En metode ble utviklet for å direkte utlede humane nevrale stamceller fra hematopoetiske progenitorceller anriket fra perifere blodceller.
Menneskelig sykdom spesifikke nevronale kulturer er avgjørende for å generere in vitro modeller for menneskelige nevrologiske sykdommer. Reiser imidlertid mangel på tilgang til primære menneskelige voksen nevrale kulturer unike utfordringer. Den siste utviklingen i induserte pluripotente stamceller (IPSC) gir en alternativ tilnærming til å utlede nevrale kulturer fra hudfibroblaster gjennom pasientspesifikk IPSC, men denne prosessen er arbeidskrevende, krever spesiell kompetanse og store mengder ressurser, og kan ta flere måneder. Dette forhindrer den brede anvendelsen av denne teknologien til studiet av nevrologiske sykdommer. Å overvinne noen av disse problemene, har vi utviklet en metode for å utlede nevrale stamceller direkte fra voksent menneske perifert blod, utenom IPSC avledning prosessen. Hematopoetiske progenitorceller anriket fra et voksent menneske perifert blod ble dyrket in vitro og transfektert med Sendai-virus-vektorer inneholdende transkripsjonsfaktorer Sox2, oktober3/4, Klf4, og c-Myc. Transfeksjon resulterer i morfologiske forandringer i cellene som er videre valgt ved hjelp av human neurale stamcellemedium inneholdende basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF). De resulterende celler som er kjennetegnet ved ekspresjon for neural stamcelle markører, slik som nestin og SOX2. Disse nevrale stamceller kan bli ytterligere differensiert til nevroner, astroglia og oligodendrocytter i spesifisert differensiering media. Ved hjelp av lett tilgjengelige humane perifere blodprøver, kan denne fremgangsmåte benyttes til å utlede neurale stamceller for ytterligere differensiering til nerveceller in vitro for modellering av nevrologiske sykdommer og kan videre studier relatert til patogenesen og behandling av disse sykdommer.
In vitro neuronale kulturer har blitt brukt som et viktig verktøy for studier av nevrologiske sykdommer. Primær dyr (for det meste gnager) nevrale kulturer 1, 2 og menneske nevrale cellelinjer som stammer fra hjernesvulst eller andre svulster er den mest brukte i slike studier. Imidlertid har det blitt erkjent at det er betydelige forskjeller mellom gnagere og humane celler. Mange funn basert på gnagere kan ikke oversettes til mennesker. Videre, med den raske utviklingen innen analysere masse genomisk informasjon og relativt enkelt gen redigering og hele genomsekvensering, er mer og mer rettet til å oppdage sykdomsutsatte gener og opptegning sine funksjoner og roller i spesifikke sykdommer, noe som gjør de få menneske nevronale trenden cellelinjer har bare begrenset bruk. Teoretisk humane primære nevrale kulturer som stammer fra prøver av pasienten nervesystemet er det beste valget, men de er umulig å oppnå; dermed alternativ methODS er nødvendig. De siste årene har enkelte tilnærminger blitt forfulgt, med to blir det mest synlig. Etter utviklingen av teknikken med å generere induserte pluripotente stamceller (IPSC) ved hjelp av mus og humane somatiske celler 3, 4, kan nevrale celler bli ytterligere differensiert fra dem 5-7. Men å generere og karakter IPSC krever intensiv arbeidskraft, teknikker og tid innspill, noen ganger også uoverkommelig. Kort tid etter ble en annen tilnærming utviklet til direkte forvandle nevronale celler fra somatiske celler 8, 9. Som de resulterende neuroner er ikke-proliferativ, begrenser det dens anvendelse i intensive studier og medikamentscreening, noe som krever en stor mengde celler. For å ta fordelene av både teknikker, direkte avledning av nevrale stilk / stamceller fra somatiske celler har blitt utforsket av flere grupper 10-12, som omgår den kjedelige prosessen med IPSC generasjon og karakterisering men fortsatt provides et anstendig antall nevrale stamceller for senere nevrale differensiering. Vi har tidligere vist at etter innføring av Yamanaka transkripsjonsfaktorer i hematopoetiske progenitorceller, neurale stamceller kan bli direkte dannet ved anvendelse av en neural stamceller velge medium 13. Her rapporterer vi metoden i detalj.
En detaljert protokoll for direkte å produsere neurale stamceller fra perifert hematopoetiske stamceller er gitt.
Sammenlignet med fibroblastceller, er humant perifert blod mer tilgjengelige. Ved hjelp av den fremlagte protokoll, mer enn 1 x 10 5 hematopoietiske stamceller, eller CD34-positive celler, kan anrikes fra 10 ml fullblod. Selv om forurensning med blodplater er vanligvis ikke forebygges, kan det være lett reduseres ved lavere hastighet sentrifugering, og det ikke forst…
The authors have nothing to disclose.
The authors have no conflicts of interest to disclose.
Material List | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Lymphocyte Separation Medium | Lonza | 17-829E | 1 X |
SepMate | Stemcell Technologies | 15415 | 15 mL |
Human Serum | Invitrogen | 34005-100 | |
Antibiotics | Gibco | 15240-062 | 1% |
CD34 MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-056-701 | |
EDTA | Cellgro | 46-034-Cl | 2mM |
MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
StemSpan SFEM Medium | Stemcell Technologies | 9650 | 1X |
IMDM | Quality Biologicals | 112-035-101 | 1X |
TPO | Peprotech | 300-18 | 100 ng/mL |
Flt-3 | Peprotech | 300-19 | 100 ng/mL |
SCF | Peprotech | 300-07 | 100 ng/mL |
IL-6 | Peprotech | 200-06 | 20 ng/mL |
IL-7 | Peprotech | 200-07 | 20 ng/mL |
IPS Sendai Reprogramming Kit | Life technologies | A1378001 | |
Cell scraper | Sarstedt | 83.183 | |
DMSO | Sigma | D2650 | |
CryoTube vials | Thermo | 368632 | |
Mr. Frosty container | Thermo | 5100-0001 | |
DMEM/F12 | Life technologies | 12400-024 | 1X |
N2 supplement | Life technologies | 17502-048 | 1X |
Bovine serum albumin | Sigma | A2934 | 0.1% (w/v) |
bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/ml |
EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
B27 supplement | Life technologies | 17504-044 | 1X |
NSC serum free medium | Life Technologies | A1050901 | 1X |
Poly-D-lysine/laminin coated cover slips | BD Bioscences | 354087 | |
cAMP | Sigma | A9501 | 300 ng/ml |
Vitamin C | Sigma | A0278 | 0.2 mM |
BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml |
GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | 1X |
PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | 10 ng/ml |
NT-3 | Peprotech | 450-03 | 2 ng/ml |
Shh | Peprotech | 1314-SH/CF | 2 ng/ml |
T3 | Sigma | T6397 | 3 nM |
PFA | Sigma | P6148 | 4% |
PBS | Quality Biological | 119-069-101 | 1X |
Goat serum | Sigma | G9023 | 4% |
TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
Mouse monoclonal anti-Nestin | Millipore | AB5922 | 1:1000 dilution |
Anti-SOX2 antibody | Applied Stemcell | ASA0120 | Ready to use |
Mouse anti-βIII-tubulin antibody | Promega | G712A | 1:1000 dilution |
Rabbit anti-GFAP antibody | Sigma | G4546 | 1:100 dilution |
Anti-O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | IgM; 1 ng/ml |
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody | Life techniologies | A11012 | 1:400 dilution |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Life techniologies | A11001 | 1:400 dilution |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Life techniologies | A21042 | 1:250 dilution |
DAPI | Sigma | D9542 | 1 ug/ml |