The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.
Reglering av proteinsyntes utgör en viktig kontrollpunkt i cellulär reaktion på stress. I synnerhet var diskret RNA-regulatoriska element visas för att medge att selektiv translation av specifika mRNA-sekvenser, som normalt kodar för proteiner som krävs för en viss stressrespons. Identifiering av dessa mRNA samt karaktärisering av reglerande mekanismer som är ansvariga för selektiv översättning har gått i spetsen för molekylärbiologi under en tid. Polysom profilering är en hörnsten metod i dessa studier. Målet med polysom profilering är att fånga mRNA translation genom att immobilisera aktivt översätta ribosomer på olika transkript och separera de resulterande polyribosomer genom ultracentrifugering på en sackarosgradient, vilket möjliggör en distinktion mellan högt översatta avskrifter och dåligt översatta sådana. Dessa kan sedan ytterligare karakteriseras av traditionella biokemiska och molekylärbiologiska metoder. Viktigt att kombinera polysome profilering med hög kapacitet iska metoder möjliggör en storskalig analys av translationell reglering.
Reglering av proteinsyntes (translation) är en viktig cellulär process som är intimt kopplad till cellöverlevnad. Med tanke på att översättningen konsumerar mer än 50% av cellens energi, är det inte förvånande att översättningen är hårt reglerad och att störningar i översättningen inte väl tolereras. Omvänt många avvikande cellulära processer kräver att översättnings maskiner och översättningsproduktionen (dvs. proteomet) måste modifieras. Detta är ofta fallet i olika stress och sjukdomstillstånd, och är förmodligen bäst exemplifieras i cancer. En viktig fördel med translationell kontroll är förmågan hos cellerna att snabbt programmera proteinet utsignal som svar på olika externa och interna utlösare, vari finjustering mekanism som tips balansen mellan cellöverlevnad och död en.
Två aspekter av translationell kontroll är särskilt intressant; förståelse av den typ av reglerings mechanism (er) och kontrollelement som möjliggör specifik översättning, samt identifiering av specifika mRNA och deras proteinprodukter som deltar i det cellulära svar på den speciella trigger som framkallade selektiv översättning i första hand. Polysom profilering är en teknik som möjliggör effektiv undersökning av båda processerna.
Det övergripande målet för polysom profileringstekniken är att studera och kvantifiera översättningen tillstånd specifika mRNA under olika cellulära betingelser. Principen för tekniken är att fånga mRNA översättning '' frysa '' aktivt översätta ribosomer på olika transkript och separera de resulterande polyribosomer genom ultracentrifugering på en sackarosgradient, vilket möjliggör en distinktion mellan högt översatta avskrifter (bundet av flera ribosomer) och dåligt översatt ettor (bunden av en eller två ribosomer). I detta särskilda protokoll, antibiotikan cykloheximid som binder till60S ribosomala subenheten och blockerar frisättningen av deacetylerat tRNA från ribosomerna E ställe 2, används för att förhindra ribosomen translokation och stall ribosomer på översätta mRNA. Men andra blockerande medel såsom emetin som blockerar även översättnings töjning 3, kan användas.
Till skillnad från den västra blotting och 35 S-metionin märkningsteknik som mäter slutresultatet av översättningsprocessen, polysom profilering har fördelen att mäta ribosomer association med aktivt-översatta mRNA, vilket möjliggör en mer detaljerad studie av mekanismer översättnings under olika förhållanden. Därför kan tekniken enkelt anpassas till specifikt studera olika typer av översättnings 4-6, proteiner faktorer involverade i översättningsreglering 7-9, stressförhållanden som påverkar proteinsyntesen 1,10,11 eller effekterna av mRNA-strukturer såsom IRES eller uppströms öppna läsramar på protein synthESIS 12-14. Numera polysom profilerings program är ännu bredare med hjälp av DNA-microarrays 15 eller nästa generations sekvense 16,17 för att analysera polysomer-associerade mRNA.
Polysomal profilering är en kraftfull teknik som gör det möjligt för kvantifiering av tillståndet för översättningen av specifika transkript under olika behandlingsförhållanden. Det är en mycket enkel teknik i princip men det kräver flera steg av utförandet, av vilka några är kritiska för att producera bra polysom profiler. Dessa viktiga steg är: 1) med RNas-fria kemikalier och plastic, 2) förbereda goda sackarosgradienter (i vår erfarenhet en 10-50% sackarosgradienter fungerar bäst för att effektivt lösa 40 / 60S subenheter och mRNA med bundna ribosomer) och 3 ) med hjälp av celler som exponentiellt växer och högst 80% sammanflytande för att fånga de högsta nivåerna av översättning. Detta senare steg bör tas i beaktande när man gör långa cell behandlingar, såsom gen knockdown eller överuttryck, så att mängden celler att plattan kommer att vara en funktion av hur mycket cellerna kommer att sammanflytande vid endpoint.
I resultaten presented här, polysom profilanalys var ett viktigt redskap för att bedöma PDCD4 roll i översättnings regleringen av IRES-hyser mRNA XIAP och Bcl-xL 12. Det faktum att vi inte observerade någon förändring i de allmänna polysom profiler på PDCD4 knock-down (Figur 1B) tillät oss att dra slutsatsen att PDCD4 inte försämra den globala mobil översättning enligt villkoren i experimentet. Vi använde nästa RT-qPCR analys för att bestämma fördelningen av XIAP och Bcl-xL mRNA i celler som behandlats med PDCD4 eller kontroll siRNA. qPCR är en metod för val för att analysera polysom profiler, i motsats till standard RT-PCR eller Northern blotting, eftersom den möjliggör en kvantitativ snarare än halv kvantitativ analys av mRNA distribution och för att upptäcka subtila förändringar i translationell effektivitet mellan behandlingarna. Med denna teknik kunde vi visa att fördelningen av XIAP och Bcl-xL mRNA (uttryckt i procent av den totala mål-mRNA över gradient) var signifikant skiftas in tunga polyribosomer (mRNA med ett stort antal av ribosomer förknippade med dem) efter PDCD4 knock-down (figur 1D, E), vilket sålunda indikerar en ökning av translation av dessa mRNA-sekvenser. Detta bekräftades ytterligare av en ökning av XIAP och Bcl-xL proteinnivåer, men inte i deras steady-state RNA-nivåer (Figur 1F, G). Viktigt är att polysom fördelning av den icke-IRES variant av XIAP var oförändrad mellan behandlade och obehandlade celler (Figur 1C). Alternativt skulle translationell effektivitet presenteras som ett förhållande av mRNA-innehåll i polysomer (vanligtvis fraktionerna 5-10) kontra monosomes (vanligtvis fraktionerna 2-4) 14.
Användningen av kontrollerna i hela protokollet är viktigt att validera all polysom profilering resultat, som toppar observerade från absorbansmätningar vid 254 nm kan inte på egen hand tillskrivas ribosom RNA (tvättmedelar, såsom Triton X-100 absorberar starkt i detta området av spektrum och kan fördunkla 40 / 60S toppar på toppen av gradienten). Tomma gradienter utan lysat och / eller med lysat buffert måste köras för att bestämma det relativa bidraget av buffertarna till absorbansen vid 254 nm. Artefactual högre ordning strukturer kan också leda till felaktiga tolkningar av polysomer där det finns faktiskt ingen (t.ex. "pseudo-polysomer" 20). Binda magnesium (används under hela förfarandet för att stabilisera 80S ribosomer) med tvåvärd katjon chelator EDTA till lysat och gradienten buffert (20 mM under 15 min) kommer att orsaka separation av ribosomen i dess komponent små (40S) och stora (60S ) subenheter. Således, om absorbanstoppar registrerats vid 260 nm är verkligen polysomer kommer EDTA behandling kollapsa profilen så att en enda maximum kommer att observeras nära toppen av gradienten som motsvarar befria mRNA och ribosomala enheter (data visas ej). Sammanfallandemed EDTA-inducerad kollaps av profilen, bör alla de specifika mål som analyseras av qPCR nu finns på toppen av gradienten.
Antalet ribosomer förknippade med ett mRNA är inte alltid en indikator på hur effektivt detta särskilda mRNA att translateras. I själva verket finns det särskilda sammanhang där aktiv översättningen på polysomer blir strandade 21,22 vilket läsaren bör vara medveten om. Avgöra om avskrifter är aktivt engagerade med översättningen maskiner kan göras av a) behandling av provet med puromycin, som till skillnad från EDTA orsakar "avrinning" av ribosomer som aktivt translokerande över ett mRNA, eller b) behandling av provet med homoharringtonin som hämmar translokation av endast den första ribosomen vid startkodonet, återigen orsakar "run-off" av någon nedströms translokerande ribosomer.
Användningen av kontroll-transkript för qPCR analys är också kritisk. Den selecning av transkript som inte påverkas av olika behandlingsförhållanden såsom vissa hushållningsgener (GAPDH, aktin tubulin, nukleolin), ribosomala mRNA (18S, RPL13A) eller i det här fallet inte är IRES variant av XIAP IRES, är viktig i kontrollera om behandlingen har effekt på översättning är specifik eller generaliserad. Dessa kontrolltranskript kan användas för att normalisera fördelningen av de analyserade mRNA som gjordes här (XIAP och Bcl-xL mRNA normaliserades till GAPDH mRNA och uttryckt i procent av det totala mRNA innehållet utgörs av summan av mRNA-innehåll i varje fraktion ) eller alternativt kan mål- och styr mRNA uttryckas som absoluta värden och redovisas separat. qPCR analys av ingångs lysaten (vanligtvis 10% av den totala volymen) är ytterligare ett steg som kommer att kontrollera för distribution av specifika mRNA. Helst bör innehållet i ett specifikt transkript i inmatnings lysat mRNA vara jämförbar med summan av mRNA-innehåll i alla 10 fraktioner analyserade. Slutligen, Ett valfritt steg för att styra för fenol: kloroformextraktion steget är att spika varje polysom fraktion med ett in vitro-transkriberat reporter-mRNA (exempelvis CAT, kloramfenikolacetyltransferas) som senare kommer att kvantifieras med qPCR och kan även användas för att normalisera uppgifter 14.
