The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.
Regulering av proteinsyntese representerer et nøkkelkontrollpunkt i cellulær respons på stress. Spesielt ble diskret RNA regulatoriske elementer vist å tillate selektiv oversettelse av bestemte mRNAer, som typisk koder for proteiner som er nødvendige for en bestemt stressrespons. Identifisering av disse mRNA, samt karakterisering av regulatoriske mekanismer ansvarlig for selektiv oversettelsen har vært i forkant av molekylær biologi i noen tid. Polysome profilering er en hjørnestein metode i disse studiene. Målet med polysome profilering er å fange mRNA oversettelse ved immobilisering aktivt sette ribosomer på ulike transkripsjoner og skille de resulterende polyribosomes ved ultrasentrifugering på en sukrosegradient, og dermed gir for et skille mellom høyt oversatte utskrifter og dårlig oversatte seg. Disse kan deretter bli ytterligere karakterisert ved tradisjonelle biokjemiske og molekylærbiologiske metoder. Viktigere, kombinere polysome profilering med høy gjennomstrømning genomiske fremgangsmåter gjør det mulig for en stor skala-analyse av translasjons-regulering.
Regulering av proteinsyntese (oversettelse) er en viktig cellulær prosess som er nært knyttet til mobilnettet overlevelse. Gitt at oversettelsen forbruker mer enn 50% av cellens energi, er det ikke overraskende at oversettelsen er strengt regulert, og at forstyrrelser i oversettelse ikke er godt tolerert. Omvendt, mange avvikende cellulære prosesser krever at oversettelsen maskiner og oversettelse utgang (dvs. proteom-) må endres. Dette er ofte tilfellet i ulike stressrespons og sykdomstilstander, og er trolig best eksemplifisert i kreft. En viktig fordel med translasjons-kontroll er evnen til cellene til å omprogrammere hurtig protein-utgang i respons til ulike eksterne og interne triggere, og dermed finjustering mekanisme som tips balansen mellom celle-overlevelse og død 1.
To aspekter av translasjonell kontroll som er interessant; forståelse av naturen av regelverket mechanism (e) og kontrollelementer som gir mulighet for omregning bestemt, og identifisering av spesifikke mRNA og deres proteinprodukter som deltar i cellulær respons på den bestemte trigger som fremkalte selektiv translasjon i det første sted. Polysome profilering er en teknikk som gjør det mulig effektiv studie av begge prosessene.
Det overordnede målet med polysome profilering teknikk er å studere og kvantifisere oversettelsen tilstand av spesifikke mRNA under ulike cellulære forhold. Prinsippet om teknikken er å fange mRNA oversettelse av '' fryse '' aktivt sette ribosomer på ulike transkripsjoner og skille de resulterende polyribosomes ved ultrasentrifugering på en sukrosegradient, og dermed gir for et skille mellom høyt oversatte transkripsjoner (bundet av flere ribosomer) og dårlig oversatt de (bundet av en eller to ribosomer). I dette spesielle protokoll, antibiotika cykloheksimid som binder til60S ribosomale subenhet og blokkerer frigjøring av deacetylert tRNA fra ribosomet E området 2, blir brukt til å inhibere ribosom-translokasjon og stall ribosomer på å oversette mRNA. Imidlertid kan andre blokkerende midler som for eksempel emetine som blokkerer også oversettelses forlengelse 3, kan brukes.
I motsetning til den vestlige blotting og 35 S-metionin merkingsteknikker som måler det endelige resultatet av oversettelsesprosessen, polysome profilering har fordelen av å måle ribosomer assosiasjon med aktivt-oversatte mRNA, og dermed åpner for en mer detaljert studie av oversettelsesmekanismer under forskjellige forhold. Derfor kan den teknikk som lett kan tilpasses til å spesifikt studere forskjellige moduser av oversettelses 4-6, proteiner, faktorer som er involvert i regulering av oversettelses 7-9, stressbetingelser som påvirker proteinsyntesen 1,10,11 eller virkningene av mRNA-strukturer som IRES eller oppstrøms åpne leserammer på protein synthesis 12-14. I dag, polysome profilerings programmer er enda bredere med bruk av DNA-mikromatriser 15 eller neste generasjons sekvense 16,17 å analysere polysomes-forbundet mRNA.
Polysomal profilering er en kraftfull teknikk som gjør det mulig for kvantifisering av staten oversettelse av spesifikke transkripsjoner under ulike behandlingsforhold. Det er en veldig enkel teknikk i prinsippet, men det krever flere trinn for gjennomføring, hvorav noen er kritiske for å produsere gode polysome profiler. Disse nøkkel trinnene er: 1) med RNase-frie kjemikalier og plasticware, 2) å utarbeide gode sukrosegradienter (etter vår erfaring en 10-50% sukrosegradienter fungerer best for effektivt å løse 40 / 60S subenheter og mRNA med innbundne ribosomer), og 3 ) ved hjelp av celler som er eksponentielt voksende og ikke mer enn 80% sammenflytende for å fange de høyeste tallene for oversettelse. Dette sistnevnte trinn bør tas i betraktning når man gjør lange cellen behandlinger, slik som genet knockdown eller overekspresjon, slik at mengden av cellene til platen, vil være en funksjon av hvor mye cellene vil bli sammenflytende ved endepunkt.
I resultatene presented her, polysome profilanalyse var et viktig redskap for å vurdere PDCD4 rolle i oversettelsen regulering av IRES-husing mRNAs XIAP og BCL-XL 12. Det faktum at vi ikke observere noen endring i de generelle polysome profiler på PDCD4 knock-down (figur 1B) mulig for oss å konkludere med at PDCD4 ikke svekke den globale mobil oversettelse under betingelsene for forsøket. Vi benyttet ved RT qPCR-analyse for å bestemme fordelingen av XIAP og Bcl-xL mRNA i celler behandlet med PDCD4 eller kontroll sirnas. qPCR er en metode for valg for å analysere polysome profiler, i motsetning til standard RT-PCR eller Northern blotting, fordi den muliggjør en kvantitativ snarere enn semi-kvantitativ analyse av mRNA-fordeling og for påvisning av subtile endringer i effektivitet translatorisk mellom behandlingene. Ved hjelp av denne teknikken, var vi i stand til å vise at fordelingen av de XIAP og BCL-XL mRNA (uttrykt som en prosent av total target mRNA over gradient) ble signifikant forskjøvet inn i tung polyribosomes (mRNA med et stort antall av ribosomer forbundet med dem) etter PDCD4 knock-down (figur 1D, E), og således indikerer en økning i mRNA translasjon av disse. Dette ble ytterligere bekreftet ved en økning i XIAP og BCL-XL protein nivåer, men ikke i sine steady-state RNA nivåer (figur 1F, G). Viktigere er det polysome fordelingen av de ikke-IRES variant av XIAP var uforandret mellom behandlede og ubehandlede celler (figur 1C). Alternativt kan translasjonelle effektivitet bli presentert som et forhold mellom mRNA-innholdet i polysomes (vanligvis fraksjoner 5 til 10) som funksjon av monosomes (vanligvis fraksjoner 2 til 4) 14.
Bruk av kontroller i hele protokollen er viktig å validere noen polysome profilering resultat, som topper observert fra avlesninger ved 254 nm kan ikke på egen hånd tilskrives ribosomalt RNA (vaskemiddels, som for eksempel Triton X-100 sterkt absorberer i dette området av spekteret, og kan utydelig 40 / 60S topper ved toppen av gradienten). Blanke gradienter uten lysat og / eller med lysat buffer må kjøres for å bestemme den relative bidraget av buffere til absorbans ved 254 nm. Gjenstands høyere ordens strukturer kan også føre til feilaktige tolkninger av polysomes der det er faktisk ingen (f.eks "pseudo-polysomes" 20). Sekvestrering av magnesium (anvendt gjennom hele fremgangsmåten for å stabilisere 80S ribosomene) med det divalente kation-chelator EDTA tilsatt til lysatene, og til gradient-buffer (20 mM i 15 min) vil føre til separasjon av ribosomet i dens komponent liten (40S) og store (60S ) subenheter. Hvis således absorbanstoppene registrert ved 260 nm er faktisk polysomes, vil kollapse EDTA behandling profilen, slik at en enkelt maksimum vil bli observert i nærheten av toppen av gradienten som tilsvarer frigjøre mRNA og ribosomale enheter (data ikke vist). Sammenfallendemed EDTA-indusert kollaps av profilen, alle de konkrete mål analysert ved qPCR skal nå bli funnet på toppen av graderingen.
Antallet ribosomer forbundet med en mRNA er ikke alltid en effektiv indikator på hvordan den aktuelle mRNA blir oversatt. Faktisk, er det spesifikke sammenhenger der aktiv oversettelse på polysomes blir fastlåste 21,22 som leseren bør være klar over. Bestemme hvorvidt eller ikke-transkripter er aktivt engasjert med oversettelsen maskiner kan gjøres ved a) behandling av prøven med puromycin, som i motsetning til EDTA, som forårsaker "run-off" av ribosomer som er aktivt over en translocating mRNA, eller b) behandling av prøven med homoharringtonine som hemmer translokasjon av bare den første ribosom på startkodonet, igjen forårsaker "run-off" av noen nedstrøms translocating ribosomer.
Bruken av styre transkripter for qPCR-analyse er også kritisk. Den selecsjon av vitnemål som ikke er påvirket av ulike behandlingsforhold som noen housekeeping gener (GAPDH, Actin, Tubulin, Nucleolin), ribosomale mRNA (18S, RPL13A) eller i dette tilfellet ikke-IRES variant av XIAP IRES, er viktig i verifisere om behandlingen effekt på oversettelsen er bestemt eller generalisert. Disse kontroll transkripter kan brukes til å normalisere fordelingen av de analyserte mRNAer slik det ble gjort her (XIAP og Bcl-xL mRNA ble normalisert til GAPDH mRNA og uttrykt som en prosentandel av den totale mRNA-innhold representeres av summen av mRNA-innholdet i hver fraksjon ) eller alternativt, kan mål- og kontroll mRNA uttrykkes som absolutte verdier og vist separat. qPCR analyse av inngangs lysater (vanligvis 10% av totalvolumet) er et nytt skritt som vil kontrollere for distribusjon av spesifikke mRNA. Ideelt sett bør mRNA-innholdet av et bestemt transkript i inngangs lysat kunne sammenlignes med summen av mRNA-innholdet i alle 10 fraksjoner som ble analysert. Endelig, Et valgfritt trinn for å kontrollere for fenol: kloroform-ekstraksjon trinn er å pigge hver polysome fraksjon med en in vitro-transkribert mRNA reporter (for eksempel CAT, kloramfenikol acetyl transferase) som deretter vil bli kvantifisert ved qPCR og kan også bli brukt til å normalisere Data 14.
Som med hvilken som helst teknikk, presenterer polysome profilering noen begrensninger. Det faktum at vanligvis et minimum på 10 fraksjoner (mer subtile endringer i oversettelses effektivitet kan kreve 20 eller mer) må samles for å ha fine fordelinger polysome gjør dette trinnet begrensende, i den forstand at bare et maksimum på 4 prøver kan bli analysert om gangen for å være ubehagelig å håndtere RNA ekstraksjon og qPCR analyse av 40 prøver og 4 inndatakontrollene samtidig. Utvalgsstørrelsen kan enkelt legge opp med hvor mange transkripsjoner er å bli analysert og hvor mange qPCR replikerer å gjøre, og dette kan være kostbart. En annen begrensning av en qPCR-baserte polysomal en profileringnalysis er at det kan kun gjøres på en kandidat basert tilnærming (hvor de transkriptene som skal analyseres er kjent på forhånd) og kan ikke bli brukt for genom-omfattende analyse av oversettelse. Men i begynnelsen av det 21. århundre, begynte etterforskere å avhøre deres polysomal RNA på et genomisk nivå ved hjelp av DNA-mikromatriser 15 og mer nylig med neste generasjons sekvense 16,17. I dette kraftfull tilnærming, er polysomal profilering utført som beskrevet i denne protokollen, bortsett fra at i stedet for å utføre qPCR analyse av enkeltfraksjoner, monosomes fraksjoner (vanligvis fraksjon 2-4) og polysomes fraksjoner (vanligvis fraksjoner) kan grupperes sammen og variasjoner i den globale oversettelse analysert ved DNA microarray eller hel-genom RNA sekvensering. Derav med denne tilnærmingen, er det mulig å vurdere alle mRNA hvis distribusjon skift fra polysomes til monosomes (reduksjon i oversettelse) eller omvendt (økning i oversettelse) ved en bestemt godbitment. Validering og kvantifisering av spesifikke mRNA-polysomes fordeling kan da gjøres ved qPCR. En enda mer kraftfull bruk av polysomal profilering prinsippet er ribosom profilering. Ytterligere high throughput forlengelse av denne teknikken ble nylig rapportert at tillater samtidig overvåking av hundrevis av polysome fraksjoner 23. Dette gir en klar fordel når sondering translasjonsforskning effektiviteten av muterte samlinger eller i en storstilt RNAi skjermer. Ribosom profilering er en teknikk som utnytter neste generasjons sekvensering for å kartlegge RNA fragmenter beskyttet av ribosomer (ribosom fotavtrykk) engasjert i proteinsyntesen 24,25. I denne teknikken, kan ribosom-translokasjon inhiberes med cykloheksimid (reversibel) eller emetine (irreversibel) etterfulgt av cellelyse og RNase-fordøyelse til å gi en populasjon av ribosom overføringene. Ribosomer er anriket, total-RNA isoleres, og forurenser ribosomal og mitokondrielle ribosomalt RNA er fjernet.RNA fotavtrykk på ca 26-28 nukleotider er isolert, revers transkribert, omgjort til et cDNA bibliotek og sekvensert 26. I motsetning til standard polysome profilering, denne tilnærmingen ikke bare identifiserer bestemte mRNAer som er translatorisk regulert, men også gir mRNA-spesifikk informasjon ved kodon oppløsning, for eksempel den nøyaktige stilling og tettheten av ribosomer langs et bestemt transkript. Dette er særlig aktuelt for mRNA med spesielle moduser av oversettelse som IRES-husing mRNA, som det kunne gi mer informasjon om hvor på karakterutskriften ribosom-rekruttering skjer.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Gradient Master 108 automated gradient maker | BIOCOMP | 107-201M | |
Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker | LABCONCO | 4517000 | |
Beckman Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model # L-100-XP | |
Density gradient fractionator | TELEDYNE ISCO | 69-3873-246 | Composed of: tube piercing system, peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector |
WinDaq data acquisition software | DATAQ INSTRUMENTS | WINDAQ/LITE | http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm |
Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14×89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | |
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) | DiaMed | PRE1900-N | |
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) | SafeSeal | 12000 | |
Sucrose (nucleases-free) | Calbiochem | 573113 | MW = 342.3 g/mol |
Cycloheximide | SIGMA | C7698 | MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing. |
Sodium chloride (nucleases-free) | OmniPur | 7710 | MW = 58.44 g/mol |
MgCl2.6H2O (nucleases-free) | OmniPur | 5980 | MW = 203.3 g/mol |
Tris Base (nucleases-free) | J.T. Baker | 4109-01 | MW = 121.14 g/mol |
Triton X-100 | OmniPur | 9400 | Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation |
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2515 | |
RNaseZap Rnase inactivation solution | Ambion, Life Technologies | AM9780 | |
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen, Life Technologies | AM9516 | |
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion, Life Technologies | AM9722 | Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion |