一主题的变化可以阐明干细胞，生长因子，细胞因子，基因的作用，以及细胞表面标记物中的脂肪量接枝的最终保存播放。有了这个改进的工具来测试对比假设，我们期待一个更好地了解脂肪转移的TRANSFO有效值反复无常的技术，用于治疗软组织缺损成为一个更可预测的。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SAL lipoaspirate
Centrifuge	Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA
50 ml conical tubes	BD Biosciences, San Jose, CA
CD-1 nude mice (Crl:CD1-Foxn1nu)	Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA
Isoflurane	Henry Schein, Dublin, OH
2.5% Betadine	Purdue Pharma, L.P., Stamford, CT
70% Ethanol solution	Gold Shield, Hayward, CA
1cc luer-lock syringe	BD Biosciences, San Jose, CA
14 gauge cannula	Shippert Medical, Centennial, CO
Forceps	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany
Tenotomy scissors	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany
6-0 nylon suture	Ethicon, Blue Ash, OH
Phosphate buffered saline	Gibco, Carlsbad, CA
micro-CT scanner	Siemens Healthcare, Pleasanton, CA
Phantom	TriFoil Imaging, Northridge, CA
Imaging analysis software	IRW, Siemens Healthcare, Pleasanton, CA
Scale	Mettler-Toledo International, Inc., Columbus, OH