Som med vilken teknik som helst, presenterar polysom profilering vissa begränsningar. Det faktum att vanligtvis minst 10 fraktioner (mer subtila förskjutningar i effektivitet översättning kan kräva 20 eller mer) måste samlas för att ha trevligt polysom fördel gör detta steg begränsande, i den meningen att endast maximalt 4 prover kan vara analyseras i taget för att kunna bekvämt hantera RNA-extraktion och qPCR analys av 40 prover och 4 ingångskontroller på en gång. Urvalsstorleken kan enkelt lägga upp med hur många utskrifter som ska analyseras och hur många qPCR replikerar att göra, och det kan bli kostsamt. En annan begränsning med en qPCR-baserad polysomal profilering aANALYS är att den endast kan göras på en kandidat baserad metod (där utskrifter som skall analyseras är känd i förväg) och kan inte sökas genomet hela analysen av översättning. Men i början av 21-talet, utredare började förhöra sin polysomal RNA på genomisk nivå med hjälp av DNA Microarrays 15 och mer nyligen med nästa generations sekvensering 16,17. I denna kraftfulla tillvägagångssätt är polysomal profilering utförs som beskrivs i detta protokoll, förutom att istället för att genomföra qPCR analys av enskilda fraktioner, monosomes fraktioner (oftast fraktion 2-4) och polysomer fraktioner (vanligtvis fraktioner) slås samman och variationer i den globala översättning analyseras genom DNA microarray eller hel-genom-RNA-sekvensering. Därför med denna strategi är det möjligt att bedöma alla mRNA vars distributions skiftar från polysomer till monosomes (minskning i översättning) eller vice versa (ökad translation) på särskild behandlingling. Validering och kvantifiering av specifika mRNA polysomer fördelning kan sedan göras av qPCR. En ännu mer kraftfull användning av principen polysomal profilering är ribosomen profilering. Ytterligare hög genomströmning förlängning av denna teknik rapporterades nyligen som möjliggör samtidig övervakning av hundratals polysom fraktioner 23. Detta ger en klar fördel när sondering translationeffektivitetsvinster av muterade samlingar eller i en storskalig RNAi skärmar. Ribosomen profilering är en teknik som drar nytta av nästa generations sekvensering för att kart RNA-fragment som skyddas av ribosomer (ribosom fotspår) engagerade i proteinsyntesen 24,25. I denna teknik kan ribosom sloka inhiberas med cykloheximid (reversibel) eller emetin (irreversibel) följt av cell-lys och RNas digerering för att ge en population av ribosom fotspår. Ribosomer berikas, total RNA isoleras, och förorenar ribosomal och mitokondriell ribosomalt RNA avlägsnas.RNA fotavtryck av ca 26-28 nukleotider är isolerade, omvänd transkriberas, omvandlas till ett cDNA-bibliotek och sekvens 26. Till skillnad från standard polysom profilering, detta tillvägagångssätt inte bara identifierar specifika mRNA som translation regleras utan även ger mRNA-specifik information vid kodon upplösning som den exakta ockupationen och täthet av ribosomer längs en specifik transkript. Detta är särskilt intressant för mRNA med särskilda former av översättning, såsom IRES-härbärgerar mRNA, eftersom det kan ge mer information om var på avskriften ribosomen-rekryteringen sker.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Gradient Master 108 automated gradient maker | BIOCOMP | 107-201M | |
Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker | LABCONCO | 4517000 | |
Beckman Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model # L-100-XP | |
Density gradient fractionator | TELEDYNE ISCO | 69-3873-246 | Composed of: tube piercing system, peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector |
WinDaq data acquisition software | DATAQ INSTRUMENTS | WINDAQ/LITE | http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm |
Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14×89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | |
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) | DiaMed | PRE1900-N | |
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) | SafeSeal | 12000 | |
Sucrose (nucleases-free) | Calbiochem | 573113 | MW = 342.3 g/mol |
Cycloheximide | SIGMA | C7698 | MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing. |
Sodium chloride (nucleases-free) | OmniPur | 7710 | MW = 58.44 g/mol |
MgCl2.6H2O (nucleases-free) | OmniPur | 5980 | MW = 203.3 g/mol |
Tris Base (nucleases-free) | J.T. Baker | 4109-01 | MW = 121.14 g/mol |
Triton X-100 | OmniPur | 9400 | Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation |
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2515 | |
RNaseZap Rnase inactivation solution | Ambion, Life Technologies | AM9780 | |
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen, Life Technologies | AM9516 | |
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion, Life Technologies | AM9722 | Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion |