The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.
Regulering af proteinsyntese er et vigtigt kontrolpunkt i cellulære respons på stress. Navnlig blev diskret RNA regulatoriske elementer vist sig at tillade selektiv translation af specifikke mRNA'er, som typisk koder for proteiner, der er nødvendige for en bestemt stress respons. Identifikation af disse mRNA samt karakterisering af reguleringsmekanismer, der er ansvarlige for selektiv oversættelse har været på forkant med molekylær biologi i nogen tid. Polysom profilering er en hjørnesten metode i disse studier. Målet med polysom profilering er at fange mRNA translation ved immobilisering aktivt oversætte ribosomer på forskellige udskrifter og adskille de resulterende polyribosomer ved ultracentrifugering på en sucrosegradient, hvilket giver mulighed for en sondring mellem højt oversatte udskrifter og dårligt oversatte dem. Disse kan derefter karakteriseres yderligere ved traditionelle biokemiske og molekylærbiologiske metoder. Vigtigere kombinere polysome profilering med højt gennemløb genomforskningsmetoder giver mulighed for en storstilet analyse af translationel regulering.
Regulering af proteinsyntese (oversættelse) er en vigtig cellulær proces, der er nært knyttet til cellulær overlevelse. Da oversættelse forbruger mere end 50% af cellens energi, er det ikke overraskende, at oversættelsen er stramt reguleret, og at forstyrrelser i oversættelse ikke tåles godt. Omvendt er mange afvigende cellulære processer kræver, at oversættelse maskiner og oversættelse output (dvs. proteomet) skal ændres. Dette er ofte tilfældet i forskellige stress respons og sygdomstilstande, og er nok bedst eksemplificeret i kræft. En væsentlig fordel ved translationel kontrol er cellernes evne til hurtigt at omprogrammere protein output som reaktion på forskellige eksterne og interne udløser derved finjustering mekanisme, tip balancen mellem celle overlevelse og død 1.
To aspekter af translationel kontrol er særligt interessante; forståelse af karakteren af den regulerende mechanism (r) og betjeningselementer, der giver mulighed for specifik oversættelse, og identificering af specifikke mRNA og deres proteinprodukter, der deltager i den cellulære reaktion på den særlige trigger der fremkaldte selektiv oversættelse i første omgang. Polysom profilering er en teknik, der muliggør en effektiv undersøgelse af begge processer.
Det overordnede mål med polysom profilering teknik er at undersøge og kvantificere oversættelse tilstand af specifikke mRNA'er under forskellige cellulære betingelser. Princippet i teknikken er at fange mRNA oversættelse '' frysning '' aktivt oversætte ribosomer på forskellige udskrifter og adskille de resulterende polyribosomer ved ultracentrifugering på en sucrosegradient, hvilket giver mulighed for en sondring mellem højt oversatte udskrifter (bundet af flere ribosomer), og dårligt oversat dem (bundet af en eller to ribosomer). I dette særlige protokol, antibiotikummet cycloheximid, der binder til60S ribosomale subunit og blokerer frigivelsen af deacetyleret tRNA fra ribosomerne E site 2, der bruges til at hæmme ribosom translokation og stall ribosomer oversætte mRNA. Imidlertid kan andre blokeringsmidler, såsom emetin, der også blokerer translation forlængelse 3, kan anvendes.
I modsætning til den western blotting og 35 S-methionin mærkningsteknikker der måler det endelige resultat af oversættelsesprocessen, polysom profilering har den fordel, at måle ribosomer association med aktivt oversatte mRNA, hvilket giver mulighed for en mere detaljeret undersøgelse af translationsmekanismer under forskellige betingelser. Derfor kan teknikken let tilpasses til specifikt at studere forskellige former for oversættelse 4-6, proteiner faktorer involveret i oversættelse regel 7-9, stress, der påvirker proteinsyntese 1,10,11 eller virkningerne af mRNA strukturer såsom IRES eller opstrøms åbne læserammer på protein synthESIS 12-14. Dag, polysom profilering applikationer er endnu bredere med anvendelsen af DNA microarrays 15 eller næste generation sekventering 16,17 analysere polysomer-associerede mRNA'er.
Polysomalt profilering er en kraftfuld teknik, der giver mulighed for kvantificering af staten oversættelse af specifikke transkripter under forskellige behandlingsmetoder betingelser. Det er en meget enkel teknik i princippet, men det kræver flere trin for udførelse, hvoraf nogle er kritisk til fremstilling af gode polysom profiler. Disse vigtige trin er: 1) ved hjælp af RNase-fri kemikalier og plastvarer, 2) at udarbejde gode saccharosegradienter (i vores erfaring 10-50% saccharosegradienter fungerer bedst for effektivt at løse 40 / 60S underenheder og mRNA'er med bundne ribosomer), og 3 ) ved hjælp af celler, der er eksponentielt voksende, og ikke mere end 80% sammenflydende for at fange de højeste satser for oversættelse. Dette sidstnævnte trin bør tages i betragtning, når de udfører lange celle behandlinger, såsom gen knockdown eller overekspression, således at mængden af celler til pladen vil være en funktion af, hvor meget vil cellerne blive sammenflydende ved endepunktet.
I resultaterne PresenTed her, polysom profil analysen var et vigtigt redskab til at vurdere PDCD4 rolle i oversættelsen regulering af IRES-huser mRNA'er XIAP og Bd-XL 12. Den kendsgerning, at vi ikke observere nogen ændring i den generelle Polysomprofiler upon PDCD4 knock-down (Figur 1B) tilladt os at konkludere, at PDCD4 ikke forringe den globale cellulære oversættelse under betingelserne for eksperimentet. Vi næste anvendes RT-qPCR analyse for at bestemme fordelingen af XIAP og Bcl-xL mRNA'er i celler behandlet med PDCD4 eller kontrol siRNAs. qPCR er en metode til valg til analyse Polysomprofiler, i modsætning til standard RT-PCR eller Northern blotting, fordi det giver mulighed for en kvantitativ snarere end semi-kvantitativ analyse af mRNA distribution og til påvisning af subtile skift i translationseffektivitet mellem behandlingerne. Ved at bruge denne teknik, var vi i stand til at vise, at fordelingen af XIAP og Bd-XL-mRNA'er (udtrykt som en procent af den samlede mål-mRNA på tværs af gradient) var signifikant forskudt i tunge polyribosomer (mRNA'er med et stort antal af ribosomer associeret med dem) efter PDCD4 knock-down (figur 1D, E), hvilket indikerer en stigning i oversættelse af disse mRNA'er. Dette blev yderligere bekræftet ved en stigning i XIAP og Bcl-xL protein niveauer, men ikke i deres steady state RNA niveauer (figur 1F, G). Vigtigere er det, polysom fordeling af de ikke-IRES variant af XIAP var uændret mellem behandlede og ubehandlede celler (figur 1C). Alternativt kunne translationseffektivitet præsenteres i forhold til mRNA-indholdet i polysomer (sædvanligvis fraktioner 5 til 10) versus monosomer (sædvanligvis fraktioner 2 til 4) 14.
Brugen af kontrollen i hele protokollen er vigtigt at validere enhver polysom profilering resultat, som toppe observeres fra absorbanslæsninger ved 254 nm kan ikke på egen hånd kan henføres til ribosom RNA (detergents, såsom Triton X-100 kraftigt absorberer i dette område af spektret og kan tilsløre 40 / 60S toppe ved toppen af gradienten). Blanke gradienter uden lysat og / eller med lysat buffer skal køre for at bestemme den relative bidrag af bufferne til absorbansen ved 254 nm. Kulturgenstandsspor strukturer af højere orden kan også føre til fejlagtige fortolkninger af polysomer, hvor der er i virkeligheden ingen (fx "pseudo-polysomer" 20). Udskille magnesium (bruges hele proceduren at stabilisere 80S ribosomer) med den divalente kation chelator EDTA tilsat til lysaterne og gradient buffer (20 mM i 15 min) vil forårsage adskillelse af ribosomet i dets lille (40S) og store (60S ) subunits. Således, hvis absorbanstoppe registreret ved 260 nm er faktisk polysomer, vil EDTA-behandling kollapse profil, således at en enkelt maksimumsværdi vil blive observeret nær toppen af gradienten, der svarer til frigøre mRNA og ribosomale enheder (data ikke vist). Sammenfaldendemed EDTA-induceret kollaps af profilen, bør alle de specifikke mål analyseret af qPCR nu findes på toppen af gradienten.
Antallet af ribosomer associeret med en mRNA er ikke altid en indikator for, hvor effektivt at især mRNA oversættes. Der er faktisk specifikke sammenhænge, hvor aktiv oversættelse på polysomer bliver fastkørte 21,22 som læseren bør være opmærksom på. At afgøre, om eller ikke afskrifter deltager aktivt med oversættelsen maskiner kan ske ved a) behandling af prøven med puromycin, som i modsætning til EDTA, årsager "run-off 'af ribosomer, der aktivt translokation på tværs af en mRNA, eller b) behandling af prøven med homoharringtonin som hæmmer translokation af kun den første ribosom ved startkodonet, igen forårsager 'run-off' af eventuelle efterfølgende translokerende ribosomer.
Brugen af kontrol- transskriptioner for qPCR analyse er også kritisk. Udvælgelsesprocessention af udskrifter, der ikke er påvirket af forskellige behandlingsmetoder betingelser såsom nogle husholdning gener (GAPDH actin, tubulin, Nucleolin), ribosomale mRNA (18S, RPL13A), eller i dette tilfælde ikke-IRES variant af XIAP IRES, er vigtigt i kontrollere, om behandlingen har effekt på oversættelse er specifik eller generaliseret. Disse kontrol-transkripter kan anvendes til at normalisere fordelingen af de analyserede mRNA'er blev gjort her (XIAP og Bcl-xL-mRNA'er blev normaliseret til GAPDH mRNA og udtrykt som en procentdel af det samlede mRNA indhold, repræsenteret ved summen af mRNA-indholdet i hver fraktion ), eller alternativt kan mål- og kontrol mRNA udtrykkes som absolutte værdier, og vises separat. qPCR analysen af input lysaterne (normalt 10% af den samlede mængde) er endnu et skridt, der vil kontrollere for distribution af specifikke mRNA'er. Ideelt set bør indholdet af en specifik transkript i input lysat mRNA være sammenlignelig med summen af mRNA-indholdet i alle 10 fraktioner analyseres. Endelig, Et valgfrit trin til at kontrollere for phenol: chloroform-ekstraktion trin er at spike hver polysom fraktion med et in vitro transkriberet reporter mRNA (såsom CAT, chloramphenicolacetyltransferase) til at efterfølgende vil blive kvantificeret ved qPCR og kan endda bruges normalisere data 14.
Som med enhver teknik, den polysom profilering præsenterer nogle begrænsninger. Den omstændighed, at regel minimum 10 fraktioner (mere subtile forskydninger i translationseffektiviteten kan kræve 20 eller flere) skal indsamles for at have nice polysom distributioner gør dette trin begrænsende, i den forstand, at kun maksimalt 4 prøver kan være analyseret på et tidspunkt at være i stand til komfortabelt håndtere RNA ekstraktion og qPCR analyse af 40 prøver og 4 input kontrol på én gang. Stikprøvens størrelse kan nemt tilføje op med, hvor mange udskrifter, der skal analyseres, og hvor mange qPCR replikerer at gøre, og det kan være dyrt. En anden begrænsning af qPCR-baserede polysomalt profilering enNALYSE er, at det kun kan gøres på en kandidat-tilgang (hvor udskrifter, der skal analyseres, er kendt på forhånd), og kan ikke anvendes til genom-dækkende analyse af oversættelsen. I begyndelsen af det 21. århundrede, begyndte imidlertid efterforskerne at afhøre deres polysomalt RNA på et genomisk niveau ved hjælp af DNA mikroarrays 15 og senest med næste generation sekventering 16,17. I denne kraftfulde tilgang er polysomalt profilering udføres som beskrevet i denne protokol, bortset fra at i stedet for at udføre qPCR analyse af de enkelte fraktioner, monosomer fraktioner (normalt fraktion 2-4) og polysomer fraktioner (normalt fraktioner) samles sammen og variationer i den globale oversættelse analyseret ved DNA microarray eller hel-genom-RNA-sekventering. Derfor med denne tilgang, er det muligt at vurdere alle mRNA'eme hvis fordeling skift fra polysomer til monosomer (fald i oversættelse) eller omvendt (stigning i oversættelse) efter en specifik behandlingling. Validering og kvantificering af specifikke mRNA-polysomer fordeling kan derefter ske ved qPCR. En endnu mere kraftfuld brug af polysomalt profilering princip er ribosom profilering. Yderligere high throughput udvidelse af denne teknik blev for nylig rapporteret, som muliggør samtidig overvågning af hundredvis af polysom fraktioner 23. Dette giver en klar fordel, når sondering translationelle effektivitetsgevinster af mutant samlinger eller i en storstilet RNAi skærme. Ribosom profilering er en teknik, der drager fordel af næste generation sequencing til kort RNA-fragmenter beskyttet af ribosomer (ribosom fodspor) udøvet proteinsyntese 24,25. Ved denne teknik kan ribosom translokation inhiberes med cycloheximid (reversible) eller emetin (irreversibel) efterfulgt af cellelysis og RNase-spaltning til opnåelse af en population af ribosom fodspor. Ribosomer er beriget, total RNA isoleres, og forurener ribosomal og mitokondrie ribosomale RNA er fjernet.RNA-fodspor på ca. 26-28 nukleotider er isoleret, reverstranskriberes, omdannes til et cDNA-bibliotek og sekventeret 26. I modsætning til standard polysom profilering, denne tilgang ikke kun identificerer bestemte mRNA'er der er translationelt regulerede men giver også mRNA-specifikke oplysninger i codon opløsning såsom den nøjagtige besættelse og tæthed af ribosomer langs en specifik udskrift. Dette er især af interesse for mRNA'er med specifikke former for oversættelse, såsom IRES-huser mRNA, da det kan give flere oplysninger om, hvor på afskrift ribosom-rekruttering forekommer.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Gradient Master 108 automated gradient maker | BIOCOMP | 107-201M | |
Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker | LABCONCO | 4517000 | |
Beckman Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model # L-100-XP | |
Density gradient fractionator | TELEDYNE ISCO | 69-3873-246 | Composed of: tube piercing system, peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector |
WinDaq data acquisition software | DATAQ INSTRUMENTS | WINDAQ/LITE | http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm |
Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14×89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | |
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) | DiaMed | PRE1900-N | |
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) | SafeSeal | 12000 | |
Sucrose (nucleases-free) | Calbiochem | 573113 | MW = 342.3 g/mol |
Cycloheximide | SIGMA | C7698 | MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing. |
Sodium chloride (nucleases-free) | OmniPur | 7710 | MW = 58.44 g/mol |
MgCl2.6H2O (nucleases-free) | OmniPur | 5980 | MW = 203.3 g/mol |
Tris Base (nucleases-free) | J.T. Baker | 4109-01 | MW = 121.14 g/mol |
Triton X-100 | OmniPur | 9400 | Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation |
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2515 | |
RNaseZap Rnase inactivation solution | Ambion, Life Technologies | AM9780 | |
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen, Life Technologies | AM9516 | |
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion, Life Technologies | AM9722 | Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion |