离体肺灌注(EVLP)已获准在人体肺移植变得更容易获得通过使评估机构,扩大捐助池的能力。在这里,我们描述了鼠EVLP方案和改进,允许未来扩展可再现模型的发展。
可用于肺移植接受供体肺的数量是非常有限的,由于质量差。 离体肺灌注(EVLP)已获准在人类肺移植变得更容易获得通过使评估机构,扩大捐助池的能力。作为这种技术的扩展和改进,以潜在地评估和改进不合肺移植前的质量的能力是一个重要的需求。为了更严格地评估这些方法中,一个再现的动物模型需要建立将允许对改进的技术测试捐赠肺部和管理,以及对肺移植接受者。此外,相关的病状, 例如一个EVLP动物模型中,通气性肺损伤(VILI),将提供一种新的方法,以评价对这些疾病的治疗方法。在这里,我们描述了一个大鼠肺EVLP程序和改进的发展,这个我的ThOD允许用于将来扩展的可重现模型。我们还描述了本EVLP系统的应用建模VILI大鼠肺部。我们的目标是提供研究界提供关键信息和“珍珠智慧”/技术,出现了从试验和错误,并建立一个EVLP系统,强大的和可重复性的关键。
临床意义
目前可供移植的肺合适的,只有19%的肺能够在全国范围内利用导致旷日持久的等待列表的时间或死亡患者等待移植1的缺乏。这种短缺可能是因为年龄大捐助者,外伤,感染,多系统器官功能衰竭和收获2时,有时受伤供体肺。此外,肺是胸腔和标准的运输和保存技术以外的体弱器官可导致劣化和非存活肺部。因此,维持和改善肺活力的前体最近成为肺移植医学的一大重点。
离体肺灌注(EVLP)
离体肺灌注(EVLP)已发展到持续灌注器官正在评估移植,使一个时期的评估,所有OWS肺复苏或再生的潜力。 EVLP可以延长的总出身体器官缺血时间,并允许捐赠器官前往更远的距离3。典型地,肺部通气,在30%50%总的肺容量或20 水柱与吸入氧的一小部分的峰值气道压力(氧合指数2)70%的4。保存溶液灌注在40-60毫升/公斤(100毫升/公斤预测心输出量的大约40%)在人类和大型动物5,6,但灌注在20%左右的心输出量为大鼠7。列入STEEN解决方案使人体肺部在RT环境无肺水肿9开发旅游。这种开拓性的工作已经细化了多伦多大学的肺移植计划10-13,并正在评估边际供体肺移植14,15改善的评估。然而,最优ventilatio以再生边缘和/或低于标准的肺移植需要n和灌注条件是未知的,目前是一个活跃的研究领域。
隔离肺灌注系统已被用于在小动物引起的肺损伤,重新创建呼吸道疾病,并灌注以不同的解决方案的肺部,以防止缺血损伤。研究者已经通过使用分离的肺灌注系统以模仿,可以在人类和较大的动物16-18中使用的EVLP协议创建的肺移植的小动物模型。然而,该实验模型具有关于用于模拟人体生理学的各种技术和参数许多挑战。特别是,有许多微妙之处EVLP过程中保持肺的可行性。这些细微之处可能发生由于在收割技术中,正压通气设置,灌注液的组成和流动条件和肺的插管的差异。疗法安伏,这里的目标是提供研究界与一些,我们已经发现导致了可靠的方法用于在啮齿动物模型实施EVLP故障排除和执行提示。
系统监控
看什么东西的时候试验运行良好,如:
一旦插管已经置于电路和肺部换气,有多种方法,以确保正常工作的系统。应该有整个管道无渗漏灌流液。肺血管阻力(PVR)应保持相对恒定(假设恒定的流量)。氧气交换应增加一次呼吸机工作正常,扩大肺部招募更多的肺泡进行气体交换。 图12a显示适当通风和灌注连接到EVLP电路人工胸廓内肺。
看什么东西的时候实验没有运行良好,如:
有迹象表明,曾发生过程中EVLP实验的开始阶段率最高的一些常见问题。第一个和最简单吨Ø补救措施是在该行从肺部排出泄漏。此下电路,并在贮存器的水平不断下降的部分是由灌流池的池引人注目。检查并拧紧周围的泄漏区域的任何管接头,检查管本身的泄漏。如果肺之前发生这种泄漏,它也可能会引入气泡进入肺部。这应尽可能快地补救作为气泡在灌注液会导致组织损伤,并导致在PVR一个显著增加。还可以有一个泄漏从肺或套管中的一个的到来。这可能是由一个套管的任一滑动或阻塞在出射线引起压力增加而引起的。检查两个套管,保证既不已经滑落或扭曲的位置。在此过程中,因为在PA压力瞬时增加是一个明显的迹象表明,最近已发生某种障碍物PA的压力也应加以监测。 图12B示出了破裂肺即破裂,由于高的压力。从肺本身甲泄漏也可以由在组织中的撕裂引起的。这个问题可能是也可能不是可修复而是重新定位和重新拧紧套管是在这种情况下的最佳选择。
学习要点/机会:
审判和前体肺灌注系统的错误的发展使我们能够确定我们在这里勾勒,以促进有效实施EVLP系统的几个关键问题。首先,对于采购,但重要的是标准麻醉技术遵循适当麻醉动物(足以麻醉剂,注射入腹膜)和遵守需要所有IACUC策略。插管( 图13中的A,B和C示出),应反复冲洗以除去肺vasculat内的任何凝块和/或碎屑URE。对于动物的选择,我们建议您使用只SD或路易斯大鼠,体重250-350克。应特别注意cannulating大鼠,体重接近至250g由于船只将会更小,因此更难以不损伤脉管到导管插入时可采取。如果小鼠或小鼠模型中,将被使用的,更小的套管可能需要被使用。
气管插管是不是通常的缝合时,首先通过一个丝线缝合后气管解剖周围筋膜和前插管后妥善固定,只要挑战。按照这个与前切口1-2气管环缝合上述通过套管。为了更好的安全性( 图4C)的凹槽内固定配合方形结在气管环之间。与气管插管相比肺动脉(PA)的插管是更具挑战性。下面的步骤在本研究中使用对于此过程。首先,把握心脏先端具一对镊子。通过另一对镊子在横窦和线程的缝合线固定在近端的PA套管。紧接在右心室流出道(RVOT)( 图14A)之前切开右心室。该切口进入RVOT后,套管将朝向肺动脉流出道被引导。具有在肺动脉/主动脉后面位置缝合右ventriculotomy前提高了效率( 图5C)。插管应该固定到位与缝线,以防止脱出。一个主要的并发症可能发生,如果在PA插管是不是在正确的解剖方向。插管可以被插入太远,仅灌注一个分支或成为失当定位在除去从胸腔的心脏 – 肺标本的扭转。这可以很容易地被定向回原来位置,以保持anatomi的适当的角度CAL位置。最后,左心房(LA)插管的过程中最具挑战性的部分。对LA插管需要被放置在左心房内。与组织是非常易碎的,心不使用显著力或扭转以防止肺静脉与左心房这会再进行实验无法挽救内的撕裂。该PA套管的LA插管前,最好放置。阿左ventriculotomy与去除的顶点的已被证明扰乱cordae tendinae并允许通过二尖瓣小叶更容易获得。另外,ventriculotomy可以更容易地扩张和可视化的二尖瓣和通过二尖瓣喂插管。二尖瓣环带一对小钝端皮卡的扩张可以以可视化的道成LA( 图14B)来完成。缝线应插管前,放在背后的心脏。这可以简单地通过使用一对SMAL起吊的心脏向上进行升钝端皮卡和放置下方缝合和整个心脏。洛杉矶是现在可以插管。饲料通过皮卡的LA套管,以正确的可视化安置的套管进入左心房。请特别注意不要打跑套管回左心室。缝线应该然后沿左心室的心肌被紧密地固定。固定缝合到左心房可能阻塞整个或插管的一部分。
在手术过程中,至关重要的是,没有空气留在装置的流入部分。任何显著空气可以产生空气栓塞增加的PVR(有效“空气锁定”),这将导致低得多的灌液流对于给定的压力。的各个点可以用来在系统内除去空气。流出部内的空气被预期并且不应该对肺的任何有害作用。肺动脉高压猪模型已经示重新创建从在8周的时间内连续少量空气的病理。该增加的空气减少的灌注的存在量而引起炎症到周围组织19。
灌注的开始可以发生,一旦插管已完成,但距离LA前的管来连接到EVLP线。灌流应通过运行,以清除任何血块,这灌流可以清空到胸壁没有任何问题。切换灌流泵为手动模式,并缓慢增加流量〜2毫升/分钟允许密切监测PA的压力。压力在20-30 CMH 2 O可以指示障碍物,看的灌流退出LA也是一个指标,但是这可能是很难看到的。如果压力不增加至超过20-30 CMH 2 O,停泵,并重新检查均插管。一旦压力恒定10-20 CMH 2 O允许日Ë灌流液,以2分钟贯穿而进入胸腔。此时距离LA的线可以连接到EVLP电路。灌流泵速度可提高到5-10毫升/分钟。当流体头前进通过电路,将有增加PA的压力,由于增加的流体头部的高度,因此,该静压力。如果流体不能流过的最高点的线,就可能有必要要么施加抽吸力就行的相对端或试图降低线的最高部分。一旦这个问题得到解决,灌流液循环应该没有任何问题。
几个问题应相对于所述呼吸监测。第一,可能会发生支气管/气管和心脏 – 肺位置的扭转如肺部变得更加水肿和重量增大。它对于套管保持在相对紧密的解剖位置,因此改变是重要的一个或两个套管E可以是必要的。压力或体积控制通气机以及正或负通气可用于本EVLP系统。对于大鼠模型中,我们用积极的压力,体积控制的通风效果很好,在4-10之间毫升/千克,并在2-8 CMH 2 O.之间的呼气末压力(PEEP)潮气量发现然而,8 水柱一个PEEP可以在气管的分岔导致可能的破裂。每个实验后(或一组实验,如果进行背到背),通风线通向气管应清洗任何支气管肺泡灌洗(BAL)液,可能已到达了气管。这种液体会变硬,如果保持不变,并可以完全阻塞通风线。
灌注液组合物,是一个成功的EVLP实验的关键。将5%的葡聚糖混合物允许肺灌注即接近生理条件,保持一个稳定的胶体渗透压驱动液BACK插入血管以防止水肿,并防止肺血管内血栓形成。要注意的是一些物种大鼠可以是过敏葡聚糖这可能会导致肺水肿20是很重要的。灌注液中的内容是跨所有实验组一致的在这项研究中,因此,葡聚糖含量不应该是一个混杂因素。的胶体渗透压是具有提高或产生组织水肿的潜在的关键变量。被冷静态存储或常温灌注优化市售灌注液已被用于在本系统中,以增加肺生存能力次。我们注意到,一些这些解决方案包含白蛋白和一个值得关注的是牛血清白蛋白的触发在啮齿动物的肺的炎症反应的可能性。虽然最优灌注液组合物是调查的一个正在进行的课题,灌注液需要考虑的胶体渗透压,渗透压和缓冲能力。 W¯¯Ë建议的溶液可基于修饰的Krebs-Henseleit溶液或细胞培养基。的胶体渗透压应由葡聚糖或白蛋白进行维护,这取决于应用。的灌注压和流量影响器官和超生理灌注参数可以使器官发生机械损伤。
实验过程中视觉指标:
有许多视觉线索,以及从可用于确定是否一个EVLP实验运行良好的实时数据指示。肺将保持在相同的大小和将放气到每次呼吸后相同体积。也将有没有来自肺本身泄漏。的PVR,肺的重量,和遵守将保持相对恒定。氧气产量将保持不变或略有增加。
有些情况下,肺部的实验过程中变得损害了许多视觉上的指标。肺水肿成为一个次在尺寸和重量增长迅速。的肺的变化(从褐色粉红色至白)和液体袋的颜色可以在组织被识别。如果从气压伤或过度扩张气管或肺部破裂,就会有气泡从点伤( 图12B)。氧的生产将减少,并且PVR和遵守将显着增加。
使用小动物的EVLP模型中,诸如啮齿类动物的电位打开门供未来研究改善肺移植的治疗。然而,在小动物模型需要更好地了解真正模仿肺移植。该模型可能在将来被用来改善药物治疗和为将来的肺移植研究确定基线参数。
The authors have nothing to disclose.
笔者要感谢哈佛仪器,尤其是斯蒂芬妮Pazniokas,MS( 生理系统和再生医学)的援助,他们在电路组装,修改和灌注电路XVIVO灌注(丹尼尔·马蒂内利,CCP,CTP)的故障排除帮助提供非临床使用肺plegia。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
IPL-2 Basic Lung Perfusion System | Harvard Apparatus | ||
Tweezer #5 stainless steel, curved 11cm | Kent Scientific Corporation | IND500232 | |
Tweezer #5 Dumostar, 11cm | Kent Scientific Corporation | INS500085-A | |
Tweezer #7 Titanium, 12cm tips curved | Kent Scientific Corporation | INS600187 | |
McPherson-Vannas Scissors 8cm, Str 5mm | Kent Scientific Corporation | INS14124 | |
Vannas Scissors 8cm Str 5mm | Kent Scientific Corporation | INS14003 | |
Instrument Sterilization Tray 5" x 7" | Kent Scientific Corporation | INS800101 | |
Heparin 30,000 units per 30mL | APP Pharmaceuticals | Supplied from OSU Pharmacy | |
Ketamine 500mg per 5mL | JHP Pharmaceuticals | Supplied from OSU Pharmacy | |
Xylazine 100mg per 1mL | Akorn | Supplied from OSU Pharmacy | |
10cc insulin syringe 29 Ga x 1/2" needle | B-D | 309301 | |
Hyflex NBR | Ansell | S-17310M | Bite proof gloves |
BL1500 | Sartarius | Practum 1102-1S | Scale |
Large Flat Bottom Restrainer | Braintree Scientific Inc | FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat | Rat tunnel for injection |
Sterling Nitrile Powder-free Exam Gloves, Large | Kiberly-Clark | 50708 | |
Rapidpoint 405 | Siemens | blood gas analyzer | |
Fiberoxygenator D150 | Hugo Sachs Elektronik | PY2 73-3762 | |
LabChart v7.3.7 | ADInstruments | ||
Tracheal cannula | Harvard Apparatus | 733557 | |
Pulmonary Artery cannula | Harvard Apparatus | 730710 | |
Left Atrium cannula | Harvard Apparatus | 730712 | |
Peristaltic Pump | Ismatec | ISM 827B | |
Small Animal Ventilator model 683 | Harvard Apparatus | 55-000 | |
Ecoline Star Edition 003, E100 | Lauda | LCK 1879 | Water Heater |
Tubing Cassette | Cole-Parmer | IS 0649 | |
Connect kit D150 | Cole-Parmer | VK 73-3763 | |
PowerLab 8/35 | ADInstruments | 730045 | |
TAM-A transducer amplifier module type 705/1 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 73-0065 | |
TAM-D transducer amplifier type 705/2 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 73-1793 | |
SCP Servo controller for perfusion type 704 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 732806 | |
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731747 | |
VCM ventilator control module type 681 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731741 | |
TCM time control module type 686 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731750 | |
IL2 Tube set for perfusate | Harvard Apparatus | 733842 | |
Tube set for moist chamber | Harvard Apparatus | 73V83157 | |
Tygon E-3603 Tubing 2.4mm ID | Harvard Apparatus | 721017 | perfusate line entering lung |
Tygon E-3603 Tubing 3.2mm ID | Harvard Apparatus | 721019 | perfusate line leaving lung |
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