Summary
Ex-Vivo perfusão pulmonar (PPEV) tem permitido o transplante de pulmão em seres humanos para se tornar mais facilmente disponível, permitindo que a capacidade de avaliar órgãos e expandir o grupo de dadores. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um programa PPEV rato e aperfeiçoamentos que permitem um modelo reprodutível para expansão futura.
Abstract
O número de pulmões doados aceitáveis disponíveis para transplante de pulmão é bastante limitada devido à má qualidade. Ex-Vivo perfusão pulmonar (PPEV) tem permitido o transplante de pulmão em seres humanos para se tornar mais facilmente disponível, permitindo que a capacidade de avaliar órgãos e expandir o grupo de dadores. Uma vez que esta tecnologia melhora e expande, a capacidade de avaliar potencialmente e melhorar a qualidade dos pulmões desclassificados antes do transplante é uma necessidade crítica. Para avaliar mais rigorosamente estas abordagens, um modelo animal reprodutível precisa ser estabelecido que iria permitir o teste de técnicas aperfeiçoadas e gestão dos pulmões doados, bem como para o receptor de transplante de pulmão. Além disso, num modelo animal PPEV de patologias associadas, por exemplo, lesão pulmonar induzida ventilação (VILI), iria proporcionar um novo método para avaliar os tratamentos para estas patologias. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um programa de pulmão PPEV rato e refinamentos para esta meTHOD que permitem um modelo reprodutível para expansão futura. Nós também descrevem a aplicação deste sistema PPEV para modelar VILI em pulmões de ratos. O objetivo é proporcionar a comunidade de pesquisa com as principais informações e "pérolas de sabedoria" / técnicas que surgiram a partir de tentativa e erro e são fundamentais para a criação de um sistema PPEV, que é robusta e reproduzível.
Introduction
Relevância Clínica
Atualmente, existe uma escassez de pulmões disponíveis para transplante adequados com apenas 19% dos pulmões podendo ser utilizado a nível nacional levando a prolongada tempo de lista de espera ou de pacientes que morrem à espera de transplante 1. A escassez pode ser devido a doadores mais velhos, trauma, infecção, falência de órgãos multi-sistema e pulmões doados às vezes feridos em cima da colheita 2. Além disso, o pulmão é um órgão frágil fora da cavidade torácica, e técnicas de transporte e de preservação padrão pode conduzir a deterioração e não viáveis nos pulmões. Portanto, manter e melhorar a viabilidade pulmonar ex-vivo tornou-se recentemente um grande foco na medicina de transplante de pulmão.
Ex-vivo perfusão pulmonar (PPEV)
Ex-vivo perfusão pulmonar (PPEV) evoluiu para perfundir órgãos continuamente sendo avaliados para transplante e permite um período de avaliação de que todosuxos para o potencial de reanimação pulmonar ou recondicionamento. PPEV pode prolongar total de fora do órgão do corpo o tempo de isquemia e permitir que os órgãos doados para viajar distâncias maiores 3. Tipicamente, os pulmões são ventilados a 50% da capacidade pulmonar total ou 20 cmH 2 O pico de pressão das vias aéreas com uma fracção de oxigénio inspirada (FiO 2) de 30% a 50% 4. Solução de preservação é perfundido a 40-60 ml / kg (aproximadamente 40% do débito cardíaco previsto de 100 ml / kg) em seres humanos e animais de grande porte 5,6, mas é perfundido a cerca de 20% do débito cardíaco em ratos 7. A inclusão de solução STEEN permitiu pulmões humanos viajar em ambientes RT sem o desenvolvimento de edema pulmonar 9. Este trabalho pioneiro foi aperfeiçoado pela Universidade de Toronto Lung Transplant Programa de 10-13 e está sendo avaliado para uma melhor avaliação dos pulmões marginais doadores para transplante 14,15. No entanto, o ideal ventilation condições e de perfusão necessários para regenerar pulmões marginais e / ou sub-padrão para o transplante não é conhecido e é atualmente uma área ativa de pesquisa.
Sistemas de perfusão pulmonar isolados têm sido utilizados em animais de pequeno porte para causar lesão pulmonar, re-criar as doenças respiratórias, e perfuse os pulmões com soluções diferentes para evitar dano isquêmico. Os investigadores têm criado um modelo de pequenos animais de transplante de pulmão, usando o sistema isolado de pulmão de perfusão para imitar os protocolos PPEV que poderiam ser utilizados em seres humanos e animais maiores 16-18. No entanto, este modelo experimental tem muitos desafios no que diz respeito às várias técnicas e parâmetros utilizados para mimetizar a fisiologia humana. Em particular, há muitas sutilezas na manutenção da viabilidade do pulmão durante a PPEV. Essas sutilezas podem surgir devido a diferenças na técnica de colheita, valores positivos de ventilação de pressão, condições de composição e de fluxo de perfusão e canulação do pulmão. Therntes, o objetivo aqui é o de proporcionar a comunidade de pesquisa com um número de solução de problemas e implementação dicas que temos encontrado levar a um método robusto para a implementação PPEV em um modelo de roedor.
Protocol
NOTA: Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as linhas-guia do Animal Care Institucional e Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para o cuidado humano e Uso de Animais de Laboratório (IACUC) e foi submetido a aprovação do comitê de Ohio State University IACUC.
1. Configuração inicial
- Configurar o circuito de PPEV e têm quente (37 ° C) o perfusato circulante através do sistema antes de incorporar o pulmão ex-plantado (Figura 1).
- Definir o banho de água quente, utilizado para revestimento do reservatório perfusato, permutador de calor, e no tórax artificial, a 37 ° C e em circulação (Figura 1).
- Executar uma solução de oxigenação (por exemplo, 6% de O 2, 8% de CO2, 84% N2) por meio de contracorrente do perfusato no filtro de gás para garantir o perfusato tem ~ 6% de oxigénio dissolvido para a experiência.
NOTA: Este perfusato oxigenado-de permite a avaliação of a função pulmonar através da medição do oxigénio introduzido no perfusato, pós-órgão. - Abra o programa de aquisição de dados e ligar o transdutor de pressão da artéria pulmonar, o transdutor de pressão diferencial traqueal, o transdutor de pressão diferencial do fluxo respiratório, transdutor de peso do pulmão, e transdutor de velocidade da bomba para o circuito PPEV e a caixa do conversor de aquisição de dados / analógico-para-digital ( Figura 2).
- Configure a mesa de operação e ferramentas operacionais no circuito de PPEV (Figura 3).
- Configurar um pequeno recipiente de nitrogênio líquido perto do circuito de PPEV se amostras serão obtidos.
NOTA: O sistema do autor foi modificada para coletar pré-órgão e perfusato pós-órgão, sem interromper a dinâmica de pressão de fluxo que podem potencialmente afetam o pulmão.
2. Preparação de anestésicos e Heparina, anesthetization de Rat
- Coloque sobre a seguinte equipamento de protecção individual(PPE) antes de manusear ratos e tecidos de ratos: máscara cirúrgica, luvas cirúrgicas, e vestido descartável.
- Pesar o rato e registrar o peso.
- Prepare 1.200 U / kg de heparina.
- Preparar 60 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de xilazina na mesma seringa, a preparação do primeiro cetamina.
- Intraperitoneal injetar a mistura de cetamina e xilazina em ratos e permitir que 5 min para o rato para tornar-se inconsciente.
- Confirme anesthetization adequada verificando toe pitada reflexo. Se o rato não retirar a dedo, ele não está sentindo dor.
- Mover rato a mesa de operação, fixe na posição supina, e pulverizar com álcool para a esterilização.
3. Extração e Ventilação inicial do Rato Lungs
- Prepare 4-20 cm suturas longo de seda (3-0 ou 4-0, devem ser suficientes).
- Começar a gravar dados utilizando o programa de aquisição de dados.
- Verifique a existência de profundidade adequada da anestesia, usando uma tesoura cirúrgica entrar ca peritonealvity por uma laparotomia mediana e injetar heparina na veia cava inferior.
- Leve a incisão cranial após o manubrium no pescoço até a traquéia está exposto. Não romper a cavidade torácica (Figura 4A).
- Dissecar posterior à traquéia na linha média e deslize a posterior sutura de seda para a traquéia (Figura 4B).
- Levante a secção anterior da traquéia e fazer uma incisão transversal entre os anéis cartilaginosos, no alto da traquéia. Não cortar a porção membranosa posterior da traquéia, neste ponto (Figura 4C).
- Canular a traqueia com a cânula da traqueia e seguro com a sutura de seda (Figura 4D). Assegure-se que a ligadura de sutura é fixada na chanfrar para atenuar a migração da cânula.
- Conecte-se a cânula da traqueia para o circuito de ventilação.
- Ligue o ventilador mecânico para iniciar mecanicamente ventilar o luNGS.
NOTA: As definições iniciais foram escolhidos para ser um volume corrente de 4 ml / kg e de pressão expiratória final positiva (PEEP) de 2 cmH 2 O. Estas definições são as configurações iniciais e dependendo das condições experimentais pode ser ajustado uma vez que o órgão está no sistema de perfusão ex-vivo. - Entrar na cavidade torácica através do esterno / xifóide e continuar em direção cranial fúrcula. Tome cuidado para evitar tocar os pulmões.
NOTA: Como o pulmão de rato é frágil, qualquer manipulação inadvertida pode conduzir a edema pulmonar e traumatismo (Figura 5A). - Usando 2 afastadores, retrair a cavidade torácica para expor corretamente a anatomia (Figura 5A). Mais uma vez, tome cuidado para não tocar os pulmões.
- Retire o timo com ligeira elevação e dissecção romba.
- Desloca os conteúdos abdominais para um lado ou para expor a veia cava inferior (IVC) ou da veia mesentérica (MV).
- Inciso ou a IVC ou a MV para desangrar o rato, proporcionando a eutanásia.
- Coloque um posterior sutura de seda para a artéria pulmonar e na aorta, em preparação para fixação da cânula da artéria pulmonar (Figura 5B).
- Faça uma incisão de 2-3 mm na face anterior da via de saída do ventrículo direito e colocar a cânula na incisão e na artéria pulmonar principal e prenda com o fio de seda (Figura 5C).
- Transecção do vértice do coração para permitir o acesso ao ventrículo esquerdo e descarregar quaisquer coágulos na vasculatura pulmonar por fluindo ~ 15 ml de uma solução de electrólito de baixo K + através da artéria pulmonar e para fora através da ponta do coração no interior da cavidade torácica ( A Figura 5D).
- Conecte-se a cânula da artéria pulmonar (PA) para o circuito de PPEV. Assegurar a linha de entrada vindo do circuito para a cânula PA é preparado com o perfusato para evitar qualquer ar que entra no coração e pulmões.
- Ligue oprincipal bomba peristáltica e configurá-lo para baixo (~ 2 ml / min) a velocidade para permitir perfusato para ser executado através da artéria pulmonar e o ventrículo esquerdo para a cavidade torácica. ** passo crítico ** Certifique-se a pressão PA não espiga como este é um sinal de bloqueio ou um ou pobre canulação (Figura 6).
- Desligue a bomba peristáltica.
- A posição de uma sutura de seda por trás do coração, em torno dos ventrículos (Figura 7).
- Inicie o processo de canulação do átrio esquerdo através da inserção de um pequeno par de pinças cirúrgicas no ápice, através da válvula mitral, e para o átrio esquerdo.
NOTA: Este vai dilatar a válvula mitral e facilitar a punção. Dilatação agressivo, ou dilatação muito profunda, pode inadvertidamente dilacerar o átrio esquerdo tornando a aquisição ineficaz. - Remover a pinça do coração.
- Inserir a cânula do átrio esquerdo para o ápice através da válvula mitral e para a esquerda,rium.
- Fixe a cânula do átrio esquerdo com o fio de seda atrás do coração (Figura 8).
NOTA: Esta sutura pode ser "pré-amarrado" para facilitar a punção. - Ligue a cânula da artéria pulmonar para o ex-vivo circuito de perfusão pulmonar (Figura 9A). Não ligue a cânula do átrio esquerdo para o circuito de PPEV até que o bloco coração-pulmão foi completamente removida do corpo.
- Prender o esófago com uma pinça hemostática e cortado abaixo da braçadeira (entre o grampo e diafragma), de modo que o esófago pode ser usado para aumentar a circulação estruturas cefálica.
- Sem rodeios dissecar o tecido circundante e corte da aorta descendente e embarcações auxiliares para libertar o bloco de coração-pulmão, uma vez que está sendo levantada através do esôfago (Figura 9B).
- Transecto traquéia cefálica à cânula traqueal para completamente livre do bloco de coração-pulmão.
- Retire o bloco de coração-pulmão e coloque no desilocalização gnated no circuito de PPEV (Figura 9C).
- Conecte-se a cânula do átrio esquerdo para a linha de saída e começar a principal bomba peristáltica (Figura 9D).
4. Ex Vivo Perfusão dos Pulmões
- Remover rapidamente a linha de ventilação do topo do aparelho PPEV e fixar o invólucro com os sensores de pressão, em seguida, inserir a linha de ventilação na parte superior da caixa na parte superior do aparelho PPEV.
NOTA: Isso permitirá que os dados de ventilação para ser gravado e pressão monitorada. - Assegurar o borbulhador é preenchida com uma quantidade adequada de perfusato de modo que não há bolhas de ar (ou seja, os êmbolos de ar) são introduzidos nos pulmões.
- Lentamente, alterar as configurações de ventilação e de perfusão para níveis desejados experimentais durante o inicial de 15 min. Além disso, durante esta fase inicial de ramp-up, aumentar a taxa de fluxo de perfusão para a taxa e / ou pressão desejada.
NOTA: Programming o ventilador para produzir respirações suspiro intermitentes, as quais facilitam o movimento de fluido para fora do espaço do pulmão e, portanto, atrasar o aparecimento de edema, é recomendado. Estes podem ser produzidos por ventiladores equipados com a função de suspiro. - Definir "Time 0" como o momento em que os parâmetros de ventilação estão em um volume corrente de 4 ml / kg, PEEP de 2 cm H 2 O, os parâmetros de perfusão estão em seus níveis esperados e permanecendo constante.
- Se necessário, retirar amostras de perfusão a partir do porto de amostra, congelamento de flash em nitrogênio líquido, e observe o tempo das amostras.
- Quando a experiência é completa, isolar quaisquer peças anatômicas necessárias para a recolha e ou congelamento de flash em nitrogênio líquido ou lugar em solução de mais estudos, que fixa.
Representative Results
Os dados em tempo real mecânicas recolhidos através do programa de aquisição de dados pode ser facilmente analisada para testar qualquer número de hipóteses. Por exemplo, a Figura 10A mostra o peso médio do pulmão através de 60 min a partir de 10 experiências com ratos, onde os animais foram ventilados com um baixo volume corrente / baixa PEEP de 4 ml / kg e 2 cmH 2 O. Embora não haja um aumento muito menor em peso de pulmão ao longo da experiência, este aumento não é estatisticamente significativa (ANOVA, p = 0,92). A Figura 10B mostra a pressão arterial pulmonar média (PAP), por meio de 60 min a partir de 12 experiências com ratos. O PAP menor no ponto de tempo 0 min é um resultado de configurações de fluxo e de ventilação inferiores utilizadas no início de todas as experiências e os PAP permanece constante após este ponto de tempo sem alterações estatisticamente significativas após t = 10 min (ANOVA em fileiras, p = 0,89). A Figura 10C mostra a resistência vascular pulmonar (RVP), através de 60 min a partir de 12 ratosexperimentos e, embora haja uma pequena diminuição na PVR após t = 20 min, não houve diferença estatisticamente significativa na PVR durante esta experiência (ANOVA em fileiras, p = 0,65). Em comparação com os dados apresentados aqui PVR, Noda et al. mostrou o PVR para aumentar ligeiramente ao longo do tempo, durante 4 h. No entanto, os autores relatam dados na RVP a partir de 1 h, em vez de o início da experiência, e não os valores de desvio padrão são fornecidos 7. Noda et ai. também não mostra dados de edema pulmonar para os 4 experimentos hr assim nenhuma comparação pode ser feita com os dados aqui apresentados na Figura 10A. As principais diferenças em Noda et al. procedimento em comparação com o que é mostrado no presente documento incluem: uma conservação a frio 1 h em solução de LPS antes PPEV, os ratos foram inicialmente ventilada com uma mistura gasosa incluindo isoflurano para os tornar inconsciente, a solução de perfusão foi suplementado com 50 mg de metilprednisolona e 50 mg de cefalosporina, fl totaisow foi definida como 20% do débito cardíaco calculado, amostras de perfusato foram feitas somente após o pulmão foi ventilado em 100% de O 2 durante 5 minutos antes da experiência e foi corrido, durante 4 h.
As amostras recolhidas durante a experiência do perfusato também podem ser analisados para muitas finalidades. Como um exemplo, na Figura 11 demonstram que o quão alto volume corrente / alta ventilação PEEP pode induzir uma resposta pró-inflamatória, em 60 min. Para estas experiências, o perfusato de 4 ratos ventilados sob condições prejudiciais, ou seja, alto volume corrente de 10 ml / kg e alta PEEP de 8 cmH 2 O, foram analisadas para citocinas pró-inflamatórias e anti-IL1β, TNFa e IL4 usando o padrão técnicas de ELISA. Como mostrado na Figura 11, em comparação com os níveis de citocinas antes da ventilação (0 min), 60 min de ventilação prejudicial resultou num aumento estatisticamente significativo da IL-1β e TNFa (citocinas pró-inflamatórias) um nd nenhuma alteração nos níveis de IL-4 (uma citoquina anti-inflamatório) concentração. Portanto, este sistema PPEV é capaz de gerar perfis de lesão pulmonar comumente observados durante a ventilação mecânica.
Figura 1. Diagrama e fotografia de circuito pequeno animal ex-vivo de perfusão pulmonar (PPEV). Letters no diagrama de corresponder-se com as letras na fotografia. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Todos os transdutores estão conectados firmemente as caixas de controle."> Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A mesa de operação de rato está firmemente up adjacente ao circuito de perfusão pulmonar ex vivo (PPEV). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. (A) É feita uma incisão cranial para expor a traquéia. A cavidade torácica não é exposta. (B) A sutura de seda é colocado atrás da traquéia. (C) A traqueia é cortado parcialmente, para preparar para canulação. (D) A cânula da traqueia é colocado em positio n e fixado com um fio de seda. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. (A) a cavidade torácica, é puxado para trás para permitir o acesso ao coração e pulmão. (B) Preparação de sutura para a colocação atrás da artéria pulmonar. (C) A artéria pulmonar é canulada e amarrado com o fio de seda previamente colocado. (D) Uma solução de baixo K + eletrólito é liberado através da artéria pulmonar e fora do átrio esquerdo para remover eventuais coágulos de sangue. Por favor, clique aqui para ver um maior versão desta figura.
Figura 6. O aumento do fluxo arterial pulmonar durante a lavagem do pulmão pode causar a pressão arterial pulmonar para aumentar drasticamente. Se cannulation foi realizado corretamente e não há bloqueio principal, a pressão deve diminuir. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura .
Figura 7. sutura de seda é colocado ao redor de todo o coração, em preparação para a canulação átrio esquerdo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 8. A cânula do átrio esquerdo é presa no lugar com um fio de seda. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9. (A) A cânula da artéria pulmonar é ligada ao circuito de perfusão pulmonar ex-vivo. (B) O esôfago é apertado e o tecido conjuntivo é sem rodeios dissecados para remover o bloco coração-pulmão. (C) O bloco de coração-pulmão é removido da cavidade torácica e colocado no circuito de perfusão pulmonar ex-vivo. (D) O átrio esquerdo está ligado ao circuito de perfusão pulmonar ex-vivo. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig9large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10. (A) Peso pulmonar de ratos Sprague Dawley do sexo masculino através de 60 min de perfusão pulmonar ex vivo (n = 10). (B) A pressão arterial pulmonar de ratos Sprague Dawley do sexo masculino através de 60 min de perfusão pulmonar ex vivo (n = 12). (C) A resistência vascular pulmonar de ratos Sprague Dawley através de 60 min de perfusão pulmonar ex vivo (n = 12), NS indica nenhuma diferença estatisticamente significativa. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 11. Efeito de 1 hr de ventilação em altos volumes correntes (10 ml / kg) e PEEP elevada (8 cmH 2 O) em concentrações de citocinas pró-inflamatórias e anti-no perfusado. N = 4, * indica diferença estatisticamente significativa com relação a 0 amostra hr (p <0,05). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12. (A) Um corretamente ventilação e de perfusão pulmonar ligada ao circuito de PPEV. (B) de alta pressão expiratória final positiva (PEEP) faz com que uma lágrima na bifurcação da traquéia causando a formação de bolhas na lesão e encher o tórax artificial. es / ftp_upload / 52309 / "target =" _ 52309fig12large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 13. (A) cânula da artéria pulmonar. Esta cânula é menor do que a cânula átrio esquerdo. (B) do átrio esquerdo cânula. Esta cânula é muito maior do que a cânula da artéria pulmonar. (C) cânula traquéia. Esta cânula tem reforços para ajudar na fixação da traqueia com fio de seda. O fim que é inserido na traquéia também é ligeiramente apontado para ajudar na inserção da cânula na traquéia. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 14. (A) O ápice do coração é realizada por um par de fórceps como o ventrículo direito está prestes a ser cortados no fim de canular a artéria pulmonar. (B) A dilatação do anel da valva mitral com um par de pequenas extremidades cegas pick-ups faz com que seja mais fácil de visualizar o trato para o átrio esquerdo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
SISTEMA DE VIGILÂNCIA
Que coisas parecem quando experimento está funcionando bem:
Uma vez que as cânulas foram colocadas no circuito e os pulmões são de ventilação, existem várias maneiras para garantir que o sistema está funcionando corretamente. Não deve haver vazamento de perfusato em toda a linha. A resistência vascular pulmonar (RVP) deve manter-se relativamente constante (assumindo um fluxo constante). A troca de oxigênio deve aumentar, uma vez que o ventilador está funcionando corretamente e expandir os pulmões para recrutar mais alvéolos para a troca gasosa. A Figura 12A mostra bem ventilados e perfundidos pulmões conectados ao circuito PPEV no interior do tórax artificial.
Que coisas parecem quando experimento não está funcionando bem:
Existem alguns problemas comuns que tiveram o maior índice de ocorrência durante os estágios iniciais de um experimento PPEV. O primeiro e mais fácil tO remédio é um vazamento na linha que sai do pulmão. Isso é perceptível por um pool de pooling perfusato sob parte do circuito eo nível do reservatório diminuindo continuamente. Verifique e aperte os conectores do tubo em torno da área do derramamento e inspecionar o próprio tubo de um vazamento. Se esta fuga ocorre antes do pulmão, pode também introduzir bolhas no pulmão. Isto deve ser remediado tão rapidamente quanto possível na forma de bolhas de ar no perfusato irá resultar em danos nos tecidos e causar um aumento significativo na PVR. Também pode haver uma fuga proveniente do pulmão ou uma das cânulas. Isto pode ser causado por um deslizamento de uma cânula ou de uma obstrução na linha que sai provocando uma acumulação de pressão. Inspecione a posição para ambos os cânulas para garantir nem caiu ou torcida. A pressão PA também devem ser monitorizados durante este processo, porque um aumento instantâneo na pressão PA é um sinal evidente de que uma obstrução de algum tipo ocorreu recentemente. Figura 12Bmostra um pulmão rompido que rompeu com altas pressões. Um vazamento a partir do próprio pulmão pode também ser causada por uma lágrima no tecido. Esse problema pode ou não ser reparável mas reposicionamento e reaperto das cânulas é a melhor opção neste cenário.
Principais pontos de aprendizagem / Oportunidades:
Tentativa e erro desenvolvimento do sistema de perfusão pulmonar ex-vivo nos permitiu identificar várias questões-chave que delineiam aqui para facilitar a implementação eficiente do sistema PPEV. Em primeiro lugar, no que diz respeito aos contratos, é importante que as técnicas anestésicas são seguidos os padrões para anestesiar os animais adequadamente (anestésico suficiente, injeção no peritônio) e adesão a todas as políticas IACUC é necessária. A cânula (mostrado na Figura 13 A, B, e C) deve ser repetidamente lavada a fim de remover qualquer coágulo e / ou detritos dentro da vasculat pulmonarure. No que diz respeito à seleção animal, sugerimos o uso Sprague Dawley ou Lewis ratos pesando 250-350 g. Um cuidado especial deve ser tomado quando canulação ratos pesando perto de 250 g vez que os navios será menor e, portanto, muito mais difícil de cannulate sem ferir a vasculatura. Se ratos menores, ou um modelo de rato, é para ser usado, menor cânula pode precisar de ser utilizado.
Traqueal de punção não é tipicamente um desafio, enquanto o fio de sutura é garantido de forma adequada por uma primeira passagem posterior sutura de seda para a traqueia após dissecção dos fáscia circundantes e antes da canulação. Siga isso com uma visão anterior incisão 1-2 anéis traqueais acima da sutura para passar a cânula. Amarrar nós quadrados entre os anéis da traqueia, de modo a fixá-lo dentro de uma ranhura para uma melhor segurança (Figura 4C). A canulação da artéria pulmonar (PA) é mais exigente em relação à cânula traqueal. Os seguintes passos foram utilizados neste estudopara este procedimento. Em primeiro lugar, segure a ponta do coração com um par de fórceps. Passar um outro par de fórceps no seio transverso e um fio de sutura para fixar a cânula na PA proximal. Inciso o ventrículo direito, imediatamente antes da saída do ventrículo direito (VSVD) (Figura 14a). Após a incisão no RVOT, a cânula será orientada para a via de saída da artéria pulmonar. Tendo a sutura em posição atrás da artéria pulmonar / aorta antes do ventriculotomy direita aumenta a eficiência (Figura 5C). A cânula deve ser fixada em posição com o fio de sutura para evitar o deslocamento. Uma das principais complicações podem ocorrer se a cânula PA não está na orientação anatómica correcta. A cânula pode ser inserido demasiado longe e apenas perfundir um ramo ou tornar-se mal posicionado com torção do espécime de coração-pulmão depois de serem removidos da cavidade torácica. Isto pode ser facilmente orientada para trás para a posição original para preservar o ângulo adequado de anatomiposição cal. Finalmente, do átrio esquerdo (LA) punção é a parte mais desafiadora do procedimento. A cânula LA necessita de ser colocado dentro do átrio esquerdo. Com os tecidos sendo extremamente friável, estar atento para não usar a força significativa ou torção, a fim de evitar uma lágrima dentro da veia pulmonar e átrio esquerdo, que passaria a fazer a experiência irrecuperável. A cânula PA está melhor colocado antes da cânula LA. Um Ventriculotomia esquerda com a remoção do vértice foi mostrado para perturbar as cordas cordoalha e permitir um acesso mais fácil através dos folhetos mitrais. Além disso, o ventriculotomy torna mais fácil para dilatar e visualizar a válvula mitral e para alimentar a cânula através da válvula mitral. A dilatação do anel da valva mitral com um par de pequenas extremidades cegas pick-ups pode ser feito, a fim de visualizar o aparelho para o LA (Figura 14B). Sutura deve ser colocado atrás do coração antes de punção. Isto pode ser feito simplesmente pelo levantamento do coração utilizando um par de small cerses pick-ups e colocando a sutura por baixo e através do coração. O LA está agora pronto para ser cânula. Alimente a cânula LA através das pick-ups, a fim de visualizar corretamente o posicionamento da cânula para o átrio esquerdo. Tome especial cuidado para não deslocar a cânula de volta para o ventrículo esquerdo. A sutura em seguida, deve ser firmemente fixados ao longo do miocárdio do ventrículo esquerdo. Protegendo o fio de sutura para o átrio esquerdo pode ocluir o todo ou parte da cânula.
Durante o processo, é essencial que nenhum ar permanecer na secção de entrada do aparelho. Qualquer ar significativa pode produzir uma embolia de ar aumentar o PVR (efectivamente um "air-lock"), o que irá resultar num fluxo perfusato muito menor para uma dada pressão. Vários pontos pode ser utilizado para remover o ar dentro do sistema. Air dentro da seção de saída é esperado e não deve ter qualquer efeito deletério sobre os pulmões. A modelo suíno para a hipertensão pulmonar tem sidomostrada para recriar a patologia de pequenas quantidades de ar contínua ao longo de um período de 8 semanas. O aumento do ar diminui a quantidade de perfusão presente enquanto causando inflamação para os tecidos circundantes 19.
O início da perfusão pode ocorrer uma vez que o punção está completo, mas antes do tubo proveniente do LA está ligada à linha de PPEV. Perfusato deve ser executado através de limpar todos os coágulos de sangue e isso pode esvaziar perfusato para a parede torácica, sem quaisquer problemas. Ligação da bomba de perfusão para o modo manual e aumentando lentamente a taxa de fluxo de aproximadamente 2 ml / min permite acompanhar de perto a pressão PA. Pressões mais de 20-30 cmH2O pode indicar uma obstrução e assistindo para perfusato sair do LA é também um indicador, mas isso pode ser muito difícil de ver. Se a pressão se eleva a mais de 20-30 cmH 2 O, parar a bomba e verifique novamente ambas as cânulas. Uma vez que a pressão é constante em torno de 10-20 cmH2O permitir the perfusato para percorrer e para a cavidade torácica por 2 min. Nesta altura, a linha de LA pode ser conectado ao circuito de PPEV. A velocidade da bomba de perfusão pode ser aumentada para 5-10 ml / min. À medida que a cabeça avança fluido através do circuito, haverá um aumento da pressão PA, devido ao aumento da altura da cabeça do fluido e, por conseguinte, a pressão estática. Se o fluido não pode fluir sobre o ponto mais alto na linha, pode ser necessário que se aplique uma força de sucção na extremidade oposta da linha ou a tentativa de reduzir a maior parte da linha. Uma vez que esta questão está superada, o perfusato deve circular sem quaisquer problemas.
Algumas questões devem ser monitorados com relação ao ventilador. Em primeiro lugar, a torção de brônquios / traqueia e posição de coração-pulmão pode ocorrer como os pulmões se tornam mais edematoso e que o peso aumenta. É importante que a cânula permaneça numa posição anatómica relativamente estreita, por conseguinte, alterando um ou ambos os cânulae pode ser necessária. Pressão ou de volume controlado ventiladores, bem como ventilação positiva ou negativa pode ser usado com este sistema PPEV. Para o modelo de rato, temos encontrado usando pressão positiva, ventilação controlada a volume funciona bem em volumes correntes entre 4-10 ml / kg e em pressões expiratória final positiva (PEEP) entre 2-8 cmH 2 O. No entanto, uma PEEP de 8 cmH 2 O pode provocar uma possível ruptura na bifurcação da traqueia. Depois de cada experiência (ou conjunto de experiências se realizado back-to-back), a linha de ventilação que conduz à traquéia deve ser limpo de qualquer lavado bronco-alveolar (BAL), que podem ter viajado até a traquéia. Esse fluido vai endurecer se deixado intocado e pode bloquear completamente a linha de ventilação.
A composição do perfusato é crítico para um experimento PPEV bem sucedida. Uma mistura dextrano 5% permite a perfusão pulmonar, que é perto de condições fisiológicas, mantém uma pressão oncótica estável para conduzir fluido back na vasculatura para evitar o edema e previne a trombose no interior dos vasos pulmonares. É importante notar que algumas espécies de ratos pode ser alérgico a dextrano que pode causar edema pulmonar 20. O conteúdo do perfusato foi consistente em todos os grupos experimentais neste estudo, por conseguinte, o teor de dextrano não deve ser um confundidor. A pressão oncótica é uma variável crítica, que tem o potencial para melhorar ou produzir edema nos tecidos. Soluções para perfusão comercialmente disponíveis, que são optimizados para o armazenamento estático frio ou perfusões normotérmicos foram usados neste sistema para aumentar o tempo de viabilidade pulmão. Fazemos notar que algumas destas soluções conter albumina e uma preocupação é a possibilidade de albumina bovina desencadear uma resposta inflamatória no pulmão roedor. Embora composição do perfusato ideal é um tema permanente de investigação, o perfusato precisa levar em conta a pressão oncótica, a capacidade de pressão e de tamponamento osmótica. We recomendado que a solução ser uma solução com base em cultura de células ou de Krebs-Henseleit modificado meios. A pressão oncótica deve ser mantida por dextrano ou albumina, dependendo da aplicação. A taxa de pressão de perfusão e fluxo afeta os parâmetros de perfusão de órgãos e supra-fisiológica pode fazer o órgão propenso a trauma mecânico.
Indicadores Visuais durante a experiência:
Existem muitas pistas visuais, bem como indicações de dados em tempo real que pode ser utilizada para determinar se um experimento PPEV funcionando bem. O pulmão permanecerá o mesmo tamanho e vai esvaziar para o mesmo volume após cada respiração. Também haverá nenhum vazamento a partir do próprio pulmão. O PVR, o peso do pulmão, e conformidade permanecerá relativamente constante. A produção de oxigénio permanecerá constante ou aumentar ligeiramente.
Há muitos indicadores visuais quando o pulmão fica comprometida durante um experimento. O pulmão torna-se um edematosond cresce rapidamente em tamanho e peso. A cor das alterações de pulmão (a partir de um bronzeado-de-rosa para branco) e bolsas de líquido podem ser identificados no tecido. Se traqueia ou pulmonares rupturas de barotrauma ou mais de distensão, haverá borbulhando sob o ponto de lesão (Figura 12b). Produção de oxigênio diminui eo PVR e conformidade irá aumentar dramaticamente também.
O potencial da utilização de um modelo PPEV em pequenos animais, como roedores abre a porta para futuros estudos, melhorando o tratamento de transplante de pulmão. No entanto, o modelo animal pequeno requer uma melhor compreensão para imitar verdadeiramente um transplante de pulmão. Este modelo pode ser utilizado no futuro, para melhorar os tratamentos médicos e definir os parâmetros de linha de base para futuros estudos de transplante de pulmão.
Disclosures
Nenhum
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer o apoio de Harvard Apparatus, especialmente Stephanie Pazniokas, MS (Fisiologia Sistemas & Regenerative Medicine), o auxílio na montagem do circuito, modificação e resolução de problemas do circuito de perfusão e XVIVO Perfusão (Daniel Martinelli, CCP, CTP) para proporcionar o uso não-clínica plegia pulmonar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IPL-2 Basic Lung Perfusion System | Harvard Apparatus | ||
| Tweezer #5 stainless steel, curved 11 cm | Kent Scientific Corporation | IND500232 | |
| Tweezer #5 Dumostar, 11 cm | Kent Scientific Corporation | INS500085-A | |
| Tweezer #7 Titanium, 12 cm tips curved | Kent Scientific Corporation | INS600187 | |
| McPherson-Vannas Scissors 8 cm, Str 5 mm | Kent Scientific Corporation | INS14124 | |
| Vannas Scissors 8 cm Str 5 mm | Kent Scientific Corporation | INS14003 | |
| Instrument Sterilization Tray 5" x 7" | Kent Scientific Corporation | INS800101 | |
| Heparin 30,000 units per 30 ml | APP Pharmaceuticals | Supplied from OSU Pharmacy | |
| Ketamine 500 mg per 5 ml | JHP Pharmaceuticals | Supplied from OSU Pharmacy | |
| Xylazine 100 mg per 1 ml | Akorn | Supplied from OSU Pharmacy | |
| 10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle | B-D | 309301 | |
| Hyflex NBR | Ansell | S-17310M | Bite proof gloves |
| BL1500 | Sartarius | Practum 1102-1S | Scale |
| Large Flat Bottom Restrainer | Braintree Scientific Inc | FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat | Rat tunnel for injection |
| Sterling Nitrile Powder-free Exam Gloves, Large | Kiberly-Clark | 50708 | |
| Rapidpoint 405 | Siemens | blood gas analyzer | |
| Fiberoxygenator D150 | Hugo Sachs Elektronik | PY2 73-3762 | |
| LabChart v7.3.7 | ADInstruments | ||
| Tracheal cannula | Harvard Apparatus | 733557 | |
| Pulmonary Artery cannula | Harvard Apparatus | 730710 | |
| Left Atrium cannula | Harvard Apparatus | 730712 | |
| Peristaltic Pump | Ismatec | ISM 827B | |
| Small Animal Ventilator model 683 | Harvard Apparatus | 55-000 | |
| Ecoline Star Edition 003, E100 | Lauda | LCK 1879 | Water Heater |
| Tubing Cassette | Cole-Parmer | IS 0649 | |
| Connect kit D150 | Cole-Parmer | VK 73-3763 | |
| PowerLab 8/35 | ADInstruments | 730045 | |
| TAM-A transducer amplifier module type 705/1 | Hugo Sachs - Harvard Apparatus | 73-0065 | |
| TAM-D transducer amplifier type 705/2 | Hugo Sachs - Harvard Apparatus | 73-1793 | |
| SCP Servo controller for perfusion type 704 | Hugo Sachs - Harvard Apparatus | 732806 | |
| CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 | Hugo Sachs - Harvard Apparatus | 731747 | |
| VCM ventilator control module type 681 | Hugo Sachs - Harvard Apparatus | 731741 | |
| TCM time control module type 686 | Hugo Sachs - Harvard Apparatus | 731750 | |
| IL2 Tube set for perfusate | Harvard Apparatus | 733842 | |
| Tube set for moist chamber | Harvard Apparatus | 73V83157 | |
| Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID | Harvard Apparatus | 721017 | perfusate line entering lung |
| Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID | Harvard Apparatus | 721019 | perfusate line leaving lung |
| low potassium dextran glucose solution | flushing the lung |
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