Summary
שיטה פותחה לנובעת באופן ישיר בתאי גזע עצביים אנושיים מתאי אבות היווצרות הדם מועשרים מתאי דם היקפיים.
Abstract
תרבויות עצביות ספציפיות מחלות של בני אדם הן חיוניות ליצירת מודלים במבחנה למחלות נוירולוגיות אנושיות. עם זאת, היעדר הגישה לתרבויות עצביות מבוגר אנושי ראשוניות מעלה אתגרים ייחודיים. ההתפתחויות האחרונות בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSC) מספקת גישה חלופית לנובעות תרבויות עצביות מfibroblasts העור באמצעות iPSC הספציפי מטופל, אך תהליך זה הוא עבודה אינטנסיבית, דורש מומחיות מיוחדת וכמויות גדולות של משאבים, ויכולות לקחת כמה חודשים. זה מונע את היישום הרחב של טכנולוגיה זו לחקר מחלות נוירולוגיות. כדי להתגבר על חלק מבעיות אלה, פיתחנו שיטה להפקת תאי גזע עצביים ישירות מהדם היקפי מבוגר אנושי, תוך עקיפת תהליך גזירת iPSC. תאי אבות היווצרות הדם מועשרים מהדם היקפי אדם הבוגר היו בתרבית במבחנה וtransfected עם וקטורי וירוס סנדאי המכילים Sox2 גורמי תעתיק, אוקטובר3/4, Klf4, ו- c-Myc. תוצאות transfection בשינויים מורפולוגיים בתאים שנבחרו עוד יותר על ידי שימוש במדיום עצבי אנושי המכיל גורם בסיסי צמיחת פיברובלסטים (bFGF) וכלי דם גורם אנדותל צמיחה (VEGF). התאים וכתוצאה מכך מאופיינים בביטוי לסמנים של תאי גזע עצביים, כגון nestin וSox2. תאי גזע העצביים אלה יכולים להיות מובחנים נוספים לתאי עצב, astroglia וoligodendrocytes בתקשורת בידול שצוינה. שימוש בדגימות דם נגיש אנושיות היקפית, שיטה זו יכולה לשמש כדי להפיק תאי גזע עצביים להבחנה נוספת לתאים עצביים לדוגמנות במבחנה של הפרעות נוירולוגיות ועשויה לקדם מחקרים הקשורים להיווצרות המחלה והטיפול במחלות אלה.
Introduction
במבחנה תרבויות עצביות כבר בשימוש ככלי בסיסי ללימודים של מחלות נוירולוגיות. בעלי החיים עיקריים (בעיקר מכרסמים) תרבויות עצביות 1, 2 ושורות תאים עצביות בבני אדם מתוך גליומות או גידולים אחרים הם שימוש נפוץ ביותר במחקרים מסוג זה. עם זאת, זה כבר הכיר בכך שיש הבדלים משמעותיים בין מכרסמים ותאים אנושיים. ממצאים רבים המבוססים על מכרסמים לא יכולים להיות מתורגמים לבני אדם. יתר על כן, עם ההתפתחויות מהירות בניתוח מידע גנומי המוני ועריכת גן קלה יחסית ורצף הגנום כולו, המגמה היא יותר ומכוון יותר לגילוי גנים נוטים מחלה והתוויית הפונקציות ותפקידיהם במחלות ספציפיות, מה שהופך את עצבי האנושיים כמה שורות תאים שרק מוגבלות שימוש. באופן תיאורטי, תרבויות עצביות עיקריות בבני אדם מתוך דגימות של מערכת עצבים מטופל הן הבחירה הטובה ביותר, אבל הם בלתי אפשריים להשיג; ספיד מכאן חלופיods נחוץ. בשנים האחרונות, כמה גישות כבר רדפו, עם שני להיות המובחנים ביותר. בעקבות הפיתוח של הטכניקה של תאים לייצר מושרה pluripotent גזע (iPSC) עכבר באמצעות תאים סומטיים ואדם 3, 4, תאים עצביים יכולים להיות מובחנים נוסף מהם 5-7. עם זאת, יצירה ואפיון iPSC דורשת עבודה אינטנסיבית, טכניקות, וקלט זמן, לפעמים אפילו להחריד. זמן קצר לאחר, גישה אחרת פותחה כדי להפוך ישירות תאים עצביים מהתאים סומטיים 8, 9. כתאי עצב וכתוצאה מכך הם אינם שגשוג, הוא מגביל היישום שלה בלימודים אינטנסיביים והקרנת סמים, אשר דורשת כמות גדולה של תאים. לקחת את היתרונות של שני השיטות, הגזירה ישירה של גזע עצבי / תאי אב מהתאים סומטיים נחקרו על ידי מספר קבוצות 10-12, שעוקפת את התהליך מייגע של דור iPSC ואפיון אבל עדיין provides מספר מכובד של תאי גזע עצביים לבידול עצבי מאוחר יותר. הראינו בעבר כי בעקבות כניסתה של גורמי שעתוק יאמאנאקה לתאי דם, תאי גזע עצביים יכולים להיות שנוצרו ישירות באמצעות תא עצבי בחירה בינונית 13. כאן, אנו מדווחים על השיטה בפירוט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תאי ההעשרה של Hematopoietic אב מהדם כל מבוגרים
יכולים להיות מטוהרים ותאי Hematopoietic או CD34 + תאים מהתאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) נגזרים ממגוון רחב של מקורות, כולל דם טבורי, חומר leukapheresis וכל דם תוך שימוש בשיטות המבוססות צנטריפוגה שיפוע צפיפות: הערה. השיטה הרשומה כאן משתמשת בדם כל כדוגמא.
- בידוד של PBMCs מדם מלא:
- להוסיף 4.5 מיליליטר של מדיום הפרדת הלימפוציטים לצינור SepMate ידי pipetting דרך החור של הכנס המרכזי.
- לדלל את דגימת הדם עם נפח שווה של DPBS סטרילי המכיל 2% בסרום אדם (V / V). לדוגמא, לדלל 5 מיליליטר של מדגם עם 5 מיליליטר של 2% בסרום אנושי DPBS +.
- הוסף את המדגם בדילול מלא על ידי pipetting אותו הצד של הצינור. דואג ללא לשפוך המדגם ישירות דרך החור המרכזי.
- צנטריפוגה ב1,200 XG במשך 10 דקות ב RT.
- מוציא בזהירות את supernatant מעל שכבת PMBC.
- לאסוף את שכבת PBMC (מעונן) לתוך צינור חדש.
- הוסף 15 מיליליטר של של Dulbecco מלוח (DPBS) שנאגרו-פוספט המכיל 2% בסרום אנושי לתוך הצינור ו צנטריפוגות ב XG 150 עבור 10 דקות ב RT עם הבלם מ.
- בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 15 מיליליטר של DPBS המכיל 2% בסרום אנושי. לספור את מספר התאים.
- צנטריפוגה ב690 XG במשך 10 דקות ב RT. הסר את כל supernatant מהצינור.
- תאי Resuspend ב 1 x 10 7 תאים לכל 15 מיליליטר של המדיום (IMDM) השתנה Dulbecco של Iscove המכיל אנטיביוטיקה 1% (v / v) ו -10% בסרום אדם (V / V).
- דגירה התאים O / N ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור לפני שבודד תאי CD34 +.
- בחירה חיובית של CD34 + תאים מPBMCs באמצעות CD34 MultiSort ערכה:
הערה: עבודה מהירה ולהשתמש בפתרונות מקוררים מראש כדי להפוך לתאים קרים ולמנוע מכסתנוגדנים על פני התא ותיוג תא שאינו ספציפי להוראת הערכה.- לאסוף את כל PMBCs בשפופרת 50 מיליליטר ולספור את מספר התאים הכולל במדיום.
- צנטריפוגה התאים XG ב 300 במשך 10 דקות. הסר את כל supernatant לחלוטין.
- Resuspend עד 10 8 תאים לכל 300 μl במאגר חרוז (DPBS המכילים 0.5% בסרום אדם (V / V) ו- 2 mM EDTA).
- הוספה של מגיב חסימת FCR 100 μl ולהוסיף של MultiSortMicroBeads CD34 100 μl.
- מערבבים היטב דגירה למשך 30 דקות במקרר (2 - C ° 8).
- לשטוף את התאים על ידי הוספת 2 מיליליטר של חיץ חרוז לכל 10 8 תאים ו צנטריפוגות ב XG 300 עבור 10 דקות ב RT. הסר supernatant לחלוטין.
- Resuspend עד 10 8 תאים ב 500 μl של חיץ.
- הנח MACS LS עמודה בשדה המגנטי של מפריד MACS ולהכין טור על ידי שטיפה עם 3 מיליליטר של חיץ חרוז.
- החל השעיה תא על center של העמודה. תאים ללא תווית יזרמו דרכו ניתן לאסוף אם העדיף.
- טור לשטוף שלוש פעמים עם 3 מיליליטר של חיץ חרוז.
- הסר את העמודה מהמפריד והנח אותו על צינור 15 מיליליטר.
- הוסף 5 מיליליטר של חיץ חרוז על הטור ומייד לשטוף את התאים שכותרתו מגנטית על ידי לחיצה על הבוכנה לתוך הטור.
- הוסף 20 μl של MultiSort שחרור מגיב לכל 1 מיליליטר של השעיה תא. מערבבים היטב דגירה במשך 10 דקות במקרר (2 - C ° 8).
- להוסיף 1-2 מיליליטר של חיץ חרוז לכל 10 7 תאים וצנטריפוגה התאים ב XG 300 עבור 10 דקות ב RT. הסר supernatant לחלוטין.
- תאי Resuspend ב 50 μl של חיץ חרוז לכל 10 7 תאים.
- הוסף 30 μl של MultiSort Stop מגיב לכל 10 7 תאי דגירה במשך 15 דקות במקרר.
- הוסף 5 מיליליטר של חיץ חרוז וצנטריפוגה התאים ב XG 300 עבור 10 דקות ב RT. בטל supernatant.
2. גזירה של גזע תאים המושרה עצביים מן CD34 + תאים
- תרבות CD34 + תאים:
הערה: יש להשתמש במדיום מוכן טרי בתוך 7 ימים שבם אוחסנו במקרר. אובדן תאי CD34 משמעותי יכול להיות שנצפה לאחר 24 שעות, אבל הריבוי המשמעותי של תאים צריך להיות מורגש, במיוחד אחרי יום 5. אם מספר התאים יורד ברציפות או שאין התפשטות, זה מרמז גם איכות גרועה של תאים בינוניים או CD34 ותאים לא צריך לשמש לשלב הבא.- Resuspend ותרבות CD34 תאים + בCD34 שמירה בינוני (מדיום StemSpan SFEM מכיל thrombopoietin האנושי (TPO, 100 ng /, FMS-כמו טירוזין קינאז 3 (FLT-3) ליגנד (100 ng / ml) מיליליטר) ונובע גורם תא (SCF, 100 ng / ml), interleukin-6 (IL-6, 20 ng / ml) וinterleukin-7 (IL-7, 20 ng / ml)) בצלחת 24 גם (עד 3 x 10 5 / גם ב 1 מיליליטר של מדיום בכל טוב) על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור.
- After 24 שעות, לאסוף את התאים הצפים וצנטריפוגה התאים ב 110 XG ב RT להיפטר מכל תאים מצורפים ופסולת תא. בטל supernatant וresuspend התאים 1 מיליליטר של מדיום CD34 שמירה טרי וזרע בצלחת 24 גם חדשה (עד 1 x 10 גם 5 /) על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור במשך 5 ימים נוספים.
- להחליף מחצית בינונית בכל היום האחר על ידי aspirating את החצי העליון של זהירות supernatant תוך CD34 + התאים צפים על החלק התחתון של הבארות (איור 1 א).
- transfection וירוס סנדאי:
- ביום 5, לאסוף תאי CD34 וצנטריפוגה התאים ב 170 XG במשך 10 דקות ב RT. בטל supernatant.
- Resuspend התאים בינוניים טרי ב1 x 10 5 / גם בצלחת 24 גם ב 1 מיליליטר של מדיום.
- להפשיר ערכת תכנות מחדש cytotune-iPS סנדאי ידי הטבילה ראשונה תחתית של הצינורות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 10 שניות ולאחר מכן להפשיר לחלוטיןt RT. בקצרה צנטריפוגות הצינורות ולשים אותם על קרח. מכין את תערובת וירוס סנדאי ידי ערבוב הנפח המומלץ של כל וירוס הרשום בתעודת ניתוח (COA) להרבה המקביל. 15 משרד הפנים מומלץ.
- להוסיף תערובת וירוס סנדאי היטב בכל תאי CD34. מערבבים את הבארות בעדינות על ידי רועד. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור.
- שים לב ליעילות transfection לאחר 24 שעות. שים לב שאגרגטים תא והיווצרות כדור הם אינדיקטורים לtransfection המוצלח (איור 1).
- לשנות מחצית בינונית על ידי העברה בזהירות את החלק העליון של המדיום למשנהו גם. אם יש תחומים תא בבאר החדשה, להוסיף את אותה הכמות של מדיום חדש.
- שנה בינונית כל היום האחר על ידי חזרה על שלב 2.2.6.
- אינדוקציה של תאי גזע עצבי:
הערה: בהתאם לתנאי תא, על 5 או 7 ימים לאחר transfection, תאים חסיד monolayer יגיעו 30 -מפגש 50% (איור 1 ג).- הסר את supernatants המכיל תאים ותחומים צפים ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר של מדיום עצבי (הנשר בינוני השתנה Dulbecco: תערובת מזין F-12 (DMEM / F12), המכיל תוספת 1x N2, 0.1% (w / v) אלבומין בסרום שור ( BSA), 1% (v אנטיביוטיקה / v), 20 ng / ml של גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF), ו -20 / מיליליטר ng של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF)) לתאים חסיד.
- לחלופין, לנתק את תחומי תא על ידי pipetting בעדינות וצנטריפוגה התאים ב 170 XG במשך 10 דקות. הסר את supernatant ו resuspend התאים ב 1 מיליליטר של מדיום עצבי בצלחת 24 גם חדשה מצופה בmatrigel להוראה כגיבוי.
- לשנות את המדיום בכל יום אחר עד התאים להגיע ל -60 - 80% ומחוברות, בדרך כלל לאחר השבוע 1.
- בטל supernatant ולהוסיף 1 מיליליטר של מדיום תא גזע עצבי (בינוני בסרום חופשי, המועצה לביטחון לאומי SFM). לנתק את התאים באמצעות מגרד תא ואחריעל ידי pipetting עדין מאוד.
- הסר את תאי זרע ואת כולם לטוב אחד של צלחת 6-היטב. הוסף 1 מיליליטר נוסף של מדיום בתאי גזע עצבי לעשות 2 מיליליטר תקשורת לכל אחד. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור.
- שנה בינונית כל היום האחר.
- כאשר תאים הגיעו מפגש 60%, לנתק וreplate התאים ב 1: 3 יחס ביצוע השלבים ב2.3.4 ו2.3.6.
- הקפאה של תאי גזע עצביים:
- הכן תאי גזע עצביים הקפאה בינונית על ידי הוספת 20% sulfoxide דימתיל (DMSO) לתוך המדיום בתאי גזע העצבי. שמור את מדיום ההקפאה על קרח.
- לנתק את התאים בצלחת 6-היטב, באמצעות מגרד תא ואחריו בעדינות pipetting. ספירת התאים. צנטריפוגה התאים ב 170 XG במשך 10 דקות ב RT. בטל supernatant.
- Resuspend התאים בינוניים בתאי גזע עצבי ב1 x 10 6 / מיליליטר. להוסיף את אותו הנפח של הקפאה בינונית לתאים.
- הוסף 1 מיליליטר (5 x 10 5 תאים בסך הכל) של תאים בcryovial. להקפיא את התאים באמצעות מיכל הקפאת מר Froster הבא ההוראות.
3. התמיינות תאים עצבית
- בידול תאים עצבי:
- כאשר תאי גזע עצביים להגיע 80 מפגש%, לנתק את תאי גזע העצביים באמצעות שוטר גומי ולאחר מכן לנתק ידי pipetting בעדינות.
- ספירת התאים ולהתאים את הריכוז עד 1 x 10 5 / מיליליטר במדיום בתאי גזע עצבי.
- להבחנה עצבית, צלחת התאים על כריכת פולי-D ליזין / laminin מצופה מחליק בצלחות 24 גם ב1 x 10 5 / טוב. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור.
- החלף את המדיום עם מדיום בידול עצבי (DMEM / F12 מכיל תוספת 1x N2, תוספת 1x B27, 300 ng / ml cAMP, ויטמין C 0.2 מ"מ, 10 מוח ng / ml נגזר גורם neurotrophic (BDNF) ו- 10 ng / ml תא גליה נגזר גורם neurotrophic (GDNF)) after 24 שעות. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור.
- שנה בינונית בידול עצבי פעמיים בשבוע במשך 2 שבועות.
- בידול Astroglial:
- לנתק את תאי גזע העצביים על ידי pipetting.
- ספירת התאים ולהתאים את ריכוז התאים 5 x 10 4 תאים / מיליליטר. זרעי התאים על 24 גם צלחות. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור.
- החלף את המדיום עם DMEM / F12 עם 10% בסרום שור עוברי (FBS) ודגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור.
- שנה בינונית פעמיים בשבוע במשך 2 שבועות. אם תאים מגיעים למפגש לפני 2 שבועות, replate התאים הבאים 3.2.1 צעדים ו3.2.2.
- בידול oligodendrocyte:
- לנתק את תאי גזע העצביים על ידי pipetting.
- ספירת תאי הזרע ו1 x 10 5 תאים על 24 גם צלחות מצופים poly-L-ornithine ב 1 מיליליטר של differenti oligodendrocyteבינוני ation בהיקף של DMEM / F12 מכיל תוספת N2, 10 / מיליליטר ng של טסיות דם גורם-AA נגזר צמיחה (PDGF-AA), 2 / מיליליטר ng של neurotrophin-3 (NT-3), 2 / מיליליטר ng של סוניק קיפוד ( ששש), ו -3 ננומטר של triiodothyronine (T3). דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור.
- שנה בינונית פעמיים בשבוע במשך 2 שבועות.
- החלף את המדיום עם DMEM / F12 עם תוספת 1xN2 ו -3 ננומטר של T3 ותרבות התאים לשבוע לייצור המיאלין חלבון בסיסי (MBP) נוסף.
4. Immunofluorescence מכתים
- החלף תקשורת עם paraformaldehyde 4% (PFA). דגירה של 10 דקות ב RT.
- בטל PFA ולשטוף עם PBS המכיל 0.1% Triton X-100 (PBS-T) 3 פעמים, 5 דקות בכל פעם.
- Permeabilize תאים עם PBS המכיל 0.5% Triton X-100 במשך 10 דקות ב RT.
- חסום את התאים עם PBS-T המכיל 4% עזים בסרום במשך 20 דקות ב RT.
- דגירה התאים עם antibo העיקרי מקבילמת מדולל PBS-T המכיל BSA 0.1% עבור שעה 2 ב RT או O / N בחדר קר.
- שוטף את התאים 3 פעמים עם PBS-T, 5 דקות בכל פעם. דגירה התאים עם נוגדנים משני מתאים בשילוב עם fluorochrome באמצעות 1: 400 דילול ב PBS-T המכיל BSA 0.1% עבור שעה 1 על שייקר בחושך.
- לשטוף את התאים עם PBS-T המכיל 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) במשך 10 דקות ב RT.
- לשטוף את התאים עוד פעמיים עם PBS-T במשך 5 דקות כל אחד ב RT.
- שים לב לתאים שכותרתו באמצעות מיקרוסקופ ולצלם תמונות (איור 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
האיכות של תאי CD34 היא קריטית להצלחה של התמרה של תאי גזע עצבי. תאי CD34 באיכות גבוהה להתרבות במהלך כמה ימים של התרבות הראשונה ומופיעים כחסיד עישון, תאים עגולים homogenously, צפים מעל התחתית של כלי תרבות (איור 1 א). תוצאות הזיהום המוצלחות באגרגטים תא, אשר מרחיב לאורך הזמן (איור 1), ואילו אגרגטים תא ספציפיים שאינם עלולים להתרחש במהלך תרבית תאים, המרחיבים ועמותות רופפות. תאים חסיד מופיעים בדרך כלל סביב שלושה עד חמישה ימים לאחר transfection; הם בעיקר הפרעה דו קוטבית ויתרבו לעשות monolayers (איור 1 ג). לאחר בחירה במדיום סלולארי עצבי רוב התאים חסיד הם nestin וSox2 חיובי, אך שלילי Oct4 (איור 2). תאי הגזע העצביים נגרמים יכולים להיות מובחנים נוספות לתאי עצב וגליה (איור 3).
אף אוזן גרון "fo: לשמור-together.within-page =" תמיד ">
איור 1. שינויים מורפולוגיים של תאי CD34 לאחר transfection וירוס סנדאי. () מספר משמעותי של תאי CD34 ניתן לצפות בזמן transfection. (ב) כדור כמו אגרגטים תא ניתן להבחין 24 שעות לאחר transfection וירוס סנדאי אשר מרחיב במהלך הזמן. תאים חסיד בעיקר דו-קוטביים (C) הופיעו לאחר 5 ימים של transfection. (D ו- E) מורפולוגיות אופייניות של תאי גזע עצביים מוצגים לאחר אינדוקציה עם מדיום עצבי והתרחבות. בר סולם:. 200 מיקרומטר ל() ו- (B), 400 מיקרומטר לאחרים אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הין-page = "תמיד"> 
תאי גזע עצבי איור 2. מושרים להביע סמני תא גזע עצביים. תאי גזע עצביים להביע nestin וSox2 אבל לא Oct4. בר סולם:. 200 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. בידול תאי גזע עצבי. תאי הגזע העצביים עלולים להיות מובחנים לתאים עם סמן עצבי (), GFAP astroglial הסמן (B), וסמני oligodendrocyte O4 (C). בר סולם:. 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול מפורט ליצירת תאי גזע עצביים ישירות מתאי hematopoietic היקפיים מסופק.
בהשוואה לתאים פיברובלסטים, דם היקפי אדם הוא נגיש יותר. תוך שימוש בפרוטוקול שהוצג, יותר מ 1 x 10 5 תאי דם, או תאים חיוביים CD34, יכול להיות מועשר מ 10 מיליליטר של דם מלא. למרות זיהום עם טסיות דם הוא בדרך כלל לא ניתנים למניעה, זה יכול להיות מופחת בקלות על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה וזה לא מפריע לדור בתאי גזע עצבי. עם זאת, האיכות וכמות תאי CD34 יקבעו את הייצור הסופי של תאי גזע עצביים. האיכות של תאי CD34 יכולה להישפט על ידי בערך התגובה שלהם למדיום תרבות CD34. תשובה חיובית, כלומר התפשטות מהירה של תאי CD34 במדיום, היא קריטית לשינוי המוצלח מאוחר יותר. אם תאי CD34 לא הצליחו להתרבות, או אפילו לעבור אובדן תא משמעותי, אז transfoדעו יהיה קשה, וכתוצאה מכך תאים פחות שגשוג. כך הוא הציע להתחיל שינוי עם תאי CD34 באיכות טובה בלבד. למרות 1 x 10 5 תאי CD34 מספיק לחוקר מנוסה, 3 x 10 5 תאים עשויים לשמש בתור התחלה.
באמצעות וירוס סנדאי מספק שאינה אינטגרציה, מאוד יעיל ונוח להציג גורמי תעתיק לתוך תאי מיקוד 14, 15. שימש במקור ליצירת iPSC, גורמי יאמאנאקה היו גם בהצלחה משמשים ליצירת תאי גזע עצביים ישירות מfibroblasts 11. בדוח קודם באמצעות הפרוטוקול שהוצג, וירוס סנדאי המכיל גורמי יאמאנאקה יכול לשמש גם כדי לייצר תאי גזע עצביים מהדם טבורי או תאי דם בוגרים היקפיים hematopoietic. בהשוואה לשימוש בביופסיה של עור לculturing fibroblasts, דם הוא נגיש יותר ונוח להגיע. חוץ מזה, הוא דיווח כי אבות היווצרות הדםתאים גם להביע סמנים ספציפיים עצביים מסוימים 16, מה שהופך אותו לבחירה טובה יותר ליצירת תאי גזע עצביים. למעשה, לאחר זיהום בנגיף סנדאי, רוב תאי monolayer המצורפים הביע nestin, סמן תאי גזע עצבי, מלבד המושבות קומפקטיות מצטברות יותר, שחלקם עלול לגרום לiPSC בנקודת זמן מאוחר יותר. כך monolayer המצורף של תאים נאספים וטופחו נוסף במדיום סלולארי עצבי, אשר כבר בשימוש נרחב בתרבית תאים עצבית העיקרית, כדי להקל על גורל תאי גזע העצבי של התאים.
יש איזון עדין בשמירה על תאי הגזע העצביים. מצד אחד, הוא העדיף שהתאים יש יכולת טובה יותר ומשגשגת להיות passaged פעמים רבות ככל האפשר. מצד השני, את הקלות של הבחנתם לתאי עצב היא גם קריטית. שני כלי תקשורת שונות משמשים כדי להשיג את האיזון הזה. בינוני העצבית בשימוש נרחב נבחר לneural נובע אינדוקציה / בחירת זהות תא, שהוא התהליך הקריטי במקום הראשון. גם זה יכול לשמש במעברים מאוחר יותר כדי לחזק את יכולות הבחנה עצביות. עם זאת, בתאי הגזע העצביים הם מאוד שבירים ורגישים, כך שחשיפה ממושכת למדיום סלולארי עצבי עלולה לעכב באופן משמעותי חלוקה של תאים ולגרום להתמיינות מוגזמת. כך בינוני בתאי גזע עצביים משמש כדי לסייע התאוששות תא וכדי להקל על הרחבת תא. הבינוני העצבי משמש לזירוז עצבי במעבר 1, כאשר התאים הופכים ומחוברות. אם עיכוב מוגזם של שגשוג תאים ורעילות הוא הבחין, יש צורך להחליף את המדיום מוקדם עם תאי גזע עצביים בינוניים. עם זאת, בינוני בתאי גזע עצבי הוא פחות יעיל בבחירה עצבית; כך לאורך זמן, במיוחד עם מעל מחוברות תאי גזע או passaging עיכוב עצבי, זיהום עם תאים או חוסר ההבחנה עצבית שאינם עצביים יכול להתרחש. כך התאים צריכיםלהיות passaged באופן קבוע, כאשר ומחוברות פחות מ -60% ולפחות פעם בשבוע. בחירה עצבית עם מדיום סלולארי עצבי אפשרית במעברים מאוחר יותר להקים מחדש את הזהות העצבית. גורם נוסף שמשפיע על stemness של תאי גזע העצביים הוא הציפוי של צלחות תרבית רקמה. ציפוי עם matrigel או poly-D- ליזין יכול לעזור מצורף תא בהתחלה במקרה התאים קשים לצרף במהלך replating. אבל חשיפה ארוכת טווח לתוצאות הציפוי במספרי מעבר פחות. סיבה לכך הוא הציפוי משפר את תהליך התמיינות התאים, ועלול לגרום ליותר נזק לתאים במהלך ניתוק.
כסיכום, פרוטוקול זה משמש וירוס סנדאי המכיל גורמי יאמאנאקה לנובעים באופן ישיר בתאי גזע עצביים אנושיים בתוך 3-4 שבועות מתאי hematopoietic מבוגרים המתקבלים מדגימות דם היקפיים נגישות. תאי הגזע העצביים יכולים להיות מובחנים נוספות לתאי עצב וגליה. שיטה זו עוקפתתהליכי דור iPSC ארוכים ומסובכים המשמשים כיום ועשויים לשמש במבחנת דוגמנות תא תרבות להפרעות נוירולוגיות שונות, אשר עשויים טובים יותר לייצג את ההבדלים הגנטיים בהפרעות ספציפיות, במיוחד מדגימות מטופל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte separation medium | Lonza | 17-829E | 1x |
| SepMate | Stemcell Technologies | 15415 | 15 ml |
| Human serum | Invitrogen | 34005-100 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | 1% |
| CD34 MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-056-701 | |
| EDTA | Cellgro | 46-034-Cl | 2 mM |
| MACS LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| StemSpan SFEM medium | Stemcell Technologies | 9650 | 1x |
| IMDM | Quality Biologicals | 112-035-101 | 1x |
| TPO | Peprotech | 300-18 | 100 ng/ml |
| Flt-3 | Peprotech | 300-19 | 100 ng/ml |
| SCF | Peprotech | 300-07 | 100 ng/ml |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | 20 ng/ml |
| IL-7 | Peprotech | 200-07 | 20 ng/ml |
| IPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378001 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| CryoTube vials | Thermo | 368632 | |
| Mr. Frosty container | Thermo | 5100-0001 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12400-024 | 1x |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2934 | 0.1% (w/v) |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/ml |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 1x |
| NSC serum free medium | Life Technologies | A1050901 | 1x |
| Poly-D-lysine/laminin coated cover slips | BD Bioscences | 354087 | |
| cAMP | Sigma | A9501 | 300 ng/ml |
| Vitamin C | Sigma | A0278 | 0.2 mM |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | 1x |
| PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | 10 ng/ml |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | 2 ng/ml |
| Shh | Peprotech | 1314-SH/CF | 2 ng/ml |
| T3 | Sigma | T6397 | 3 nM |
| PFA | Sigma | P6148 | 4% |
| PBS | Quality Biological | 119-069-101 | 1x |
| Goat serum | Sigma | G9023 | 4% |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Mouse monoclonal anti-Nestin | Millipore | AB5922 | 1:1,000 dilution |
| Anti-SOX2 antibody | Applied Stemcell | ASA0120 | Ready to use |
| Mouse anti-βIII-tubulin antibody | Promega | G712A | 1:1,000 dilution |
| Rabbit anti-GFAP antibody | Sigma | G4546 | 1:100 dilution |
| Anti-O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | IgM; 1 ng/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody | Life techniologies | A11012 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Life techniologies | A11001 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Life techniologies | A21042 | 1:250 dilution |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 μg/ml |
References
- Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941 (2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington's Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).
- Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
- Lee, S. -T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801 (2011).
- Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
- Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720 (2013).
- Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
- Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).
