Ex-Vivo perfusión pulmonar (EVLP) ha permitido el trasplante de pulmón en los seres humanos para ser más fácilmente disponible, permitiendo la capacidad de evaluar los órganos y ampliar el grupo de donantes. Aquí se describe el desarrollo de un programa EVLP rata y mejoras que permitan un modelo reproducible para una futura expansión.
El número de pulmones donantes aceptables disponibles para el trasplante de pulmón es muy limitada debido a la mala calidad. Ex-Vivo perfusión pulmonar (EVLP) ha permitido el trasplante de pulmón en los seres humanos para ser más fácilmente disponible, permitiendo la capacidad de evaluar los órganos y ampliar el grupo de donantes. Como esta tecnología se expande y mejora, la capacidad de evaluar y potencialmente mejorar la calidad de los pulmones deficientes antes del trasplante es una necesidad crítica. Con el fin de evaluar más rigurosamente estos enfoques, un modelo animal reproducible necesita ser establecido que permita el ensayo de técnicas mejoradas y la gestión de los pulmones donados, así como para el receptor de pulmón-trasplante. Además, un modelo animal EVLP de patologías asociadas, por ejemplo, inducida por la ventilación lesión pulmonar (IVL), sería proporcionar un nuevo método para evaluar tratamientos para estas patologías. Aquí se describe el desarrollo de un programa de pulmón EVLP rata y refinamientos a esto method que permiten un modelo reproducible para una futura expansión. También se describe la aplicación de este sistema EVLP modelar IVL en los pulmones de ratas. El objetivo es proporcionar a la comunidad de investigación con la información clave y "perlas de sabiduría" / técnicas que surgieron de ensayo y error y son fundamentales para el establecimiento de un sistema de EVLP que es robusto y reproducible.
Importancia clínica
Actualmente hay una escasez de pulmones adecuados disponibles para el trasplante con sólo el 19% de los pulmones que son capaces de ser utilizados a nivel nacional que lleva a prolongado tiempo en lista de espera o los pacientes que mueren en espera de trasplante 1. La escasez puede ser debido a los donantes de mayor edad, traumatismos, infecciones, insuficiencia orgánica multisistémica y pulmones donados a veces heridos después de la cosecha 2. Además, el pulmón es un órgano frágil fuera de la cavidad torácica y técnicas de transporte y conservación estándar puede conducir a un deterioro y no viables pulmones. Por lo tanto, el mantenimiento y la mejora de la viabilidad pulmonar ex vivo se ha convertido recientemente en un foco importante en la medicina de trasplante de pulmón.
Ex-vivo de perfusión pulmonar (EVLP)
Ex-vivo de perfusión pulmonar (EVLP) ha evolucionado para perfundir continuamente órganos que se están evaluando para el trasplante y permite un período de evaluación de que todoujos para el potencial de la reanimación pulmonar o reacondicionamiento. EVLP puede prolongar totales de los órganos del cuerpo tiempo de isquemia y permite que los órganos donados para viajar distancias más largas 3. Típicamente, los pulmones son ventilados al 50% de la capacidad pulmonar total o 20 cmH 2 O de la presión de la vía aérea pico con una fracción de oxígeno inspirado (FiO 2) de 30% a 50% 4. Solución de preservación se perfunde a 40-60 ml / kg (aproximadamente 40% del gasto cardíaco predicho de 100 ml / kg) en seres humanos y animales grandes 5,6, pero se perfunde en torno al 20% del gasto cardíaco de ratas 7. La inclusión de solución STEEN ha permitido a los pulmones humanos viajen en entornos RT sin desarrollo de edema pulmonar 9. Este trabajo pionero ha sido refinado por la Universidad de Toronto pulmón Trasplante Programa 10-13 y está siendo evaluado para una mejor evaluación de los pulmones de donantes marginales para el trasplante 14,15. Sin embargo, el ventilatio óptiman y perfusión condiciones necesarias para regenerar pulmones marginales y / o sub-estándar para el trasplante no se conoce y es actualmente un área activa de investigación.
Sistemas de perfusión pulmonar aislada, se han utilizado en animales pequeños para causar lesión pulmonar, vuelva a crear enfermedades respiratorias, y perfundir los pulmones con diferentes soluciones para prevenir el daño isquémico. Los investigadores han creado un modelo de pequeños animales de trasplante de pulmón utilizando el sistema aislado de pulmón de perfusión para imitar los protocolos EVLP que podrían ser utilizados en seres humanos y animales más grandes 16-18. Sin embargo, este modelo experimental tiene muchos retos con respecto a las diversas técnicas y parámetros utilizados para imitar la fisiología humana. En particular, hay muchas sutilezas en mantener la viabilidad de pulmón durante EVLP. Estas sutilezas pueden surgir debido a diferencias en la técnica de recolección, los ajustes de ventilación con presión positiva, composición y condiciones de flujo de perfundido y la canulación de la pulmón. Therntes, el objetivo aquí es proporcionar a la comunidad de investigación con una serie de sugerencias para solucionar problemas e implementación que hemos encontrado plomo a un método robusto para implementar EVLP en un modelo de roedores.
MONITOREO DEL SISTEMA
¿Qué cosas se ven como cuando experimento está funcionando bien:
Una vez que las cánulas se han colocado en el circuito y los pulmones están ventilación, hay varias maneras de asegurar que el sistema está funcionando correctamente. No debe haber fugas de líquido de perfusión en toda la línea. La resistencia vascular pulmonar (PVR) debe permanecer relativamente constante (suponiendo un flujo constante). El intercambio de oxígeno debería aumentar una vez que el ventilador está funcionando correctamente y la ampliación de los pulmones para reclutar más alvéolos para el intercambio de gas. Figura 12A muestra pulmones conectados al circuito EVLP dentro del tórax artificial adecuada ventilación y perfusión.
¿Qué cosas se ven como cuando experimento no está funcionando bien:
Hay algunos problemas comunes que han tenido la mayor tasa de ocurrencia durante las etapas iniciales de un experimento EVLP. La primera y más fácil to remedio es una fuga en la línea que sale de los pulmones. Esto se nota por un conjunto de puesta en común de perfusión bajo parte del circuito y el nivel en el depósito disminuye continuamente. Compruebe y apriete cualquier conector del tubo alrededor del área del derrame e inspeccionar el propio tubo de escape. Si esta pérdida se produce antes de que el pulmón, puede también introducir burbujas en el pulmón. Esto debería remediarse lo más rápidamente posible como burbujas de aire en el perfundido se traducirá en daño a los tejidos y causar un aumento significativo en el PVR. También puede haber una fuga procedente del pulmón o de una de las cánulas. Esto puede ser causado por cualquiera de deslizamiento de una cánula o una obstrucción en la línea de salir causando una acumulación de presión. Inspeccione la posición de ambas cánulas para asegurar ninguno ha deslizado o torcido. La presión de la AP también debe ser monitoreado durante este proceso, ya que un aumento instantáneo de la presión PA es un signo evidente de que se ha producido recientemente una obstrucción de algún tipo. Figura 12Bmuestra un pulmón roto que se rompió debido a las altas presiones. Un escape del propio pulmón también puede ser causado por un desgarro en el tejido. Este problema puede o no ser reparable pero reposicionamiento y volver a apretar las cánulas es la mejor opción en este escenario.
Principales puntos de aprendizaje / Oportunidades:
Ensayo y error el desarrollo del sistema de perfusión pulmonar ex vivo ha permitido identificar varias cuestiones clave que esbozamos para facilitar la aplicación eficaz del sistema EVLP. En primer lugar, respecto de la contratación, es importante que las técnicas anestésicas estándar se siguen correctamente para anestesiar a los animales (suficiente anestésicos, inyección en el peritoneo) y el cumplimiento de todas las políticas IACUC se requiere. La cánula (mostrado en la Figura 13 A, B, y C) debe lavarse repetidamente con el fin de eliminar cualquier coágulo y / o escombros dentro de la vasculat pulmonarUre. Con respecto a la selección de los animales, le sugerimos que utilice Sprague Dawley o ratas Lewis con un peso de 250-350 g. Especial cuidado debe ser tomado al cannulating ratas que pesa cerca de 250 g desde los vasos será más pequeño y por lo tanto mucho más difíciles de canular sin lesionar la vasculatura. Si las ratas más pequeñas, o un modelo de ratón, se va a utilizar, puede necesitar ser usado más pequeña cánula.
Canulación traqueal no es típicamente un reto, siempre y cuando la sutura está fijado adecuadamente haciendo pasar primero una posterior sutura de seda a la tráquea después de la disección de la fascia de los alrededores y antes de la canulación. Siga esto con una incisión anterior 1-2 anillos traqueales por encima de la sutura para pasar la cánula. Atar nudos en cuadrados entre los anillos traqueales con el fin de asegurar que dentro de una ranura para una mejor seguridad (Figura 4C). La canulación de la arteria pulmonar (AP) es más difícil en comparación con la cánula traqueal. Los pasos siguientes se utilizaron en este estudiopara este procedimiento. En primer lugar, comprender el ápice del corazón con un par de pinzas. Pase otro par de pinzas en el seno transverso y el hilo de sutura para fijar la cánula en la PA proximal. Incisión en el ventrículo derecho inmediatamente antes del tracto de salida del ventrículo (TSVD) (Figura 14A). Después de la incisión en el TSVD, la cánula se orientará hacia el tracto de salida pulmonar arteria. Tener la sutura en posición detrás de la arteria pulmonar / aorta antes de la ventriculotomía derecha aumenta la eficiencia (Figura 5C). La cánula debe estar asegurado en el lugar con la sutura para evitar el desplazamiento. Una complicación importante puede ocurrir si la cánula PA no está en la orientación anatómica correcta. La cánula puede ser insertado demasiado lejos y sólo perfundir una rama o convertirse-mal posicionado con torsión de la muestra de corazón-pulmón después de retirarlos de la cavidad torácica. Esto puede ser fácilmente orientado de nuevo a la posición original para preservar el ángulo apropiado de anatomiposición de cal. Por último, la aurícula izquierda (LA) canulación es la parte más difícil del procedimiento. La cánula LA tiene que ser colocado dentro de la aurícula izquierda. Con los tejidos de ser extremadamente friable, ser conscientes de no utilizar la fuerza o la torsión significativa con el fin de evitar un desgarro en la vena pulmonar y la aurícula izquierda que luego hacer el experimento insalvable. La cánula PA es el mejor situado antes de la cánula LA. A ventriculotomía izquierda con la eliminación del ápice se ha demostrado que alteran la tendinosas cordae y permitir un acceso más fácil a través de los velos mitrales. Además, el ventriculotomía hace que sea más fácil para dilatar y visualizar la válvula mitral y para alimentar la cánula a través de la válvula mitral. La dilatación del anillo de la válvula mitral con un par de pequeñas de extremos romos pick-up se puede hacer con el fin de visualizar el tracto en el LA (Figura 14B). Sutura debe colocarse detrás del corazón antes de la canulación. Esto se puede hacer simplemente levantando el corazón usando un par de small pick-ups extremos romos y la colocación de la sutura debajo ya través del corazón. El LA ahora está listo para ser canulado. Alimentar a la cánula LA a través de las pick-ups con el fin de visualizar correctamente la colocación de la cánula en la aurícula izquierda. Tenga especial cuidado de no desplazar la cánula hacia el ventrículo izquierdo. La sutura debe entonces ser fijado firmemente a lo largo del miocardio del ventrículo izquierdo. Fijación de la sutura a la aurícula izquierda podría ocluir la totalidad o parte de la cánula.
Durante el procedimiento, es crucial que el aire no permanece en la sección de flujo de entrada del aparato. Cualquier aire significativa puede producir una embolia de aire aumentar la PVR (efectivamente un "air-lock") que se traducirá en un flujo de perfundido mucho menor para una presión dada. Varios puntos se pueden utilizar para eliminar el aire dentro del sistema. Se espera que el aire dentro de la sección de flujo de salida y no debe tener ningún efecto perjudicial sobre los pulmones. Un modelo porcino para la hipertensión pulmonar ha sidose muestra para recrear la patología de pequeñas cantidades de aire continuo durante un período de 8 semanas. El aumento de aire disminuye la cantidad de perfusión presente mientras que causan la inflamación de los tejidos circundantes 19.
El inicio de la perfusión puede ocurrir una vez que la canulación es completa, pero antes de que el tubo procedente de la LA está conectado a la línea de EVLP. Perfundido se debe ejecutar a través de despejar cualquier coágulo de sangre y esto perfusión puede vaciar en la pared torácica sin ningún problema. Cambio de la bomba de perfusión a modo manual y aumentando lentamente el caudal a ~ 2 ml / min permite una estrecha vigilancia de la presión de la AP. Presiones más de 20 a 30 cm H 2 O pueden indicar una obstrucción y mirando para perfusión de salir de la LA es también un indicador, pero esto puede ser muy difícil de ver. Si la presión aumenta a más de 20 a 30 cm H 2 O, detener la bomba y vuelva a revisar ambos canulaciones. Una vez que la presión es constante alrededor de 10 a 20 cm H 2 O permitir ªe perfundido para ejecutar a través y en la cavidad torácica durante 2 min. En este momento la línea desde el LA se puede conectar al circuito de EVLP. La velocidad de la bomba de perfusión se puede aumentar a 5-10 ml / min. A medida que el cabezal de fluido avanza a través del circuito, habrá un aumento en la presión PA debido al aumento de la altura de la cabeza de fluido y por lo tanto la presión estática. Si el fluido no puede fluir por encima del punto más alto en la línea, puede ser necesario o bien aplicar una fuerza de succión en el extremo opuesto de la línea o intentar bajar la parte más alta de la línea. Una vez que este problema se supera, la perfusión debe circular sin ningún problema.
Unos temas deben ser controlados con respecto al ventilador. En primer lugar, la torsión de los bronquios / tráquea y la posición de corazón-pulmón puede ocurrir como los pulmones se vuelven más edematosa y aumenta el peso. Es importante para las cánulas para permanecer en una posición anatómica relativamente cerca, por lo tanto alterando uno o ambos cánulae puede ser necesario. La presión o ventiladores controlados por volumen, así como la ventilación positiva o negativa se pueden utilizar con este sistema EVLP. Para el modelo de rata, hemos encontrado el uso de presión positiva, la ventilación controlada por volumen funciona bien en volúmenes corrientes entre 4-10 ml / kg y en las presiones positiva espiratoria final (PEEP) entre 2-8 cm H 2 O. Sin embargo, una PEEP de 8 cmH 2 O puede causar una posible rotura en la bifurcación de la tráquea. Después de cada experimento (o conjunto de experimentos si se realiza-back-to-back), la línea de ventilación que conduce a la tráquea debe limpiarse de cualquier lavado broncoalveolar (BAL) que pueden haber viajado hasta la tráquea. Este líquido se endurecerá si se deja intacto y puede bloquear completamente la línea de ventilación.
La composición perfundido es crítica para un experimento EVLP éxito. Una mezcla de dextrano al 5% permite la perfusión pulmonar que está cerca de las condiciones fisiológicas, mantiene una presión oncótica estable para conducir b fluidoack en la vasculatura para prevenir el edema y previene la trombosis dentro de los vasos pulmonares. Es importante señalar que algunas especies de ratas pueden ser alérgicos a dextrano que puede provocar edema pulmonar 20. El contenido de la perfusión fue consistente en todos los grupos experimentales en este estudio, por lo tanto, el contenido de dextrano no debe ser un factor de confusión. La presión oncótica es una variable crítica que tiene el potencial para mejorar o producir edema tisular. Disoluciones de perfusión comercialmente disponibles que están optimizados para almacenamiento estático frío o perfusiones normothermic se han utilizado en este sistema para aumentar los tiempos de viabilidad de pulmón. Tomamos nota de que algunas de estas soluciones contienen albúmina y una preocupación es la posibilidad de albúmina bovina desencadenar una respuesta inflamatoria en el pulmón de roedores. Aunque la composición óptima perfundido es un tema en curso de la investigación, el perfusado debe tener en cuenta la presión oncótica, la capacidad de presión osmótica y el almacenamiento en búfer. We recomienda que la solución se basa en una solución o cultivo celular Krebs-Henseleit medios modificada. La presión oncótica debe ser mantenida por dextrano o albúmina, dependiendo de la aplicación. La tasa de la presión de perfusión y el flujo afecta a los parámetros de perfusión de órganos y supra-fisiológica pueden hacer que el órgano propensos a trauma mecánico.
Indicadores visuales durante el experimento:
Hay muchas señales visuales, así como indicaciones de datos en tiempo real que se puede utilizar para determinar si un experimento EVLP está funcionando bien. El pulmón seguirá siendo el mismo tamaño y se desinflará en el mismo volumen después de cada respiración. También habrá ninguna fuga del propio pulmón. El PVR, peso de los pulmones, y el cumplimiento se mantendrá relativamente constante. La producción de oxígeno se mantendrá constante o aumentar ligeramente.
Hay muchos indicadores visuales cuando el pulmón se convierte en peligro durante un experimento. El pulmón se convierte en un edematosand crece rápidamente en tamaño y peso. El color de los cambios pulmonares (desde una tan-rosa a blanco) y bolsas de líquido puede ser identificado en el tejido. Si la tráquea o los pulmones rupturas de barotrauma o más de distensión, habrá burbujeando desde el punto de la lesión (Figura 12B). La producción de oxígeno disminuye y el PVR y el cumplimiento se incrementará dramáticamente.
El potencial del uso de un modelo EVLP en animales pequeños como roedores abre la puerta a futuros estudios mejorando el tratamiento de los trasplantes de pulmón. Sin embargo, el modelo animal pequeño requiere una mejor comprensión de imitar verdaderamente un trasplante de pulmón. Este modelo puede ser utilizado en el futuro para mejorar los tratamientos médicos y definir los parámetros de línea de base para futuros estudios de trasplante de pulmón.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer la asistencia de Harvard Apparatus, especialmente Stephanie Pazniokas, MS (Fisiología de Sistemas y Medicina Regenerativa) por su ayuda en el circuito de montaje, modificación y resolución de problemas del circuito de perfusión y XVIVO perfusión (Daniel Martinelli, CCP, CTP) para proporcionando un uso no clínico plejia pulmonar.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
IPL-2 Basic Lung Perfusion System | Harvard Apparatus | ||
Tweezer #5 stainless steel, curved 11cm | Kent Scientific Corporation | IND500232 | |
Tweezer #5 Dumostar, 11cm | Kent Scientific Corporation | INS500085-A | |
Tweezer #7 Titanium, 12cm tips curved | Kent Scientific Corporation | INS600187 | |
McPherson-Vannas Scissors 8cm, Str 5mm | Kent Scientific Corporation | INS14124 | |
Vannas Scissors 8cm Str 5mm | Kent Scientific Corporation | INS14003 | |
Instrument Sterilization Tray 5" x 7" | Kent Scientific Corporation | INS800101 | |
Heparin 30,000 units per 30mL | APP Pharmaceuticals | Supplied from OSU Pharmacy | |
Ketamine 500mg per 5mL | JHP Pharmaceuticals | Supplied from OSU Pharmacy | |
Xylazine 100mg per 1mL | Akorn | Supplied from OSU Pharmacy | |
10cc insulin syringe 29 Ga x 1/2" needle | B-D | 309301 | |
Hyflex NBR | Ansell | S-17310M | Bite proof gloves |
BL1500 | Sartarius | Practum 1102-1S | Scale |
Large Flat Bottom Restrainer | Braintree Scientific Inc | FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat | Rat tunnel for injection |
Sterling Nitrile Powder-free Exam Gloves, Large | Kiberly-Clark | 50708 | |
Rapidpoint 405 | Siemens | blood gas analyzer | |
Fiberoxygenator D150 | Hugo Sachs Elektronik | PY2 73-3762 | |
LabChart v7.3.7 | ADInstruments | ||
Tracheal cannula | Harvard Apparatus | 733557 | |
Pulmonary Artery cannula | Harvard Apparatus | 730710 | |
Left Atrium cannula | Harvard Apparatus | 730712 | |
Peristaltic Pump | Ismatec | ISM 827B | |
Small Animal Ventilator model 683 | Harvard Apparatus | 55-000 | |
Ecoline Star Edition 003, E100 | Lauda | LCK 1879 | Water Heater |
Tubing Cassette | Cole-Parmer | IS 0649 | |
Connect kit D150 | Cole-Parmer | VK 73-3763 | |
PowerLab 8/35 | ADInstruments | 730045 | |
TAM-A transducer amplifier module type 705/1 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 73-0065 | |
TAM-D transducer amplifier type 705/2 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 73-1793 | |
SCP Servo controller for perfusion type 704 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 732806 | |
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731747 | |
VCM ventilator control module type 681 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731741 | |
TCM time control module type 686 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731750 | |
IL2 Tube set for perfusate | Harvard Apparatus | 733842 | |
Tube set for moist chamber | Harvard Apparatus | 73V83157 | |
Tygon E-3603 Tubing 2.4mm ID | Harvard Apparatus | 721017 | perfusate line entering lung |
Tygon E-3603 Tubing 3.2mm ID | Harvard Apparatus | 721019 | perfusate line leaving lung |
low potassium dextran glucose solution | flushing the lung |