The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.
Regulation der Proteinsynthese stellt einen wichtigen Kontrollpunkt in der zellulären Antwort auf Stress. Insbesondere wurden diskreten RNA Regulationselemente gezeigt, die selektive Translation bestimmter mRNAs, die für Proteine codieren typischerweise für eine bestimmte Stressantwort erforderlich zu ermöglichen. Identifizierung dieser mRNAs als auch die Charakterisierung von regulatorischen Mechanismen für die selektive Translation verantwortlich ist, an der Spitze der molekularen Biologie seit einiger Zeit. Polysom Profilierung ist ein Eckpfeiler Verfahren in diesen Studien. Das Ziel Polysom Profilierung ist es, mRNA-Translation durch Immobilisierung aktiv übersetzen Ribosomen auf verschiedenen Transkripte erfassen und trennen Sie die resultierende Polyribosomen durch Ultrazentrifugation auf einem Saccharose-Gradienten, so dass eine Unterscheidung zwischen hoch übersetzte Transkripte und schlecht übersetzt Einsen. Diese können dann durch traditionelle biochemische und molekularbiologische Methoden charakterisiert werden. Wichtig ist, dass die Kombination von polysome Profilierung mit hohem Durchsatz genomische Ansätze erlaubt eine groß angelegte Analyse der Translationsregulation.
Regulation der Proteinsynthese (Translation) ist ein Schlüssel zellulären Prozess, der eng mit zellulären Überleben verknüpft ist. Da Übersetzung verbraucht mehr als 50% der Energie Zelle, ist es nicht verwunderlich, dass Übersetzung ist streng reguliert, und dass Störungen in der Übersetzung nicht gut vertragen. Umgekehrt sind viele aberrante zelluläre Prozesse erfordern, dass Translationsmaschinerie und Übersetzungs Ausgang (dh Proteom) müssen geändert werden. Dies ist häufig in verschiedenen Stressantwort und Krankheitszuständen der Fall, und ist wahrscheinlich am besten in der Krebsbeispielhaft dargestellt. Ein wesentlicher Vorteil der Translationskontrolle ist die Fähigkeit von Zellen, sich schnell neu zu programmieren, die das Protein Ausgabe in Reaktion auf verschiedene externe und interne Trigger, wodurch eine Feinabstimmung Mechanismus, neigt das Gleichgewicht zwischen Zellüberleben und Tod 1.
Zwei Aspekte der Translationskontrolle sind besonders interessant; Verständnis der Natur des Regelungs mechanism (s) und Kontrollelemente, die für bestimmte Übersetzung zu ermöglichen, und die Identifizierung von spezifischen mRNAs und deren Proteinprodukte, die in der zellulären Reaktion auf den Trigger, insbesondere selektive Translation in erster Linie ausgelöst teilzunehmen. Polysomen-Profilierung ist eine Technik, die effektive Untersuchung beider Prozesse ermöglicht.
Das übergeordnete Ziel des Polysom Profiling-Technik ist, um zu studieren und zu quantifizieren Übersetzung Zustand spezifischer mRNAs unter verschiedenen zellulären Bedingungen. Das Prinzip der Technik ist es, die mRNA-Translation durch '' Einfrieren '' aktiv übersetzen Ribosomen auf verschiedenen Transkripte und trennen Sie die resultierende Polyribosomen durch Ultrazentrifugation auf einem Saccharose-Gradienten, so dass eine Unterscheidung zwischen hoch übersetzte Transkripte (von mehreren Ribosomen gebunden) erfassen und schlecht übersetzt Einsen (mit einem oder zwei Ribosomen gebunden). In diesem speziellen Protokoll, das Antibiotikum Cycloheximid, die das bindet60S ribosomalen Untereinheit und blockiert die Freisetzung von deacetyliertes tRNA aus dem Ribosom E Park 2, wird verwendet, um Ribosomentranslokation hemmen und Stall Ribosomen an der Übersetzung mRNAs. Aber auch andere Blockierungsmittel, wie Emetin, die auch Blöcke Translationselongation 3, können verwendet werden.
Im Gegensatz zu dem Western Blotting und 35 S-Methionin-Markierungstechniken, die die endgültige Ausgabe des Übersetzungsprozesses zu messen, Polysomen-Profilierung hat den Vorteil der Messung Ribosomen Verbindung mit aktiv-translatierte mRNAs, wodurch für eine genauere Untersuchung der Übersetzungsmechanismen unter verschiedenen Bedingungen. Daher kann die Technik leicht an spezifisch untersuchen verschiedene Modi der Übersetzung 4-6 werden die Übersetzungsregelung 7-9, Stressbedingungen beeinflussen die Proteinsynthese 1,10,11 oder die Auswirkungen von mRNA-Strukturen wie IRES oder stromaufwärts beteiligten Proteine Faktoren offene Leserahmen auf die Protein synthESIS 12-14. Heutzutage sind Polysom Profilierung Anwendungen noch breiteres mit dem Einsatz von DNA-Microarrays 15 oder Next-Generation-Sequencing 16,17 zu analysieren Polysomen-assoziierte mRNAs.
Polysomaler Profilierung ist eine leistungsfähige Technik, die zur Quantifizierung der Zustand der Übersetzung der spezifischen Transkripte unter verschiedenen Behandlungsbedingungen ermöglicht. Es ist eine sehr einfache Technik im Prinzip doch mehrere Schritte der Ausführung, von denen einige kritische zur Herstellung guter Polysomen-Profile erfordert. Diese wichtigen Schritte sind: 1) mit RNase-frei Chemikalien und Kunststoffgeschirr, 2) Vorbereitung gute Saccharosegradienten (nach unserer Erfahrung ein 10-50% Saccharosegradienten funktionieren am besten, für die effiziente Lösung von 40 / 60S-Untereinheiten und mRNAs mit gebundenen Ribosomen) und 3 ) unter Verwendung von Zellen, die exponentiell wachsen und nicht mehr als 80% konfluent, um zu erfassen die höchsten Raten der Übersetzung. Dieser letztere Schritt ist zu berücksichtigen, wenn dabei lange Zellbehandlungen, wie beispielsweise Knock-down oder Überexpression genommen werden, so dass die Menge der Zellen an der Platte wird eine Funktion, wie viel sich die Zellen am Endpunkt konfluent sein.
In den Ergebnissen presented hier Polysomen-Profil-Analyse war ein wichtiges Werkzeug für die Bewertung Pdcd4 Rolle in der Translationsregulation der IRES-tragenden mRNAs XIAP und Bcl-xL 12. Die Tatsache, dass wir keine Änderung der allgemeinen Polysom Profile auf Pdcd4 knock-down (1B) nicht beachten konnten wir feststellen, dass Pdcd4 nicht globalen zellulären Übersetzung unter den Bedingungen des Experiments beeinträchtigen. Als nächstes verwendet RT-qPCR-Analyse, um die Verteilung des XIAP und Bcl-xL-mRNAs in Zellen, die mit Pdcd4 oder Kontroll siRNAs behandelt bestimmen. qPCR ist ein Verfahren der Wahl für die Analyse von Polysomen-Profile, im Gegensatz zu Standard-RT-PCR oder Northern-Blot, weil es für eine quantitative anstatt semi-quantitative Analyse der mRNA Verteilung und zum Nachweis von feinen Verschiebungen in Translationseffizienz zwischen den Behandlungen. Mit dieser Technik konnten wir zeigen, dass die Verteilung der XIAP und Bcl-xL-mRNAs (ausgedrückt als Prozent des gesamten Ziel-mRNA durch die gradient) signifikant in schwere Polyribosome (mRNAs mit einer großen Anzahl von Ribosomen mit ihnen verbunden sind), nachdem Pdcd4 knock-down (1D, E) verschoben wird, was auf eine Erhöhung der Übersetzung dieser mRNAs. Dies wurde weiter durch eine Erhöhung der XIAP und Bcl-xL-Protein-Spiegel, aber nicht in ihrer stationären RNA-Niveaus (1F, G) bestätigt. Wichtiger ist, die Polysomen Verteilung des nicht-IRES-Variante von XIAP war unverändert zwischen behandelten und unbehandelten Zellen (1C). Alternativ kann die Translationseffizienz als das Verhältnis der mRNA-Gehalt in Polysomen (üblicherweise die Fraktionen 5 bis 10) gegenüber monosomes vorgestellt (üblicherweise die Fraktionen 2 bis 4) 14.
Die Verwendung von Steuerelementen im gesamten Protokoll ist bei der Validierung keine Polysom Profilierungsergebnis wichtig, da von Absorptionswerte bei 254 nm beobachtet Spitzen können nicht auf eigene Faust, um die ribosomale RNA (Reinigungsmittel zurückzuführens, beispielsweise Triton X-100 stark absorbieren in diesem Bereich des Spektrums und kann 40 / 60S Spitzen an der Spitze des Gradienten verdecken). Lassen Gradienten ohne Lysat und / oder mit Lysatpuffer müssen ausgeführt werden, um den relativen Beitrag der Puffer zu der Absorption bei 254 nm zu bestimmen. Artefakt Strukturen höherer Ordnung können auch zu Fehlinterpretationen von Polysomen, wo es in der Tat keine (zB "pseudo-Polysomen" 20) führen. Maskierungs Magnesium (während des gesamten Verfahrens zur Stabilisierung von 80S Ribosomen) mit der zweiwertige Kationenchelator EDTA zugegeben, um Lysate und dem Gradienten-Puffer (20 mM für 15 min) wird die Trennung des Ribosoms in seine Komponenten kleinen (40S) führen und große (60S ) Untereinheiten. Wenn somit Absorptionspeaks bei 260 nm aufgezeichnet sind zwar Polysomen, EDTA-Behandlung das Profil, so dass ein einziges Maximum wird in der Nähe der Oberseite des Gradienten, die zu mRNA und die ribosomale Einheiten frei entspricht beachten kollabieren (Daten nicht gezeigt). Übereinstimmendmit EDTA-induzierten Zerfall des Profils, sollten alle der besonderen Ziele durch qPCR analysiert jetzt an der Oberseite des Gradienten gefunden werden.
Die Anzahl der Ribosomen mit einer mRNA assoziiert ist nicht immer ein Indikator dafür, wie effizient diese bestimmte mRNA übersetzt wird. Tatsächlich gibt es bestimmte Kontexte, in denen aktive Übersetzung auf Polysomen wird ins Stocken geraten 21,22, die der Leser bewusst sein sollten. Bestimmen, ob oder nicht Transkripte werden aktiv mit der Translationsmaschinerie in Eingriff kann durch eine geführt werden) Behandeln der Probe mit Puromycin, die im Gegensatz EDTA, bewirkt 'run-off "von Ribosomen, die aktiv in einem mRNA translozieren sind, oder b) Behandeln der Probe mit Homoharringtonin die Translokation nur der ersten Ribosom am Startcodon hemmt, was wiederum zu "Run-off" aller nachgelagerten Translokationseinheit Ribosomen.
Die Verwendung von Steuer Transkripten qPCR-Analyse ist ebenfalls kritisch. Das Selection von Transkripten, die nicht durch unterschiedliche Behandlungsbedingungen wie einige Housekeeping-Gene (GAPDH, Actin, Tubulin, Nucleolin), ribosomale mRNAs (18S, Rpl13a) oder in diesem Fall der Nicht-IRES Variante des XIAP IRES betroffen sind, ist in wichtigen Überprüfung, ob die Behandlung die Wirkung auf Übersetzung ist spezifisch oder generalisiert. Diese Steuer Transkripten verwendet werden, um die Verteilung der mRNAs analysiert, wie es hier gemacht normalisieren (XIAP und Bcl-xL-mRNAs wurden auf GAPDH-mRNA normalisiert und als Prozentsatz der Gesamt-mRNA-Gehalt durch die Summe der mRNA-Gehalt in jeder Fraktion vertreten ) oder alternativ können Ziel- und Steuerungs mRNAs als Absolutwerte angegeben und gesondert auszuweisen. qPCR-Analyse der Eingangs Lysaten (in der Regel 10% des Gesamtvolumens) ist ein weiterer Schritt, der für die Verteilung von spezifischen mRNAs steuern wird. Idealerweise sollte der mRNA-Gehalt einer spezifischen Transkripts in der Eingangs Lysat vergleichbar mit der Summe der mRNA-Gehalt in den Fraktionen 10 analysiert werden. Schließlich, Ein optionaler Schritt, um für die Phenol steuern: Chloroform Extraktionsschritt besteht darin, jeden Polysom Fraktion mit einem in vitro transkribiert Reporter mRNA Spike (wie CAT, Chloramphenicolacetyltransferase), die anschließend von qPCR quantifiziert werden wird und kann sogar verwendet werden, um die Normalisierung Daten 14.
Wie bei jeder Technik stellt die Polysomen Profilierung einige Einschränkungen. Die Tatsache, dass in der Regel ein Minimum von 10 Fraktionen (subtilere Veränderungen der Translationseffizienz erfordern 20 oder mehr) benötigen, um schöne Polysom Distributionen gesammelt macht dieser Schritt Begrenzung, in dem Sinne, dass nur maximal 4 Proben kann zu einem Zeitpunkt analysiert, um in der Lage, bequem hand RNA-Extraktion und qPCR-Analyse von 40 Proben und 4 Input-Kontrollen auf einmal sein. Die Stichprobengröße kann leicht bis mit, wie viele Transkripte analysiert werden und wie viele qPCR repliziert zu tun, und das kann teuer werden. Eine weitere Einschränkung eines qPCR-basierte polysomaler Profilierung einnalysis ist, dass sie nur auf einen Kandidaten-basierten Ansatz (wobei die Transkripte zu analysierende im Voraus bekannt sind) und kann nicht für genomweiten Analyse von Übersetzungs angewendet werden erfolgen. Doch zu Beginn des 21. Jahrhunderts begannen die Ermittler ihre polysomaler RNA an genomischer Ebene mit Hilfe von DNA-Microarrays zu verhören 15 und in jüngerer Zeit mit der nächsten Generation Sequenzierung 16,17. In diesem leistungsfähigen Ansatz wird polysomaler Profilierung durchgeführt, wie in diesem Protokoll beschrieben ist, außer, dass anstatt der Durchführung qPCR Analyse der einzelnen Fraktionen, monosomes Fraktionen (in der Regel Bruch 2-4) und Polysomen Fraktionen (meist Fraktionen) werden vereinigt und Variationen in der globalen Übersetzung analysiert durch DNA-Microarray oder des gesamten Genoms RNA Sequenzierung. Daher bei diesem Ansatz ist es möglich zu beurteilen, alle mRNAs, deren Verteilung verschiebt sich von Polysomen zu monosomes (Abnahme der Übersetzung) oder umgekehrt (Erhöhung der Übersetzung) auf ausdrückliches treatment. Validierung und Quantifizierung spezifischer mRNA Polysomen Verteilung kann dann durch qPCR erfolgen. Eine noch leistungsfähigere Nutzung der polysomaler Profilierung Prinzip ist Ribosom Profilierung. Weitere Hochdurch Erweiterung dieser Technik wurde kürzlich berichtet, dass zur gleichzeitigen Überwachung von Hunderten von Polysomen Fraktionen 23 ermöglicht. Dies stellt einen klaren Vorteil beim Antasten Translationseffizienzen von Mutantensammlungen oder in einer groß angelegten RNAi-Screens. Ribosom Profiling ist eine Technik, die ausnutzt Next Generation Sequencing, um RNA-Fragmente von Ribosomen (Ribosomen Fußabdrücke) geschützt in der Proteinsynthese 24,25 engagiert abzubilden. Bei dieser Technik kann Ribosomentranslokation mit Cycloheximid (reversibel) oder Emetin (irreversible), gefolgt von Zell-Lyse und RNase-Verdau, um eine Population von Ribosomen Fußabdrücke ergeben gehemmt werden. Ribosomen sind angereichert, die Gesamt-RNA isoliert und verunreinigen ribosomale und mitochondriale ribosomale RNA wird entfernt.RNA Fußabdrücke von ca. 26-28 Nukleotiden werden isoliert, revers transkribiert, in eine cDNA-Bibliothek umgewandelt und sequenziert 26. Im Gegensatz zu Standard Polysom Profiling, dieser Ansatz nicht nur identifiziert spezifische mRNAs, die translational reguliert werden, sondern auch liefert mRNA-spezifische Informationen bei Codon Auflösung wie die genaue Besetzung und Dichte der Ribosomen entlang einer spezifischen Transkript. Dies ist besonders interessant für mRNAs mit bestimmten Arten der Übersetzung wie IRES-beherbergen mRNAs, wie es mehr Informationen darüber, wo auf dem Transkript Ribosom-Rekrutierung auftritt geben könnte.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Gradient Master 108 automated gradient maker | BIOCOMP | 107-201M | |
Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker | LABCONCO | 4517000 | |
Beckman Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model # L-100-XP | |
Density gradient fractionator | TELEDYNE ISCO | 69-3873-246 | Composed of: tube piercing system, peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector |
WinDaq data acquisition software | DATAQ INSTRUMENTS | WINDAQ/LITE | http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm |
Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14×89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | |
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) | DiaMed | PRE1900-N | |
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) | SafeSeal | 12000 | |
Sucrose (nucleases-free) | Calbiochem | 573113 | MW = 342.3 g/mol |
Cycloheximide | SIGMA | C7698 | MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing. |
Sodium chloride (nucleases-free) | OmniPur | 7710 | MW = 58.44 g/mol |
MgCl2.6H2O (nucleases-free) | OmniPur | 5980 | MW = 203.3 g/mol |
Tris Base (nucleases-free) | J.T. Baker | 4109-01 | MW = 121.14 g/mol |
Triton X-100 | OmniPur | 9400 | Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation |
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2515 | |
RNaseZap Rnase inactivation solution | Ambion, Life Technologies | AM9780 | |
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen, Life Technologies | AM9516 | |
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion, Life Technologies | AM9722 | Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion |