Abstract
단백질 합성의 규정은 스트레스에 대한 세포 반응의 핵심 제어 지점을 나타냅니다. 특히 신중한 RNA 조절 요소는 전형적 특정 스트레스 반응에 필요한 단백질 인코딩 특정 mRNA를, 선택적으로 번역 할 수 있도록 도시 하였다. 이들의 mRNA뿐만 아니라 선택적 번역에 대한 책임을 규제 메커니즘의 특성의 확인은 시간에 대한 분자 생물학의 최전선에있다. Polysome 프로파일 링은이 연구의 초석 방법이다. polysome 프로파일의 목적은 서로 다른 사체에 적극적 번역 변이를 고정화함으로써 mRNA의 번역을 캡처하고, 따라서 높은 번역 사체 저조한 번역들 사이의 구별을 허용 자당 구배 초 원심 분리에 의해 얻어진 polyribosomes를 분리하는 것. 이것들은 추가의 전통적인 생화학 및 분자 생물학 방법을 특징으로 할 수있다. 중요한 것은, 결합 P높은 처리량 게놈 접근 방식과 olysome 프로파일 링은 번역 규제의 대규모 분석을 할 수 있습니다.
Introduction
단백질 합성 (번역)의 규정은 밀접하게 세포의 생존에 연결된 키 세포 과정이다. 번역은 세포의 에너지의 50 % 이상을 소비하는 감안할 때, 그것은 번역이 밀접하게 규제되어 있고 번역의 동요가 잘 용납하지 않는 것은 놀라운 일이 아니다. 반대로, 많은 비정상적인 세포 과정은 번역 기계 및 변환 출력 (즉, 프로테옴)을 수정해야 할 것을 요구하고 있습니다. 이것은 종종 다양한 스트레스 반응 및 질병 상태에있는 경우, 그리고 아마도 가장 좋은 암을들 수있다. 병진 제어의 주요 이점은 빠르게 다양한 내부 및 외부 트리거에 응답하여 단백질 출력을 재 프로그래밍하는 세포의 능력하여 미세 조정기구 인 것을 조언 세포 생존 및 사망 한 간의 균형.
번역 제어의 두 가지 측면이 특히 재미있다; 규제 MEC의 본질에 대한 이해처음에 선택적 번역을 유발하는 특정 트리거에 대한 세포 반응에 참여 hanism (들) 및 제어 특정 번역을 허용 요소, 특정의 mRNA의 식별과 단백질 제품. Polysome 프로파일 링은 두 프로세스의 효과적인 학습을 할 수있는 기술이다.
polysome 프로파일 링 기술의 전반적인 목표는 공부하고 다른 세포 조건에서 특정의 mRNA의 번역 상태를 정량화하는 것입니다. 기술의 원리에 따라서, 수 크로스 구배에서 초 원심 분리에 의해 얻어진 polyribosomes를 '동결'다른 사체에 적극적 번역 리보솜과 분리 '(몇 리보솜에 의해 결합) 높은 변환 전 사체 사이의 구별을 허용함으로써 mRNA의 번역을 캡처하는 것 가난 (하나 또는 두 개의 리보솜에 의해 구속) 사람들을 번역했다. 이 특정 프로토콜에서, 항생제 사이클로 헥시 미드는 결합이60S 리보솜 아 단위 및 블록 리보솜 E 사이트 2에서 탈 아세틸 화의 tRNA의 출시는, 리보솜 전좌를 억제하고 번역의 mRNA에 리보솜 실속하는 데 사용됩니다. 그러나, 블록 변환 신도 3, 사용될 수있다 emetine 다른 차단제.
웨스턴 블 롯팅 및 번역 처리의 최종 출력을 측정 35 S-메티오닌 표지 기술과는 달리, 따라서 다른 조건 하에서 번역 메커니즘의보다 상세한 연구를 허용 프로파일 적극적 번역의 mRNA와 리보솜 연계를 측정하는 장점을 갖는다 polysome. 따라서,이 기술을 쉽게 구체적 번역 4-6의 다양한 모드를 연구하기에 적합 할 수있는, 단백질 인자 번역 조절 7-9, 단백질 합성 1,10,11 또는 상류 IRES 또는 mRNA의 구조의 효과에 영향을 미치는 스트레스 조건에 관여 단백질 신디사이저에 개방 판독 프레임ESIS 12-14. 요즘, polysome 프로파일 응용 프로그램도 넓은 polysomes 관련의 mRNA를 분석 할 수있는 DNA 마이크로 어레이 (15) 또는 차세대 시퀀싱 16, 17의 사용에 있습니다.
Protocol
참고 : 참고를 RNA 작업에 : RNases에 의해 RNA 저하를 방지하기 위해 표준과 같은 예방 조치를 취하십시오. 프로토콜의 모든 단계에서 장갑, 장벽 피펫 팁의 RNase없는 plasticware에 화학 물질을 사용합니다. 모든 솔루션을위한 초순수 또는 DEPC 처리 된 물을 사용하십시오. 제조 업체의 프로토콜 다음의 RNase 비활성화 솔루션으로 의심되는 표면의 오염을 제거.
솔루션 1. 준비.
- 염기성 용액 500 ml를 준비한다. (0.3 M의 NaCl, 15mM의의 MgCl 2 6H 2 O 15 mM 트리스 -HCl, pH 7.4). 솔루션이 깨끗해질 때까지 교반 막대를 사용하여 혼합하고 0.45 μm의 필터를 통과. 실온에서 보관하십시오.
- 다음과 같이 10 및 50 % 자당 솔루션 및 60 % 체이스 솔루션을 준비 :
- 10 % 자당 솔루션, (V / W) 50 ㎖ 원심 분리 관에 5g의 크로스를 추가하고 기본 솔루션으로 50ml로 채운다. 50 ㎖ 원심 분리 튜브 광고 중 50 % 수 크로스 용액 (/ w v)의 내용D 25g 자당과 염기성 용액에 50ml로 채운다.
- 60 % (W / V) 추적 솔루션, 50ml의 원심 분리 관에 30g의 설탕을 추가하고 기본 솔루션으로 50ml로 채운다. 포화 브롬 페놀 블루 용액 100 μl를 추가 (용해되지 더 때까지 물에 브로 모 페놀 블루를 추가, 원심 분리기가 용해되지 않은 분말 펠렛) 60 % 추적 솔루션을. 소용돌이를 사용하여 혼합하고 완전한 용해를 확인합니다.
- 4 ° C에서 보관 솔루션은 필요할 때까지.
- RNA 용해 버퍼를 준비합니다. 실험 당일 신선한 버퍼를 준비합니다. 각 샘플에 대해 RNA 용해 버퍼의 500 μl를 준비합니다. 1 염기성 용액의 ㎖를 추가 10 μL 트리톤 X-100 (1 % [의 V / V] 최종), 100 ㎎ / ㎖ 사이클로 헥시 미드 DMSO에 (CHX, 0.1 ㎎ / mL 최종) 3.5 μL의 RNasin 1 μL (140 U / ㎖). 소용돌이를 사용하여 섞는다. 얼음에 보관하십시오.
참고 : 사이클로 헥시 미드 높은 독성과 돌연변이의 원인이 될 수 있습니다. 피부 접촉과 흡입을 피할 것. 너무 자주 분말 형태로 처리를 방지하기 위해, 준비DMSO, 나누어지는 100 ㎎ / ㎖ 주식의 더 큰 수량은 장기 저장을 위해 -80 ° C에 보관하십시오. -20 ° C에서 주식을 계속 작업. - 실험 날, 원하는 10 %의 체적 50 % 수 크로스 용액 (구배 당 각 용액 ~ 7 ㎖)에 CHX (0.1 ㎎ / ㎖의 최종 농도)을 첨가하여 자당 + CHX 솔루션을 준비.
자동 그라데이션 메이커를 사용하여 자당 기울기 2. 준비
- 그라데이션 메이커 ''ON ''를 켜고 그라디언트 보유 할 판 레벨 (criticalstep!)를 클릭한다 ''완료 ''판은 수평됩니다.
- 메뉴에서 그라데이션 프로그램을 선택 실행합니다 :
- 를 눌러 ''GRAD ''메뉴 ''LIST ''를 선택합니다.
- "SW41"를 선택합니다.
- 목록을 스크롤하고 선택을 눌러의 '프로그램''10 - 11 단계 - 50 %의 기울기를 ''런 (RUN)'버튼을 보내고.
- 마커 블록에 원추형 초원 심 분리기 튜브 (SW-41 관, 14 X 89mm)를 놓고 마커 블록의 상위 단계를 따라 튜브에 표시를 추적하기 위해 제공 미세 튜브 마커를 사용합니다. 안정된 표면에 피팅 랙에 튜브를 놓습니다.
참고 :이 표시는 10, 50 % 자당 솔루션을 레이어드 충전 가이드가 될 것입니다. - 2 개의 10 ml의 주사기에 제공된 두 개의 정맥을 연결하고 RNA 분해 효소 불 활성화 솔루션을 포함하는 따뜻한 증류수와 피펫 팅에 의해 아래로 씻는다. 이후 물의 모든 흔적을 제거해야합니다.
- 10 % 자당 +의 CHX와 주사기 중 하나를 입력하고 초원 심 분리기 튜브의 바닥에 캐 뉼러를 삽입합니다. 그냥 튜브에 만든 마크 과거가 될 때까지 조심스럽게 10 % 자당 솔루션을 분배.
참고 : 거품을 피합니다. 거품이 형성되면, 조심스럽게 그들을 대체하기 위해 튜브를 누릅니다. - 50 % 자당 + CHX와 다른 주사기를 끄기, 여분의 액체를 닦아초원 심 분리기 튜브의 하단에 삽입 부드럽게 닦아 정맥으로. 정확히 마크에 도달 할 때까지 조심스럽게 50 % 자당 솔루션을 분배. 신속하고 원활하게 정맥을 제거합니다.
참고 : 10 % 자당이 튜브에 상승 상단에 메 니스 커스 (meniscus)를 형성한다. 그렇지 않은 경우, 표면에서보다 10 % 수 크로스 용액을 첨가. - 약간 초원 심 분리기 튜브를 기울 모든 공기 방울을 변위에 의해 제공된 캡을 삽입합니다. 마이크로 피펫과 캡의 저수지에서 물기를 제거합니다.
- 그라데이션 메이커 접시에 튜브 벽과 장소에 따라 물기를 닦아주십시오.
- '런 (RUN)'버튼을 누릅니다.
참고 : 플레이트는 그라데이션이 시작 형성하기 위해 5 초와 회전에 대한 일시 정지, 지정된 각도로 기울일 것입니다. - 그라데이션 형성 (약 2 분, 기계가 비프 음)이 완료되면, 부드럽게 랙에 초 원심 분리기 (들), 장소를 제거하고 신속하게 gradie을 방해하지 않도록 상향 이동에 캡을 제거NT.
- 얼음에 그라데이션 (들)을 유지합니다. 방해하지 마! 또한, 그라디언트는 4 ℃에서 하룻밤 유지.
- 또는 다음과 같이 그라디언트를 만들기 위해 두 개의 챔버 그라데이션 메이커를 사용 :
- RNA 분해 효소 불 활성화 솔루션과의 RNase 무료 물로 씻어 튜브 및 그라데이션 메이커.
- 그라데이션 메이커의 근위 실에 50 % 자당 + CHX 5 mL를 추가하고 두 개의 챔버 사이에 공기가 제거되어 있는지 확인합니다.
- 그라데이션 업체의 말단 챔버에 10 % 자당 + CHX의 5 ML을 추가합니다.
- 튜브 홀더에 원추형 원심 분리기 튜브의 바닥 (SW-41 관, 14 X 89mm)과 장소에 50 % 자당 + CHX의 0.5 ML을 추가합니다.
- "3"(약 1 ㎖ / 분)으로 설정 속도로 인접 실에 배치 교반기, 오픈 스톱 (Stop) - 자지 및 예금 그라데이션을 켭니다.
- 얼음에 장소 구배 (들). 방해하지 마십시오.
참고 : 그라디언트는 4 ℃에서 하룻밤 유지 될 수있다.
3. 세포 용해 및 초 원심.
- 4 ℃에 SW-41 로터와 4 ° C에서 버킷 설정 원심 분리기를 놓습니다.
- 최소 24 시간 이전에 용해에 성장 미디어에서 적절한 세포 밀도에서 플레이트 세포.
- 0.1 ㎎ / ㎖의 CHX을 함유하는 성장 배지의 분취 량 (150mm 플레이트 당 20 ml)로 준비한다.
- 체포 polysomes을 안정시키기 위해 37 ° C / 5 % CO 2에서 3 분 (150mm 플레이트 당 20 ㎖) CHX + 미디어의 세포를 품어.
- 얼음 접시, 장소 플레이트에서 빠르게 대기음 미디어 작업과 10 ml의 얼음 차가운 인산 완충 식염수로 한 번 세포를 씻으 (PBS는 137 mM의 NaCl을 2.7 mM의 KCl을 10 mM의 나 2 HPO 4, 1.8 mM의 KH 2 PO 4) 보충 SID 아래로 천천히 피펫 CHX (0.1 ㎎ / ㎖의 최종 농도) 조심와접시 벽의 E는 세포 단일 층의 리프팅을 최소화합니다.
- 기음 PBS 각 플레이트에 추가로 10 ml의 PBS + CHX 추가는 셀 리프터 세포를 긁어 얼음에 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 두 플레이트에서 총 부피를 전송. 다운 스트림 단백질 분석을위한 얼음에 미세 원심 튜브에 세포 현탁액 1 ㎖를 보관하십시오.
- 원심 분리기 10 분 동안 4 ° C에서 300 XG에 세포의 50 ML 튜브.
- 차가운 얼음 RNA 용해 버퍼 500 μL의 모든 PBS 및 재현 탁 펠렛을 제거합니다.
- 2 ml의 마이크로 원심 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
- 피펫 위를 Lyse 세포에 아래로 가끔 소용돌이로 교반과 함께 10 분 동안 얼음에 품어.
- 5 분 핵 펠렛 4 ° C에서 2,000 XG에 원심 분리기.
- 새로운 2 ㎖의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다.
- 5 분 동안 4 ° C에서 17,000 XG에 원심 분리기 세포 파편을 펠렛.
- 새로운 2 ㎖의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송하고 측정하기 위해 2 μL를 사용260 nm에서 광학 밀도 (빈 사용 용해 버퍼).
- 총 RNA의 분석을 위해 각 샘플에서 50 μL (전체의 10 %)를 제거합니다. 필요할 때까지 해물이 -80 ° C에 저장 될 수 있습니다.
- (; 필요한 경우 추가 용해 버퍼에 집중 해물을 희석. 500 μL의 최대 볼륨, OD (25) 최적의 분 10 OD)을 조심스럽게 각각 자당 그라디언트에 동일한 A260 단위를로드합니다.
- 확인 그라디언트 서로 이전에 초 원심 0.1 g에 있습니다.
- 4 ℃에서 1.5 시간 동안 39,000 RPM (260,343 XG)에서 원심 분리기 그라디언트를 사용합니다.
- 스핀 다운시에 로터 브레이크를 유지하고 1000 RPM에 도달 할 때 감속하는 동안 전원을 끄십시오.
참고 :이 단계는 브러시 헤드는 제동시 로터에 문의로 가속의 급격한 변화로 인한 그라디언트의 방해를 최소화 할 수 있습니다.
NOTE : 세포 용해 과정이 두 개의 150mm의 subconfluent (~ 70-80% 합류) 경사 당 HEK293 세포 플레이트에 최적화되고 사용 볼륨이 상이한 세포주에 대해 조정될 필요가있다.
4. 그라데이션 분별 시스템 장비 셋업.
- 설정 악기와 빈들다음과 같이 물을 pectrophotometer :
- 구성 요소의 전원을 켜고 램프가 워밍업하기 위해 적어도 15 분 동안 할 수 있습니다.
- 확인 부분 수집기는 'polysome'방법으로 설정 (2 회를 눌러 폴더 아이콘, 반환은 홈 화면으로 돌아가 두 번 화살표).
- 소수 컬렉터에 밸브를 확인하는 (휴지통 아이콘을 가리키는 화살표)를 낭비하도록 설정되어 있습니다. 폐기물 수집 관에서 증류수가 들어있는 250ml의 삼각 플라스크를 놓습니다.
- 차트 레코더에서 다음 설정을 선택합니다 설정 감도는 'SET 램프와 광학'에 전화; '1.5'에 노이즈 필터 스위치를 설정; 'OFF'로 피크 분리 다이얼을 설정; '30의 CM / 시간 '에 (5cm / 10 분) 차트 단축 다이얼을 설정; 기준은 '최대 오픈'에 (분광 장치의 상단에) 다이얼을 조정 설정합니다.
참고 : 선택 사항 : 디지털 레코더 소프트웨어 대신 차트 레코더 사용할 수 있습니다. 컴퓨터에서 '시작'을 클릭합니다. 인수 창이 열립니다 : 일에서E 옵션 메뉴의 선택을 해제 일시 정지 그래픽. 스케일링에서 (실행 중에 온 - 더 - 플라이 변경 될 수 있습니다) -10과 100 그래프의 한계를 설정합니다. 새 파일을 생성하고 실행을 기록하기 위해 저장 버튼을 클릭합니다. - 펌프에 주사기 배럴을 놓고 장소 (사용 제공된 나사와 육각 렌치)로 조입니다.
참고 : 너무 세게 조이지 마십시오. - RAPID 속도로 ''REV ''명령을 사용하여 추적 솔루션과 주사기를 입력합니다. 수직 위치에 펌프를 놓고 'FORWARD' '명령을 사용하여 튜브를 통해 공기를 쫓아. 단이 기능 및 세척을 위해 RAPID를 사용합니다.
- 의 RNA 분해 효소가없는 물을 가득 초원 심 분리기 튜브를 설치합니다.
- 피어스는 두 개의 검은 색 마크까지 캐 뉼러와 초원 심 분리기 튜브 볼 수 있습니다 (분배 구멍이 두 표시 사이 위치) 및 6.0 ml / 분에서 '' '매뉴얼'에 주사기 펌프를 시작합니다.
- 물 (C 때 플로우 셀을 통과 할하세 솔루션은 변수에) 스위치 속도를 튜브의 1/3을 채우고 1.0 ml / 분으로 설정.
- 1.0 ㎖ / 분의 유속에서, 차트의 전압이 제로 (+/- 0.5 단위)에 도달하기까지, 기준선 분광 광도계에 다이얼을 조정 조정.
주 : 삼각 플라스크에 폐기물 관에서 물 출구를 관찰합니다. - '0.5'또는 '1.0'AU에 원하는 감도를 설정합니다.
참고 : 1.0 AU는 10 ml의 구배 10 OD 단위에 가장 적합합니다. OD가 10 미만이면, '0.5'신호 감도를 향상시키기 위해 사용될 수있다. - 자동베이스 라인 버튼을 누르고 (디지털 레코더를 사용하는 경우 선택 사양) 레코더 오프셋 다이얼을 돌려 차트 레코더의 10 % 표시로 설정 기준을 조정합니다.
- 안정적인 바탕이 달성되면 디지털 레코더를 사용하는 경우 아날로그 차트 레코더 또는 'OFF'를 사용하는 경우, 60cm / 시간에 'OFF'와 차트 단축 다이얼 펌프의 스위치를 켭니다.
- RE '에 펌프를 전환하여 추적 솔루션을 복구이 관통 정맥의 첫 번째 마크에 도달 할 때까지 (하나는 RAPID를 사용하지 마십시오 ... 다시 6.0 ml / 분으로 유량을 증가시킬 수 있습니다 필요한 경우) V '위치.
- 원심 분리기 튜브를 제거하고 그것을 통해 추적 솔루션의 약간을 실행하여 정맥 내 공기 방울을 쫓아. 피어싱 단계를 깨끗하게 닦습니다.
참고 : 일부 잔류 물이 흐름 세포에서 누수 될 수 있습니다.
5. 그라데이션 분별과 샘플 컬렉션입니다.
- 설치 및 자당 구배를 포함하는 원심 분리 튜브를 관통.
- 캡이 위쪽으로 돌출하지 않도록 소수 컬렉터 트레이 위치 1-11 열한 2 ml의 마이크로 원심 튜브를 놓습니다. 컬렉터 튜브에 남아있는 액체를 수집하기 위해 '폐기물 관' '와 지금' '튜브 # 1' '교체합니다.
- '매뉴얼'을 펌프 제어 다이얼을 설정하고 '6.0 ml / 분'에 주사기 펌프 유량 소수 컬렉터의 '재생'아이콘을 누릅니다. 즉시 팔 첫 번째 튜브에 도달로, ''일시 정지 '버튼을 누르면 (이 팔의 위치와 분수 - 분배 밸브를 엽니 다).
- ''FORWARD ''명령을 사용하여 펌프를 시작하고 차트 레코더 펜을 모니터링 할 수 있습니다. 이 위쪽으로 편향 시작되면 빠르게 '와'폐 튜브 '' ''튜브 # 1 ''교체 (즉 샘플을 분광 광도계의 플로우 셀을 통과 나타냄).
- 첫 번째 드롭가 수집되면, 신속하게 '원격 시작 / 정지', ''변수 (1.0 ml / 분) ''를 눌러 '재생'아이콘에 명령을 전환합니다.
참고 : 펌프가 이제 소수 컬렉터 인터페이스에 의해 제어되며, 1 ml의 분수는 모든 분을 수집됩니다. - 이 시점에서, A260 수치는 디지털 레코더 인터페이스 (또는 아날로그 차트 recorde에 나타납니다R). ''기록 ''소프트웨어에 버튼을 누르면을 확인하십시오!
- 블루 체이스 솔루션은 수집 관 또는 마지막 튜브 (일반적으로 튜브 11)을 입력 한 후, '중지'아이콘을 누릅니다.
주 : 분배 밸브 폐기물 밸브로 전환해야합니다. - 모든 그라데이션이 분별 될 때까지 얼음 분수를 유지합니다. 일 분획 끝에 종래 단백질 또는 RNA 분리 -80 ° C에서 저장 될 수있다. 단백질과 RNA 분석이 필요한 경우, 반 각 분획 (단백질 및 RNA 분석을 500 ㎕의 각)을 분할.
6. 세척
주 : (다수 그라데이션 수집 할있을 경우에만 수행 될 수있는 선택적인 단계 임).
- ~ 함유하는 삼각 플라스크에 초순수 50 ㎖를 폐 튜브 잠수함과 6 ml / 분의 유속을 사용하여 펌프를 역방향.
- 체이스 용액이 제 1 마크 오 도달 할 때 펌프를 중지N 관통 정맥.
- , 원심 분리기 튜브를 제거 캐 뉼러에서 모든 공기를 쫓아 피어싱 단계를 청소합니다.
참고 : 일부 잔류 물이 흐름 세포에서 누수 될 수 있습니다. - 단계 5.1에서 시작하여 분류 절차를 반복합니다.
7. 최종 청소까지.
- 침의 바닥에서 펌프 호스를 분리하고 빠른 흐름 설정을 사용하여 50 ml의 원심 분리기 튜브에 추적 솔루션을 펌프. 다시 사용할 수있는 4 ° C에서 추적 솔루션을 저장합니다.
- 3 방법 튜브 시스템에 펌프 튜브를 연결하고 주사기로 이어지는 밸브를 닫습니다. 증류수와 침의베이스에 다른 튜브로 가득 50 ML의 주사기 하나의 튜브를 연결합니다.
- 블랭킹 공정에 사용되는 초 원심 튜브를 설치하고 '스타 클릭 인터페이스에서 수집 메뉴 분광 광도계와 포집 관 (스위치를 통해 증류수 적어도 50 ㎖ 합격T / 일시 정지 아이콘 ( '')).
- 다른 모든 이동식 구성 요소 (나사를 제거하는 데 사용하는 육각 렌치) 따뜻한 수돗물을 사용하여 철저하게 세척 한 후 초순수로 씻어 튜브, 주사기를 제거합니다.
참고 : 플런저, 배럴, 튜브의 세척 및 정맥을 관통 할 때 특별한주의하십시오.
참고 :주의 유리 주사기 배럴을 처리! 멀리 먼지의 모든 구성 요소를 저장합니다. - 증류수에 적신 부드러운 티슈로 흐름 셀의 바닥을 닦습니다. 소수 컬렉터 트레이와 크로스가 유출되었을 수있는 다른 영역을 닦습니다.
자당 분수에서 RNA 8. 분리.
- (37.5 μL 10 % SDS, 7.5 μL의 0.5 M EDTA, 1 μL Glycoblue, 20 mg을 4 μL / ㎖ 프로 테 K) 자당 부분의 모든 1 ml를위한 프로 테 K 솔루션의 50 μl를 준비합니다.
- 2ml의 평바닥 튜브에서 55 ° C에서 1 ml의 프로 테이나 제 K를 용액 50㎕의 자당 분획을 부화1 시간 동안 (있는 경우 500 μL 분획 따라 테 K 용액의 양을 조정하여).
- 클로로포름 : 페놀 동량 추가 이소 아밀 알코올 분획에 자당 (125 : 24 일, 바람직하게는 산성 (pH를 4.5) DNA의 오염을 최소화하기 위해).
주 :이 무거워 단계가 반전 얻을 수 있기 때문에 분수 7-10 클로로포름의 추가 200 μl를 추가합니다.
주 : 페놀 / 클로로포름 접촉 및 흡입에 화상을 입을 수 있습니다. 실험실 코트, 안전 고글을 착용하고, fumehood를 사용합니다. - 실온에서 5 분 동안 최대 속도에서 소용돌이 ~ 30 초간 원심 분리한다.
- ~ 수상 80 ~ 90 %가 제거 새로운 튜브 및 장소 (게놈 DNA를 포함 할 수있는 계면 만지지 마십시오).
- 클로로포름 단계를 반복 8.4의 동일한 볼륨을 추가합니다.
- 간기 않도록주의하면서 수상을 제거합니다.
- 3 M 아세트산 나트륨 1:10 부피, pH가 5.2를 추가 (또는 5 M 암모늄 아세테이트가 사용될 수있다).
- 냉장, absolu의 1.5 볼륨을 추가15 초 동안 테 에탄올과 소용돌이.
- -20 ° C (또는 -80 ° C에서 1 시간 러시의 경우)에서 하룻밤 침전.
참고 : 샘플에 남아있을 수 있습니다 -20 필요 이상 C를 °. - 4 ℃에서 30 분 동안 최대 속도로 원심 분리기.
- 냉장 된 RNase가없는 70 % 에탄올 1 ml로 펠렛을 씻는다.
- 공기의 RNA 분해 효소가없는 물을 20 μL의 펠릿에 resuspend 건조.
- 적절한 수율 (A260 / 280 비율 기준) 순도를 보장하고 관심있는 mRNA를 (들)에 특정 동일 각 부분의 볼륨과 PCR 프라이머를 사용하여 표준 RT-qPCR의 분석 (14)에 진행 분광 광도법에 의해 총 RNA 정량화.
자당 분수에서 단백질 9. 절연.
- RNA 외에도, 단백질은 분리 될 수 있고,뿐만 아니라 개별적인 polysome 분획에서 식별. 18 예를 들어, 단백질 분리에 사용할 수 많은 훌륭한 프로토콜 중 하나를 사용합니다.
Representative Results
우리는 최근 세포 사멸 억제제 XIAP와 Bcl-xL 발현 (12) 인코딩의 mRNA을 IRES이-은닉의 선택 번역 억제제로 종양 억제 PDCD4위한 새로운 역할을 설명했다. Polysome 프로파일 링은 IRES 매개 번역 PDCD4의 구체적인 참여 방법을 설명하기 위해 핵심 기술이었다. HEK293 세포는 일시적 PDCD4 (도 1a)의 내인성 수준을 고갈 형질 다음 프로파일 분석 polysome 행 하였다. 우리는 siCTRL 및 siPDCD4 처리 된 세포 (도 1B)를 비교 polysome 프로파일의 변화의 부족 것으로 판단 PDCD4의 감소 수준, 글로벌 셀룰러 번역을 저해하지 않은 것이 관찰. 마찬가지로, XIAP (19)의 비 IRES 변형의 polysome 분포는 치료 및 치료 세포 (그림 1C) 사이의 변화는 없었다. 대조적으로, 두 IRES-은닉의 mRNA polysome 분포, XIAP 및 Bcl-xL 발현이 유의하게 변경 하였다. P가없는DCD4 이들 두개의 mRNA의 분포가 무거운 ribopolysomes (도 1D, E)로 이동된다. 이것이 XIAP와 Bcl-xL 발현 mRNA에 (도 1F)이 결과의 정상 상태 수준의 변화를 수반하지 않기 때문에 더 웨스턴 블 롯팅 (도에 의해 확인 하였다 감소 PDCD4 수준으로 세포에서 XIAP와 Bcl-xL 발현의 번역을 향상을 보여줍니다 1G).
그림 1 :. Polysome 프로파일 링 XIAP와 Bcl-xL 발현 번역의 선택적 억제제로 PDCD4를 식별 (A) HEK293 세포 PDCD4의 siRNA 또는 컨트롤 (CTRL)로 처리하고, 안티 PDCD4에 용해 및 웨스턴 블롯 분석을의 siRNA를, 비 대상 안티 뉴 클레 항체는. PDCD4 노크 다운의 정도를 확인 (B) PDCD4가 (A)에서와 같이 무너 뜨렸다하고합니다세포 용 해물은 프로파일 polysome 행 하였다. 대표 polysome 프로필은 상단 패널에 표시됩니다; XIAP 비 IRES (C)의 분포는, GAPDH의 상대적인 Bcl-xL 발현 (D), 및 XIAP IRES (E)의 mRNA 각 분획 총 mRNA를 백분율 (%의 mRNA)로 표시된다. (F) 정상 -state mRNA 수준은 PDCD4의 siRNA 또는 제어 (CTRL) siRNA를 처리 한 세포의 RT-qPCR에 의해 측정 하였다. (G)로부터의 용 해물 (A)과 같은 항 - XIAP, 안티 Bcl-xL 발현과 함께 웨스턴 블롯 분석을 실시 안티 뉴 클레 항체. (NB. 데이터는 원래 12 년에 출판 된 그림 1에 제시) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
Polysomal 프로파일은 상이한 처리 조건 하에서 특정 전 사체의 번역의 상태를 정량화 할 수있는 강력한 기술이다. 그것은 원칙적으로 매우 간단한 기술이다 그러나 그것은 좋은 polysome 프로필을 생성에 중요한 일부 실행의 여러 단계가 필요합니다. 1)의 RNase가없는 화학 물질과 plasticware에를 사용, 2) (좋은 자당 그라디언트를 준비하는 우리의 경험에 10-50% 자당 그라디언트를 효율적으로 결합 리보솜 40 / 60S 서브 유닛과의 mRNA)을 해결하기위한 가장 좋은 일, 3 : 다음과 같은 주요 단계는 ) 번역의 최고 속도를 캡처하기 위해 지수 적으로 성장 세포와 더 이상 80 % 합류를 사용. 이러한 유전자 과발현 또는 최저 한 세포 치료제를 수행 할 때 플레이트에 세포의 양이 세포가 엔드 포인트에서 컨 플루 언트 될 정도의 함수일 수 있도록 이러한 후자 단계는, 고려되어야한다.
결과에서 presen와여기 테드, polysome 프로필 분석을 IRES-숨겨의 mRNA XIAP와 Bcl-xL 발현 (12)의 번역 조절에 PDCD4의 역할을 평가하기위한 중요한 도구였다. 우리가 PDCD4 노크 다운 (그림 1B)에 따라 일반 polysome 프로파일의 변화를 관찰하지 않은 사실은 우리가 PDCD4 실험의 조건에서 글로벌 휴대폰 번역을 손상하지 않았다고 결론을 내릴 수있었습니다. 우리는 다음 PDCD4 또는 제어 siRNA를 처리 한 세포에서 XIAP와 Bcl-xL 발현의 mRNA의 분포를 결정하기 위해 RT-qPCR에 분석을 사용 하였다. 이 mRNA의 분포의 정량적보다는 반 정량 분석과 치료 사이의 번역 효율에 미묘한 변화의 검출을 허용하기 때문에 qPCR에은, 표준 RT-PCR 또는 노던 블롯 반대로, polysome 프로파일을 분석하기위한 선택 방법이다. 이 기술을 사용하여, 우리는 XIAP와 Bcl-xL 발현의 mRNA의 분포가 (gr에 걸쳐 총 타깃 mRNA를 백분율로 표시 것을 보여줄 수 있었다adient)는 크게, 따라서 이들의 mRNA의 번역의 증가를 나타내는, PDCD4 노크 다운 (그림 1D, E) 후 그와 관련된 리보솜의 큰 숫자)와 함께 무거운 polyribosomes (의 mRNA로 이동했다. 이는 더욱 XIAP 및 Bcl-xL 발현 단백질 수준에서 아니지만 그들의 정상 RNA 수준 (도 1F, G)의 상승에 의해 확인 하였다. 중요한 것은, XIAP의 비 IRES 변이체의 polysome 분포는 처리 및 미처리 세포 (도 1C) 사이에서 불변이었다. 대안으로, 번역 효율은 14 (일반적으로 2-4을 분획) 대 monosomes polysomes mRNA의 함량의 비 (일반적으로 5-10 분획)로 제시 될 수있다.
254 nm에서 흡광도 판독 값에서 피크가 관찰이 독자적으로 리보솜 RNA (세제에 기인 할 수 없기 걸쳐 제어 프로토콜의 사용은 결과를 프로파일 링하는 polysome 검증 중요예컨대 트리톤 X-100 등의 강하게) 스펙트럼의이 영역에서 흡수하고 구배 상단 40 / 60S 피크를 가릴 수있다. 해물없이 및 / 또는 해물 버퍼 빈 그라데이션을 254 nm에서의 흡광도에 버퍼의 상대적 기여도를 결정하기 위해 실행해야합니다. Artefactual 고차 구조는 사실 없음에 (예 : "의사 polysomes"20)가 polysomes의 잘못된 해석으로 이어질 수 있습니다. 마그네슘 금속 이온 봉쇄 2가 양이온의 킬레이트 EDTA와 (80S 리보솜을 안정화하는 절차 전반에 걸쳐 사용은) 큰 (60S를 그 구성 요소 작은 (40S)에 리보솜의 분리를 일으킬 것 해물과 그라데이션 버퍼 (15 분 20 mM의)에 추가 ) 서브 유닛. 260 nm에서 기록 된 흡광도 피크 polysomes 실제로 경우 따라서, EDTA 처리를 단일 최대의 mRNA 리보좀 단위를 자유롭게 대응 구배의 상단 부근에 관측 될되도록 프로파일을 축소한다 (데이터는 미도시). 일치하는프로파일의 EDTA에 의한 붕괴, qPCR에 의해 분석 특정 대상의 모든 이제 그라데이션의 맨 위에 있어야합니다.
mRNA의 리보솜과 연관된 수는 항상 특정의 mRNA가 번역되는 것을 얼마나 효율적의 지표 아니다. 실제로, polysomes에 활성 번역은 독자가 알아야 할 21, 22 정체가되는 특정 상황이 있습니다. 성적표 적극적 EDTA 달리 '유거수'적극적 mRNA에 걸쳐 전좌되는 리보솜 발생 퓨로 마이신으로 샘플을 처리)하여 수행 할 수 번역 기계 결합, 또는 b) 샘플을 처리할지 여부를 결정 다시 다운 스트림 전좌 리보솜의 '실행 - 오프'를 일으키는 원인이되는 개시 코돈에서 첫 번째 리보솜의 전위를 억제 homoharringtonine와.
qPCR의 분석을위한 제어 사체의 사용은 중요하다. SELEC이러한 XIAP IRES의 비 IRES 변형 일부 가사 유전자 (GAPDH, 액틴, 튜 불린, 뉴 클레), 리보솜의 mRNA (18S, RPL13A) 나이 경우 다른 처리 조건에 의해 영향을받지 않는 성적 증명서의 기는 중요하다 검증 번역에 대한 치료의 효과는 특정 또는 일반화 된 경우. 이러한 제어 사체 여기 행해졌으로 분석의 mRNA의 분포를 정규화하는데 사용될 수있다 (XIAP와 Bcl-xL 발현의 mRNA는 GAPDH의 mRNA로 정규화하고 각 분획의 mRNA 함량의 합으로 표시되는 총 mRNA의 함량의 백분율로 표현 하였다 ) 또는 대안 적으로, 제어 대상의 mRNA가 절대 값으로 표현하고 개별적으로 도시 될 수있다. 입력 용 해물 (총 용적의 통상 10 %)의 qPCR의 분석은 특정의 mRNA 분포를 통제 할 다른 공정이다. 이상적으로는, 입력 용 해물에서 특정 mRNA의 전사의 함유량을 분석 한 10 개의 분획의 mRNA 함량의 합과 비교되어야한다. 최종적으로, 옵션 단계를 페놀 제어 : 클로로포름 추출 단계 (CAT는, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼 라제와 같은) 후속 qPCR에 의해 정량화 될 심지어 사용할 수 정상화 관내 전사 리포터 mRNA를 각각 polysome 분획 스파이크하는 데이터 (14).
어떤 기술과 마찬가지로, polysome 프로파일 링은 몇 가지 제한 사항을 제시한다. 통상 10 분은 최소 좋은 polysome 분포를 갖기 위해 수집 할 필요가 (변환 효율의 미묘한 변화가 20 이상이 필요할 수 있음)이 있다는 사실이 단계 4 샘플 만 최대가 될 수 있다는 점에서, 제한적인 만든다 한 번에 분석하는 것이 편안 한번에 RNA 추출 및 40 샘플 4 입력 컨트롤 qPCR의 분석을 처리 할 수 있어야한다. 샘플 크기는 쉽게 qPCR을 수행하는 복제 얼마나 많은 성적을 분석 할 수 있습니다 얼마나 많은에 추가 할 수 있습니다, 이것은 비용이 많이들 수 있습니다. qPCR에 기반 polysomal 프로파일 링의 또 다른 제한nalysis 그것만 (성적이 미리 공지되어 분석 될 수있는)와 번역의 전체 게놈 분석에 적용 할 수없는 후보 기반의 접근법에서 수행 될 수 있다는 것이다. 그러나, 21 세기의 시작 부분에, 연구자들은 DNA를 사용하여 게놈 수준에서 자신의 polysomal의 RNA를 심문하기 시작 차세대 시퀀싱 (16, 17)와 함께 최근에는 15을 마이크로 어레이. 오히려 개별 분수의 qPCR에 분석을 수행하는 것보다 것을 제외하고는이 프로토콜에 설명 된대로이 강력한 접근 방식에서, polysomal 프로파일 링을 수행 할 글로벌 번역 분수 (일반적으로 분수 2-4)와 polysomes 분수 (일반적으로 분수) 함께 풀링 및 변형 분석 monosomes DNA 마이크로 어레이 또는 전체 게놈 RNA 서열 분석에 의해. 따라서이 방법, 그것을 평가하기 위해 가능한 모든 누구의 분포 변화 polysomes에서 monosomes에 (번역 감소) 또는 반대 (번역 증가) 특정 치료시의 mRNA, 표준. 특정 mRNA의 polysomes 분포의 확인 및 정량화는 다음 qPCR을 수행 할 수 있습니다. polysomal 프로파일 원리의 더 강력한 사용 리보솜 프로파일입니다. 이 기술의 더 높은 처리량 확장 polysome 분수 (23)의 수백을 동시에 모니터링 할 수가 최근에보고되었다. 돌연변이의 수집 또는 대규모의 RNAi 화면에서 병진 효율 프로빙 때 명확한 이점을 제공한다. 리보솜 프로파일은 단백질 합성에 관여 24,25 리보솜 (리보솜 발자국)에 의해 보호 RNA 단편을 매핑 차세대 시퀀싱을 활용하는 기술이다. 이 기술에서, 리보솜 전좌는 사이클로 헥시 미드 (양면) 또는 emetine (돌이킬 수없는) 리보솜 발자국의 인구를 산출하기 위해 세포 용해 및 RNA 분해 효소 소화 다음으로 억제 할 수있다. 리보솜은 충실 총 RNA는 고립되고, 오염 리보솜과 미토콘드리아 리보솜 RNA가 제거됩니다.약 26 ~ 28 뉴클레오티드 RNA 발자국이 절연되어, cDNA 라이브러리로 변환, 전사 26 염기 서열을 리버스. 표준 polysome 프로파일과는 달리,이 방법뿐만 아니라 병진 규제 특정의 mRNA를 식별뿐만 아니라, 특정 성적 증명서를 따라 정확한 직업과 리보솜의 밀도 코돈 해상도에서 mRNA의 관련 정보를 얻을 수 있습니다. 이 발생하는 경우 성적 증명서 리보좀 모집에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있기 때문에 이것은, 특히 IRES-숨겨의 mRNA로 번역의 특정 모드와의 mRNA에 대한 관심이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gradient Master 108 automated gradient maker | BIOCOMP | 107-201M | |
| Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker | LABCONCO | 4517000 | |
| Beckman Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model # L-100-XP | |
| Density gradient fractionator | TELEDYNE ISCO | 69-3873-246 | Composed of: tube piercing system, peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector |
| WinDaq data acquisition software | DATAQ INSTRUMENTS | WINDAQ/LITE | http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm |
| Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) | DiaMed | PRE1900-N | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) | SafeSeal | 12000 | |
| Sucrose (nucleases-free) | Calbiochem | 573113 | MW = 342.3 g/mol |
| Cycloheximide | SIGMA | C7698 | MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing. |
| Sodium chloride (nucleases-free) | OmniPur | 7710 | MW = 58.44 g/mol |
| MgCl2.6H2O (nucleases-free) | OmniPur | 5980 | MW = 203.3 g/mol |
| Tris Base (nucleases-free) | J.T. Baker | 4109-01 | MW = 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | OmniPur | 9400 | Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation |
| Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2515 | |
| RNaseZap Rnase inactivation solution | Ambion, Life Technologies | AM9780 | |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Invitrogen, Life Technologies | AM9516 | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion, Life Technologies | AM9722 | Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion |
References
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