Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vurdering af selektiv mRNA Translation i pattedyrceller polysom ​​Profilering

Published: October 28, 2014 doi: 10.3791/52295
Automatic Translation
1, 2, 3
1Apoptosis Research Centre, Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute and Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 2Montreal Neurological Institute, 3Apoptosis Research Centre, Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute and Department of Pediatrics, University of Ottawa

Abstract

Regulering af proteinsyntese er et vigtigt kontrolpunkt i cellulære respons på stress. Navnlig blev diskret RNA regulatoriske elementer vist sig at tillade selektiv translation af specifikke mRNA'er, som typisk koder for proteiner, der er nødvendige for en bestemt stress respons. Identifikation af disse mRNA samt karakterisering af reguleringsmekanismer, der er ansvarlige for selektiv oversættelse har været på forkant med molekylær biologi i nogen tid. Polysom ​​profilering er en hjørnesten metode i disse studier. Målet med polysom ​​profilering er at fange mRNA translation ved immobilisering aktivt oversætte ribosomer på forskellige udskrifter og adskille de resulterende polyribosomer ved ultracentrifugering på en sucrosegradient, hvilket giver mulighed for en sondring mellem højt oversatte udskrifter og dårligt oversatte dem. Disse kan derefter karakteriseres yderligere ved traditionelle biokemiske og molekylærbiologiske metoder. Vigtigere kombinere polysome profilering med højt gennemløb genomforskningsmetoder giver mulighed for en storstilet analyse af translationel regulering.

Introduction

Regulering af proteinsyntese (oversættelse) er en vigtig cellulær proces, der er nært knyttet til cellulær overlevelse. Da oversættelse forbruger mere end 50% af cellens energi, er det ikke overraskende, at oversættelsen er stramt reguleret, og at forstyrrelser i oversættelse ikke tåles godt. Omvendt er mange afvigende cellulære processer kræver, at oversættelse maskiner og oversættelse output (dvs. proteomet) skal ændres. Dette er ofte tilfældet i forskellige stress respons og sygdomstilstande, og er nok bedst eksemplificeret i kræft. En væsentlig fordel ved translationel kontrol er cellernes evne til hurtigt at omprogrammere protein output som reaktion på forskellige eksterne og interne udløser derved finjustering mekanisme, tip balancen mellem celle overlevelse og død 1.

To aspekter af translationel kontrol er særligt interessante; forståelse af karakteren af ​​den regulerende mechanism (r) og betjeningselementer, der giver mulighed for specifik oversættelse, og identificering af specifikke mRNA og deres proteinprodukter, der deltager i den cellulære reaktion på den særlige trigger der fremkaldte selektiv oversættelse i første omgang. Polysom ​​profilering er en teknik, der muliggør en effektiv undersøgelse af begge processer.

Det overordnede mål med polysom ​​profilering teknik er at undersøge og kvantificere oversættelse tilstand af specifikke mRNA'er under forskellige cellulære betingelser. Princippet i teknikken er at fange mRNA oversættelse '' frysning '' aktivt oversætte ribosomer på forskellige udskrifter og adskille de resulterende polyribosomer ved ultracentrifugering på en sucrosegradient, hvilket giver mulighed for en sondring mellem højt oversatte udskrifter (bundet af flere ribosomer), og dårligt oversat dem (bundet af en eller to ribosomer). I dette særlige protokol, antibiotikummet cycloheximid, der binder til60S ribosomale subunit og blokerer frigivelsen af deacetyleret tRNA fra ribosomerne E site 2, der bruges til at hæmme ribosom translokation og stall ribosomer oversætte mRNA. Imidlertid kan andre blokeringsmidler, såsom emetin, der også blokerer translation forlængelse 3, kan anvendes.

I modsætning til den western blotting og 35 S-methionin mærkningsteknikker der måler det endelige resultat af oversættelsesprocessen, polysom ​​profilering har den fordel, at måle ribosomer association med aktivt oversatte mRNA, hvilket giver mulighed for en mere detaljeret undersøgelse af translationsmekanismer under forskellige betingelser. Derfor kan teknikken let tilpasses til specifikt at studere forskellige former for oversættelse 4-6, proteiner faktorer involveret i oversættelse regel 7-9, stress, der påvirker proteinsyntese 1,10,11 eller virkningerne af mRNA strukturer såsom IRES eller opstrøms åbne læserammer på protein synthESIS 12-14. Dag, polysom ​​profilering applikationer er endnu bredere med anvendelsen af DNA microarrays 15 eller næste generation sekventering 16,17 analysere polysomer-associerede mRNA'er.

Protocol

BEMÆRK: Et notat om arbejdet med RNA: Tag almindelige forholdsregler for at beskytte mod RNA-nedbrydning ved RNaser. Brug handsker, barriere pipettespidser, RNase-fri plastvarer og kemikalier i alle trin i protokollen. Brug ultrarent eller DEPC-behandlet vand til alle løsninger. Dekontaminering alle formodede overflader med RNase inaktivering opløsning efter fabrikantens protokol.

1. Fremstilling af Solutions.

  1. Forbered 500 ml basisk opløsning (0,3 M NaCl;. 15 mM MgCl2 6H 2 O; 15 mM Tris-HCl, pH 7,4). Bland ved hjælp af en omrører, indtil opløsningen er klar og passere gennem et 0,45 um filter. Opbevares ved stuetemperatur.
  2. Forbered 10 og 50% saccharose Solutions og 60% Chase Løsning som følger:
    1. 10% saccharoseopløsning (w / v) i en 50 ml centrifugeglas tilsættes 5 g sucrose og fyld op til 50 ml med basisk opløsning. 50% saccharoseopløsning (w / v) i en 50 ml centrifugerør add 25 g sucrose og fyld op til 50 ml med basisk opløsning.
    2. For 60% (w / v) Chase Solution, i et 50 ml centrifugeglas tilsættes 30 g sukker og fyld op til 50 ml med basisk opløsning. Tilsættes 100 pi mættet bromphenolblåt opløsning (tilføj bromphenolblåt til vand, indtil der ikke mere vil opløse; centrifuge til pelletering af uopløst pulver) til 60% chase opløsning. Bland ved hjælp af en vortex og verificere fuldstændig opløsning.
    3. Opbevar opløsningerne ved 4 ° C indtil brug.
  3. Forbered RNA lysisbuffer. Forbered denne buffer frisk på dagen for eksperimentet. Forbered 500 pi RNA lysis buffer for hver prøve. Til 1 ml basisk opløsning tilsættes 10 ul Triton X-100 (1% [v / v] endelig), 1 pi af 100 mg / ml cycloheximid i DMSO (CHX, 0,1 mg / ml endelig) og 3,5 pi RNasin (140 U / ml). Bland ved hjælp af en vortex. Hold på is.
    BEMÆRK: cycloheximid er meget giftigt og kan forårsage mutationer. Undgå hudkontakt og indånding. For at undgå håndtering af pulverform for ofte preper en større mængde på 100 mg / ml lager i DMSO, portion og holde ved -80 ° C til langtidsopbevaring. Holde arbejder lager ved -20 ° C.
  4. Dagen for eksperimentet forberede Saccharose + CHX Solutions ved tilsætning CHX (slutkoncentration på 0,1 mg / ml) til det ønskede volumen på 10% og 50% saccharose-opløsning (~ 7 ml af hver opløsning pr gradient).

2. Fremstilling af sucrosegradient anvendelse af en automatiseret Gradient Maker

  1. Drej gradient maker '' ON '' og nivellere plade, der vil holde stigninger (criticalstep!) Klik på 'Udført' når pladen er jævnet med jorden.
  2. Vælg på menuen gradient program, der skal køres:
    1. Tryk på 'menu' 'GRAD', og vælg '' LIST '.
    2. Vælg "SW41".
    3. Rul gennem listen, og vælg ''10 - 50% gradient - 11 trin' 'program ved at trykke påing på 'RUN' 'knappen'.
  3. Placer en konisk ultracentrifugerør (SW-41 rør, 14 x 89 mm) i Marker Block og anvend den medfølgende fine rør markør til at spore et mærke på røret langs det øverste trin af markøren Block. Rørene anbringes i en passende rack på en stabil overflade.
    BEMÆRK: Dette mærke vil være fyldet guide for lagdeling af de 10 og 50% saccharoseopløsninger.
  4. Monter de to medfølgende kanyle til to 10 ml sprøjter og vask ved pipettering op og ned med varmt destilleret vand indeholdende RNase inaktivering løsning. Sørg for at fjerne alle spor af vand bagefter.
  5. Fyld den ene af sprøjterne med 10% sucrose + CHX og indsætte kanylen i bunden af ​​ultracentrifugerør. Forsigtigt dispensere 10% sucrose opløsning, indtil den går lige forbi mærke på røret.
    BEMÆRK: Undgå at bobler. Hvis der dannes bobler, bankes let slange at fortrænge dem.
  6. Fyld den anden sprøjte med 50% saccharose + CHX, aftørre ekstra væske offmed en serviet og forsigtigt indsætte kanyle ved bunden af ​​ultracentrifugerør. Forsigtigt dispensere saccharoseopløsningen 50% indtil den når præcis mærket. Fjern hurtigt og gnidningsløst kanylen.
    BEMÆRK: 10% sucrose vil stige i røret og danner en menisk på toppen. Hvis ikke tilsættes mere 10% saccharoseopløsning ved overfladen.
  7. Sæt den medfølgende hætte ved at vippe ultracentrifugerør lidt og fortrænge alle luftbobler. Fjern overskydende væske i hætten reservoir med en mikropipette.
  8. Tør overskydende væske langs rørvæggen og sted på gradient maker plade.
  9. Tryk på 'Kør' knappen ''.
    BEMÆRK: Pladen vil vippe på den angivne vinkel, pause i 5 sek og rotationer at danne gradient vil begynde.
  10. Når gradient dannelse er fuldstændig (ca. 2 min, bipper maskinen), forsigtigt fjerne ultracentrifuge (r), sted på rack og hurtigt fjerne hætten i en opadgående bevægelse for at undgå at forstyrre gradient.
  11. Hold gradient (s) på is. Vil ikke forstyrres! Alternativt holde gradienter natten over ved 4 ° C.
  12. Alternativt kan du bruge et to kammer gradient maker at gøre gradienter som følger:
    1. Skyl slanger og gradient maker med RNase inaktivering løsning og RNase-frit vand.
    2. Der tilsættes 5 ml 50% saccharose + CHX til proksimale kammer gradient maker og sikre, at enhver luft mellem de to kamre er fjernet.
    3. Der tilsættes 5 ml 10% sucrose + CHX til distale kammer gradient maker.
    4. Tilsæt 0,5 ml 50% saccharose + CHX til bunden af ​​et konisk centrifugerør (SW-41 rør, 14 x 89 mm) og plads i røret holder.
    5. Tænd omrører placeres i proksimale kammer, Åben Stop-haner og depositum gradient ved hastighed sat til "3" (omkring 1 ml / min).
    6. Sted gradient (s) på is. Forstyr ikke.
      BEMÆRK: Gradienter kan opbevares natten over ved 4 ° C.

3. Cell Lysis og ultracentrifugering.

    Placer SW-41 rotor og spande ved 4 ° C og indstillet centrifuge til 4 ° C.
    BEMÆRK: cellelyse procedure er optimeret til to 150 mm subkonfluerende (~ 70-80% konfluerende) plader af HEK293-celler pr gradient og de anvendte mængder kan være nødvendigt at justere for forskellige cellelinier.
  1. Pladeceller på passende celledensitet i vækstmediet mindst 24 timer før lysering.
  2. Forberede en portion (20 ml per 150 mm plade) vækstmedium indeholdende 0,1 mg / ml CHX.
  3. Cellerne inkuberes i CHX + medier (20 ml per 150 mm plade) i 3 minutter ved 37 ° C / 5% CO 2 at standse og stabilisere polysomer.
  4. Arbejder hurtigt, aspiratprøver medier fra pladerne, sted plader på is og vaskes cellerne en gang med 10 ml iskold phosphatbufret saltvand (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2PO 4) suppleret med CHX (endelig koncentration på 0,1 mg / ml) være omhyggelig med at pipettere langsomt ned side af skålen væg for at minimere ophævelse af cellemonolaget.
  5. Aspirer PBS og tilføje yderligere 10 ml PBS + CHX til hver plade, skrab cellerne med en celle løfteren og overføre det samlede volumen fra begge plader til et 50 ml centrifugerør på is. Behold 1 ml cellesuspension i et mikrocentrifugerør på is for downstream protein analyse.
  6. Centrifuger 50 ml rør af celler ved 300 xg ved 4 ° C i 10 min.
  7. Fjern alle PBS og resuspender pellet i 500 pi iskold RNA lysisbuffer.
  8. Overførsel cellesuspension til en 2 ml mikrocentrifugerør.
  9. Pipette op og ned for at lysere cellerne og inkuberes på is i 10 minutter med lejlighedsvis vortexing.
  10. Der centrifugeres ved 2.000 xg ved 4 ° C i 5 min for at pelletere kernerne.
  11. Overfør supernatanten til et nyt 2 ml mikrocentrifugerør.
  12. Der centrifugeres ved 17.000 xg ved 4 ° C i 5 min for at pelletere celledebris.
  13. Overfør supernatanten til et nyt 2 ml mikrocentrifugerør og bruge 2 pi at måleoptisk densitet ved 260 nm (brug lysisbuffer som blank).
  14. Fjern 50 pi (10% af totalen) fra hver prøve til analyse af total RNA. BEMÆRK Lysat kan opbevares ved -80 ° C indtil brug.
  15. Forsigtigt indlæse lige A260 enheder på hver saccharosegradienter (min 10 OD, optimale 25 OD, i en maksimal volumen på 500 pi;. Fortynde koncentreret lysat med ekstra lysispuffer hvis nødvendigt).
  16. Sikrer gradienter inden 0,1 g af hinanden, før ultracentrifugering.
  17. Centrifuger gradienter ved 39.000 rpm (260.343 x g) i 1,5 timer ved 4 ° C.
  18. Under spindown holde rotor bremse på og slukke den under deceleration, når den når 1000 rpm.
    BEMÆRK: Dette trin minimerer enhver forstyrrelse af de stigninger som følge af pludselige ændringer i acceleration som børstehovederne kontakte rotoren under bremsning.

4. Gradient Fraktionering System Instrument Set-up.

  1. Opsætning af instrumentet og blank spectrophotometer med vand som følger:
    1. Tænd komponenterne og lade lampen varme op i mindst 15 minutter.
    2. Sørg fraktionsindsamler er indstillet til 'polysom ​​«-metoden (tryk mappeikon to gange; tilbagevenden pil to gange for at vende tilbage til startskærmen).
    3. Sørg for, at ventilen på fraktionsopsamleren er indstillet til spilde (pil, der peger til papirkurven bin ikon). Placer en 250 ml Erlenmeyerkolbe indeholdende destilleret vand under affaldsindsamling røret.
    4. Vælg følgende indstillinger på diagramskriver: Set Følsomhed dial til "SET LAMP og optik; Set Noise filter skifte til "1.5"; sæt Peak separator drejeknappen til "OFF"; sæt Chart hurtigopkald til '30 cm / time "(5 cm / 10 min); sæt Baseline Justér drejeknappen (på toppen af ​​spektrofotometerenhed) til »bne«.
      BEMÆRK: Valgfrit: En digital recorder software kan bruges i stedet for kort optageren. På computeren skal du klikke på 'Start'. Et vindue erhvervelse vil åbne: under thmenu e Indstillinger, fravælg Pause grafik. Under Skalering, indstille grafens grænser til -10 og 100 (kan ændres on-the-fly under kørsel). Klik på knappen Gem for at oprette en ny fil og registrere kørslen.
    5. Anbring sprøjten og tønde i pumpen og spænd på plads (brug, forudsat skruer og unbrakonøgle).
      BEMÆRK: Undgå at overspænde.
    6. Fyld sprøjten med Chase Solution ved hjælp af '' REV '' kommando på hurtig hastighed. Placer pumpen i oprejst position og jage luft gennem slangen ved hjælp af '' FREM '' kommando. Brug kun RAPID for denne funktion og vaske.
    7. Installer et ultracentrifugerør fyldt med RNase-frit vand.
    8. Pierce den ultracentrifugerør med kanylen, indtil de to sorte mærker er synlige (udleveringen hul er placeret mellem disse to mærker) og start sprøjtepumpe på 'Manual' ved 6,0 ​​ml / min.
    9. Når vandet passerer gennem flowcellen (når chase opløsning fylder 1/3 af røret), skifte hastighed til variable og sat til 1,0 ml / min.
    10. Ved et flow på 1,0 ml / min, justere Baseline Juster skiven på spektrofotometer indtil spændingen på diagrammet er på nul (+/- 0,5 enheder).
      BEMÆRK: Overhold vand exit fra affaldet røret i Erlenmeyer-kolben.
    11. Indstil den ønskede følsomhed til "0.5" eller "1.0" AU.
      BEMÆRK: 1,0 AU fungerer bedst for 10 OD enheder i en 10 ml gradient. Hvis OD er ​​mindre end 10, "0,5" følsomhed kan anvendes til at forbedre signal.
    12. Tryk på knappen Auto Baseline og justere baseline indstilling til 10% mærke på diagramskriver den ved at dreje på optageren offset dial (valgfri, hvis du bruger digital recorder).
    13. Når en stabil basislinie er opnået, drejes pumpen kontakten til 'OFF' og Chart Speed ​​dial til 60 cm / time, hvis du bruger analog diagramskriver eller 'OFF', hvis du bruger digital optager.
    14. Gendan Chase Solution ved at skifte pumpen til 'REV 'position (hvis det er nødvendigt kan man øge flow tilbage til 6,0 ml / min ... BRUG IKKE RAPID), indtil den når det første mærke på piercing kanyle.
    15. Fjern centrifugerør og jage eventuelle luftbobler i kanylen ved at køre en lille smule af Chase Solution gennem det. Tør piercing scenen ren.
      BEMÆRK: Visse resterende vand kan sive fra strømmen celle.

5. Gradient Fraktionering og indsamling af prøver.

  1. Installer og gennembore centrifuge rør indeholdende saccharosegradienten.
  2. Placer elleve 2 ml mikrocentrifugerør i bakke positioner fraktionsopsamleren 1-11 sådan at hætterne ikke rager opad. Erstat '' rør # 1 '' for nu med en '' spild rør '' til at indsamle enhver væske tilbage i solfangeren slangen.
  3. Indstil pumpen drejeknappen til "Manual" og flow rate på sprøjtepumpen til "6,0 ml / min ' Tryk på 'Play' ikonet på fraktionsopsamleren. Så snart armen når det første rør, skal du trykke på 'pause' 'knappen' (dette vil placere armen og åbn fraktionen-dispenseringsventil).
  4. Start pumpen ved hjælp af '' kommandoen "frem" og overvåge diagramskriver pen. Når det begynder at afbøje opad (hvilket indikerer, at prøven passerer gennem flow-celle i spektrofotometer), hurtigt erstatte '' affald rør '' med '' rør # 1 '.
  5. Når den første dråbe opsamles, hurtigt skifte kommandoer til »remote start / stop", '' variabel (1,0 ml / min) '' og tryk på '' Play '' ikonet.
    BEMÆRK: Pumpen styres nu af fraktionsopsamler interface og 1 ml fraktioner vil blive indsamlet hver min.
  6. Fra dette punkt, vil A260 aflæsninger vises på den digitale optager interface (eller den analoge diagram Recorder). Sørg for, at '' Record '' trykker på knappen på software!
  7. Efter den blå Chase Solution ind i indsamling rør eller den sidste rør (normalt rør 11), skal du trykke på 'Stop' ikonet.
    BEMÆRK: Uddelerventilen skal skifte til ventilen affald.
  8. Hold fraktioner på is, indtil alle gradienter er blevet fraktioneret. Ved afslutningen af ​​dagen fraktioner kan opbevares ved -80 ° C forud for protein eller RNA isolation. Hvis protein og RNA-analyse er nødvendig, opdeles hver fraktion i halvdelen (500 pi hver for protein og RNA-analyse).

6. Vask

BEMÆRK: (dette er et valgfrit trin kun skal udføres, hvis flere gradienter skal indsamles).

  1. Nedsænkes affald røret i Erlenmeyer-kolbe indeholdende ~ 50 ml ultrarent vand og vende pumpe anvendelse af en 6 ml / min strømningshastighed.
  2. Stop pumpen, når Chase Solution når det første mærke on piercing kanyle.
  3. Fjern centrifugeglas jage al luft ud af kanylen og rengør piercing scenen.
    BEMÆRK: Visse resterende vand kan sive fra strømmen celle.
  4. Gentag fraktioneringsproceduren begyndende med trin 5.1.

7. slutrengøring.

  1. Afbryde pumpen slangen fra bunden af ​​piercer og pumpe Chase Solution i et 50 ml centrifugerør ved hjælp af hurtige flow indstilling. Opbevar Chase Solution ved 4 ° C, da det kan genbruges.
  2. Tilslut pumpe rør til en 3-vejs rørsystem og lukke ventilen fører til sprøjten. Forbinde en slange til en 50 ml sprøjte fyldt med destilleret vand, og det andet rør til bunden af ​​piercer.
  3. Installer ultracentrifugerør anvendes til afblænding trin og passerer mindst 50 ml destilleret vand gennem spektrofotometer og indsamling rør (skift til indsamling menu på grænsefladen ved at klikke på '' Start / pause '' ikon).
  4. Fjern slange, sprøjte (brug unbrakonøgle til at fjerne skruerne) og alle andre flytbare komponenter og vask grundigt med varmt vand fra hanen og derefter skylles med ultrarent vand.
    BEMÆRK: Vær ekstra forsigtig, når stemplet, tønde, slanger vask og piercing kanyle.
    BEMÆRK: Håndter sprøjtecylinder glasset med omhu! Opbevar alle komponenter væk fra støv.
  5. Tør bunden af ​​flowcellen med et blødt væv, der er fugtet med destilleret vand. Tør fraktionsopsamleren bakken og alle andre områder, hvor saccharose kan være blevet spildt ned.

8. Isolering af RNA fra Saccharose Brøker.

  1. Forbered 50 pi proteinase K-opløsning for hver 1 ml af sucrosefraktion (37,5 pi 10% SDS, 7,5 pi 0,5 M EDTA, 1 pi Glycoblue, 4 pi 20 mg / ml proteinase K).
  2. I 2 ml fladbundet rør, inkuberes 1 ml sucrosefraktion med 50 pi proteinase K-opløsning ved 55 ° Ci 1 time (hvis du bruger pi fraktioner 500 justere lydstyrken af ​​proteinase K-opløsning i overensstemmelse hermed).
  3. Tilsættes et lige volumen af ​​phenol: chloroform: Isoamylalkohol (125: 24: 1, fortrinsvis surt (pH 4,5) for at minimere DNA-kontaminering) til saccharose fraktioner.
    BEMÆRK: Læg en ekstra 200 pi chloroform til fraktionerne 7-10, fordi de er tungere og faser kunne få omvendt.
    BEMÆRK: phenol / chloroform kan forårsage forbrændinger ved kontakt og indånding. Bær laboratoriekittel, sikkerhedsbriller, og bruge en fumehood.
  4. Vortex ~ 30 sek, og der centrifugeres ved maksimal hastighed i 5 minutter ved stuetemperatur.
  5. Fjern ~ 80-90% af vandig fase (ikke røre interfase som kunne indeholde genomisk DNA) og plads i nye rør.
  6. Tilsættes et lige volumen chloroform og gentag trin 8.4.
  7. Fjern vandige fase være omhyggelig med at undgå interfasen.
  8. Tilføj 01:10 volumen 3 M natriumacetat, pH 5,2 (alternativt 5 M ammoniumacetat kan anvendes).
  9. Tilføj 1,5 volumener kølet, absolute ethanol og vortex i 15 sek.
  10. Udfælde natten over ved -20 ° C (eller 1 time ved -80 ° C, hvis i en rush).
    BEMÆRK: Prøverne kan efterlades ved -20 ° C i længere tid, hvis det er nødvendigt.
  11. Centrifuge ved maksimal hastighed i 30 minutter ved 4 ° C.
  12. Vask pelleten med 1 ml afkølet RNase-free 70% ethanol.
  13. Lufttør pellet og resuspenderes i 20 pi RNase-frit vand.
  14. Kvantificere total RNA ved spektrofotometri for at sikre tilstrækkelig udbytte og renhed (baseret på A260 / 280-forhold) og fortsæt til standard RT-qPCR analyse 14 ved anvendelse af lige store volumener af hver fraktion og PCR-primere specifikke for mRNA (r) af interesse.

9. Isolering af proteiner fra Saccharose Brøker.

  1. Foruden RNA kan proteiner isoleres og identificeres i individuelle polysom ​​fraktioner samt. Brug en af mange fremragende protokoller tilgængelige for protein isolation, fx 18.

Representative Results

Vi har for nylig beskrevet en hidtil ukendt rolle for tumor suppressor PDCD4 som en selektiv translation inhibitor af IRES-huser mRNA'er koder apoptotiske inhibitorer XIAP og Bcl-xL 12. Polysom ​​profilering var en vigtig teknik til at demonstrere specifik inddragelse af PDCD4 i IRES-medieret translation. HEK293-celler blev transient transficeret at udtømme endogene niveauer af PDCD4 (figur 1A) og derefter underkastet Polysomprofiler profil analyse. Vi bemærkede, at mindske omfanget af PDCD4 ikke forringe den globale cellulære oversættelse, som bedømt af manglen på ændringer i polysom ​​profil, når sammenligner siCTRL og siPDCD4 behandlede celler (figur 1B). Tilsvarende polysom ​​distribution af ikke-IRES variant af XIAP 19 var uændret mellem behandlede og ubehandlede celler (figur 1c). I modsætning hertil polysom ​​fordeling af de to IRES-huser mRNA'er, XIAP og Bcl-xL blev væsentligt ændret. I fravær af PDCD4 fordelingen af disse to mRNA'er er flyttet ind i tunge ribopolysomes (figur 1D, E). Da dette ikke er ledsaget af ændringer i steady state-niveauer af XIAP og Bd-XL mRNA (figur 1F) Disse resultater viser forbedret oversættelse af XIAP og Bd-XL i celler med reducerede PDCD4 niveauer, som blev yderligere bekræftet ved Western blotting (figur 1G).

Figur 1
Figur 1:. Polysomprofiler profilering identificerer PDCD4 som selektiv inhibitor af XIAP og Bcl-xL oversættelse (A) HEK293-celler blev behandlet med PDCD4 siRNA eller kontrol (CTRL), ikke-målrettet siRNA, lyseret og underkastet Western blot-analyse med anti-PDCD4 og anti-nucleolin antistoffer til at kontrollere omfanget af PDCD4 knock-down. (B) PDCD4 blev slået ned som i (A) ogcellelysater blev underkastet Polysomprofiler profilering. Repræsentative polysom ​​profil vises i toppanelet; fordeling af XIAP ikke-IRES (C), er Bcl-xL (D), og XIAP IRES (E) mRNA'er øget i forhold til GAPDH vist som procent af samlet mRNA (% mRNA) i hver fraktion. (F) Steady -State mRNA-niveauer blev målt ved RT-qPCR i PDCD4 siRNA eller kontrol (CTRL) siRNA behandlede celler. (G) Lysaterne fra (A) blev også udsat for Western blot-analyse med anti-XIAP, anti-Bcl-XL, og anti-nucleolin antistoffer. (NB. Data præsenteret i figur 1, blev oprindeligt udgivet i 12) Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Discussion

Polysomalt profilering er en kraftfuld teknik, der giver mulighed for kvantificering af staten oversættelse af specifikke transkripter under forskellige behandlingsmetoder betingelser. Det er en meget enkel teknik i princippet, men det kræver flere trin for udførelse, hvoraf nogle er kritisk til fremstilling af gode polysom ​​profiler. Disse vigtige trin er: 1) ved hjælp af RNase-fri kemikalier og plastvarer, 2) at udarbejde gode saccharosegradienter (i vores erfaring 10-50% saccharosegradienter fungerer bedst for effektivt at løse 40 / 60S underenheder og mRNA'er med bundne ribosomer), og 3 ) ved hjælp af celler, der er eksponentielt voksende, og ikke mere end 80% sammenflydende for at fange de højeste satser for oversættelse. Dette sidstnævnte trin bør tages i betragtning, når de udfører lange celle behandlinger, såsom gen knockdown eller overekspression, således at mængden af ​​celler til pladen vil være en funktion af, hvor meget vil cellerne blive sammenflydende ved endepunktet.

I resultaterne PresenTed her, polysom ​​profil analysen var et vigtigt redskab til at vurdere PDCD4 rolle i oversættelsen regulering af IRES-huser mRNA'er XIAP og Bd-XL 12. Den kendsgerning, at vi ikke observere nogen ændring i den generelle Polysomprofiler upon PDCD4 knock-down (Figur 1B) tilladt os at konkludere, at PDCD4 ikke forringe den globale cellulære oversættelse under betingelserne for eksperimentet. Vi næste anvendes RT-qPCR analyse for at bestemme fordelingen af ​​XIAP og Bcl-xL mRNA'er i celler behandlet med PDCD4 eller kontrol siRNAs. qPCR er en metode til valg til analyse Polysomprofiler, i modsætning til standard RT-PCR eller Northern blotting, fordi det giver mulighed for en kvantitativ snarere end semi-kvantitativ analyse af mRNA distribution og til påvisning af subtile skift i translationseffektivitet mellem behandlingerne. Ved at bruge denne teknik, var vi i stand til at vise, at fordelingen af ​​XIAP og Bd-XL-mRNA'er (udtrykt som en procent af den samlede mål-mRNA på tværs af gradient) var signifikant forskudt i tunge polyribosomer (mRNA'er med et stort antal af ribosomer associeret med dem) efter PDCD4 knock-down (figur 1D, E), hvilket indikerer en stigning i oversættelse af disse mRNA'er. Dette blev yderligere bekræftet ved en stigning i XIAP og Bcl-xL protein niveauer, men ikke i deres steady state RNA niveauer (figur 1F, G). Vigtigere er det, polysom ​​fordeling af de ikke-IRES variant af XIAP var uændret mellem behandlede og ubehandlede celler (figur 1C). Alternativt kunne translationseffektivitet præsenteres i forhold til mRNA-indholdet i polysomer (sædvanligvis fraktioner 5 til 10) versus monosomer (sædvanligvis fraktioner 2 til 4) 14.

Brugen af ​​kontrollen i hele protokollen er vigtigt at validere enhver polysom ​​profilering resultat, som toppe observeres fra absorbanslæsninger ved 254 nm kan ikke på egen hånd kan henføres til ribosom RNA (detergents, såsom Triton X-100 kraftigt absorberer i dette område af spektret og kan tilsløre 40 / 60S toppe ved toppen af ​​gradienten). Blanke gradienter uden lysat og / eller med lysat buffer skal køre for at bestemme den relative bidrag af bufferne til absorbansen ved 254 nm. Kulturgenstandsspor strukturer af højere orden kan også føre til fejlagtige fortolkninger af polysomer, hvor der er i virkeligheden ingen (fx "pseudo-polysomer" 20). Udskille magnesium (bruges hele proceduren at stabilisere 80S ribosomer) med den divalente kation chelator EDTA tilsat til lysaterne og gradient buffer (20 mM i 15 min) vil forårsage adskillelse af ribosomet i dets lille (40S) og store (60S ) subunits. Således, hvis absorbanstoppe registreret ved 260 nm er faktisk polysomer, vil EDTA-behandling kollapse profil, således at en enkelt maksimumsværdi vil blive observeret nær toppen af ​​gradienten, der svarer til frigøre mRNA og ribosomale enheder (data ikke vist). Sammenfaldendemed EDTA-induceret kollaps af profilen, bør alle de specifikke mål analyseret af qPCR nu findes på toppen af ​​gradienten.

Antallet af ribosomer associeret med en mRNA er ikke altid en indikator for, hvor effektivt at især mRNA oversættes. Der er faktisk specifikke sammenhænge, ​​hvor aktiv oversættelse på polysomer bliver fastkørte 21,22 som læseren bør være opmærksom på. At afgøre, om eller ikke afskrifter deltager aktivt med oversættelsen maskiner kan ske ved a) behandling af prøven med puromycin, som i modsætning til EDTA, årsager "run-off 'af ribosomer, der aktivt translokation på tværs af en mRNA, eller b) behandling af prøven med homoharringtonin som hæmmer translokation af kun den første ribosom ved startkodonet, igen forårsager 'run-off' af eventuelle efterfølgende translokerende ribosomer.

Brugen af ​​kontrol- transskriptioner for qPCR analyse er også kritisk. Udvælgelsesprocessention af udskrifter, der ikke er påvirket af forskellige behandlingsmetoder betingelser såsom nogle husholdning gener (GAPDH actin, tubulin, Nucleolin), ribosomale mRNA (18S, RPL13A), eller i dette tilfælde ikke-IRES variant af XIAP IRES, er vigtigt i kontrollere, om behandlingen har effekt på oversættelse er specifik eller generaliseret. Disse kontrol-transkripter kan anvendes til at normalisere fordelingen af ​​de analyserede mRNA'er blev gjort her (XIAP og Bcl-xL-mRNA'er blev normaliseret til GAPDH mRNA og udtrykt som en procentdel af det samlede mRNA indhold, repræsenteret ved summen af ​​mRNA-indholdet i hver fraktion ), eller alternativt kan mål- og kontrol mRNA udtrykkes som absolutte værdier, og vises separat. qPCR analysen af ​​input lysaterne (normalt 10% af den samlede mængde) er endnu et skridt, der vil kontrollere for distribution af specifikke mRNA'er. Ideelt set bør indholdet af en specifik transkript i input lysat mRNA være sammenlignelig med summen af ​​mRNA-indholdet i alle 10 fraktioner analyseres. Endelig, Et valgfrit trin til at kontrollere for phenol: chloroform-ekstraktion trin er at spike hver polysom ​​fraktion med et in vitro transkriberet reporter mRNA (såsom CAT, chloramphenicolacetyltransferase) til at efterfølgende vil blive kvantificeret ved qPCR og kan endda bruges normalisere data 14.

Som med enhver teknik, den polysom ​​profilering præsenterer nogle begrænsninger. Den omstændighed, at regel minimum 10 fraktioner (mere subtile forskydninger i translationseffektiviteten kan kræve 20 eller flere) skal indsamles for at have nice polysom ​​distributioner gør dette trin begrænsende, i den forstand, at kun maksimalt 4 prøver kan være analyseret på et tidspunkt at være i stand til komfortabelt håndtere RNA ekstraktion og qPCR analyse af 40 prøver og 4 input kontrol på én gang. Stikprøvens størrelse kan nemt tilføje op med, hvor mange udskrifter, der skal analyseres, og hvor mange qPCR replikerer at gøre, og det kan være dyrt. En anden begrænsning af qPCR-baserede polysomalt profilering enNALYSE er, at det kun kan gøres på en kandidat-tilgang (hvor udskrifter, der skal analyseres, er kendt på forhånd), og kan ikke anvendes til genom-dækkende analyse af oversættelsen. I begyndelsen af det 21. århundrede, begyndte imidlertid efterforskerne at afhøre deres polysomalt RNA på et genomisk niveau ved hjælp af DNA mikroarrays 15 og senest med næste generation sekventering 16,17. I denne kraftfulde tilgang er polysomalt profilering udføres som beskrevet i denne protokol, bortset fra at i stedet for at udføre qPCR analyse af de enkelte fraktioner, monosomer fraktioner (normalt fraktion 2-4) og polysomer fraktioner (normalt fraktioner) samles sammen og variationer i den globale oversættelse analyseret ved DNA microarray eller hel-genom-RNA-sekventering. Derfor med denne tilgang, er det muligt at vurdere alle mRNA'eme hvis fordeling skift fra polysomer til monosomer (fald i oversættelse) eller omvendt (stigning i oversættelse) efter en specifik behandlingling. Validering og kvantificering af specifikke mRNA-polysomer fordeling kan derefter ske ved qPCR. En endnu mere kraftfuld brug af polysomalt profilering princip er ribosom profilering. Yderligere high throughput udvidelse af denne teknik blev for nylig rapporteret, som muliggør samtidig overvågning af hundredvis af polysom ​​fraktioner 23. Dette giver en klar fordel, når sondering translationelle effektivitetsgevinster af mutant samlinger eller i en storstilet RNAi skærme. Ribosom profilering er en teknik, der drager fordel af næste generation sequencing til kort RNA-fragmenter beskyttet af ribosomer (ribosom fodspor) udøvet proteinsyntese 24,25. Ved denne teknik kan ribosom translokation inhiberes med cycloheximid (reversible) eller emetin (irreversibel) efterfulgt af cellelysis og RNase-spaltning til opnåelse af en population af ribosom fodspor. Ribosomer er beriget, total RNA isoleres, og forurener ribosomal og mitokondrie ribosomale RNA er fjernet.RNA-fodspor på ca. 26-28 nukleotider er isoleret, reverstranskriberes, omdannes til et cDNA-bibliotek og sekventeret 26. I modsætning til standard polysom ​​profilering, denne tilgang ikke kun identificerer bestemte mRNA'er der er translationelt regulerede men giver også mRNA-specifikke oplysninger i codon opløsning såsom den nøjagtige besættelse og tæthed af ribosomer langs en specifik udskrift. Dette er især af interesse for mRNA'er med specifikke former for oversættelse, såsom IRES-huser mRNA, da det kan give flere oplysninger om, hvor på afskrift ribosom-rekruttering forekommer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gradient Master 108 automated gradient maker BIOCOMP 107-201M
Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker LABCONCO 4517000
Beckman Ultracentrifuge  Beckman Coulter Model # L-100-XP
Density gradient fractionator TELEDYNE ISCO 69-3873-246 Composed of: tube piercing system,  peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector
WinDaq data acquisition software DATAQ INSTRUMENTS WINDAQ/LITE http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm
Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm) Beckman Coulter 331372
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) DiaMed PRE1900-N
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) SafeSeal 12000
Sucrose (nucleases-free) Calbiochem 573113 MW = 342.3 g/mol
Cycloheximide SIGMA C7698 MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.
Sodium chloride (nucleases-free) OmniPur 7710 MW = 58.44 g/mol
MgCl2.6H2O (nucleases-free) OmniPur 5980 MW = 203.3 g/mol
Tris Base (nucleases-free) J.T. Baker 4109-01 MW = 121.14 g/mol
Triton X-100 OmniPur 9400 Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2515
RNaseZap Rnase inactivation solution Ambion, Life Technologies AM9780
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) Invitrogen, Life Technologies AM9516
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Ambion, Life Technologies AM9722 Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  3. Tscherne, J. S., Pestka, S. Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells. Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).
  4. Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR. Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).
  5. Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
  6. McKinney, C., et al. Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication. Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).
  7. Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast. Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).
  8. Gross, J. D., et al. Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E. Cell. 115 (6), 739-750 (2003).
  9. Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response. Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).
  10. Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate. Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).
  11. Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
  12. Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
  13. Occhi, G., et al. A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype. PLoS Genet. 9 (3), (2013).
  14. Faye, M. D., et al. Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon. Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).
  15. Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).
  16. Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biol. 14 (11), (2013).
  17. Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).
  18. Corbin, F., et al. The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes. Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).
  19. Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress. Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).
  20. Thermann, R., Hentze, M. W. Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation. Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).
  21. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  22. Graber, T. E., et al. Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).
  23. Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. High-throughput polyribosome fractionation. Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).
  24. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  25. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
  26. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).

Tags

Cellular Biology cellulær stress translationsinitiering internt ribosomindgangssted polysom RT-qPCR gradient
Vurdering af selektiv mRNA Translation i pattedyrceller polysom ​​Profilering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik,… More

Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. J. Vis. Exp. (92), e52295, doi:10.3791/52295 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter