This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.
Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules.
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules.
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.
هدف cryoEM هو الحصول على الإلكترون صور مجهرية من الجزيئات في ولاية المائية الأصلية الخاصة بهم. بحكم تضمين جزيء في الماء المزجج، عينة المجمدة-المائية يمكن إدخالها مباشرة وتصور في الصك TEM. التزجيج، من خلال تجميد فلاش (10،000 س C / ثانية) التي تحققت، يتجمد العينة دون تبلور الماء ويضمن إعادة ترتيب الجزيئية خلال تجميد ضئيلة. فائض نثر الإلكترون من العينة فيما يتعلق عازلة المحيطة يضفي تباين صغيرة ولكنها كافية لرؤية جزيء في غياب أي وصمة عار 1. ويمكن بعد ذلك معالجة الصور محوسب استخدامها لإعادة جزيء في هيكل 3D. الجزيئات الكبيرة في نطاق ~ 500 kDa- متعددة نجمة داود الحمراء هي عينات مثالية لcryoEM (تمثل أكثر من 80٪ من الضفة المجهر الإلكتروني البيانات (بنك المعلومات) إدخالات)؛ وتشمل هذه البروتينات والمجمعات البروتين، البروتين النووي حمض جomplexes، وبروتينات الغشاء جزءا لا يتجزأ من طبقة ثنائية. وهذه الجزيئات أقل عرضة للتبلور (مع إدخالات أقل من 2٪ في قاعدة البيانات PDB) ومع ذلك هو الحال في كثير من الأحيان أن أجزاء أصغر حلها عن طريق البلورات بالأشعة السينية أو NMR يمكن رست في المغلف 3D التي أنشأتها cryoEM. من ناحية أخرى، فإن بعض من أكبر الهياكل حلها عن طريق cryoEM هي التعرف داخل الخلية الكاملة رقيقة المقطع TEM 2. وهكذا، cryoEM الجسور فعال الفجوة حجم والقرار بين الهياكل التحت خلوية وذرية.
CryoEM يعكس أفضل هيكل الأصلي للجزيء لمن طريقة أكثر كلاسيكية من تلطيخ السلبية (NS)، حيث جزيء هو المجففة وتحيط به طبقة من وصمة عار المعادن الثقيلة حيث المنطقة من وصمة عار الإقصاء يخلق يتناقض بشدة "سلبية" صورة 3. في كلتا الحالتين ينتج شعاع الالكترون 2D صور الإسقاط من الجزيئات تسمى الجزيئات، حيث قHAPE يعتمد على التوجه للجزيء فيما يتعلق شعاع الالكترون. العديد من الجسيمات، على الأقل ~ 1،000 وبدون حد أقصى، يمكن تحليلها على الكمبيوتر مع "تحليل واحد الجسيمات" (SPA) برنامج لزيادة إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNR) على الرغم من المتوسط، وإيجاد المعلمات الجسيمات التوجه المكاني هناك حاجة لإعادة هيكل 3D على جزيء من قبل الظهر 4-7 الإسقاط. NS، مع ارتفاع SNR، ويستخدم لعينة التوصيف الأولي وتوليد دي نوفو إعادة الإعمار 3D. قرارها نادرا ما يتجاوز 20 Å، التي تفرضها الجفاف وحجم الحبوب والمعادن الثقيلة. بشكل عام، من أجل تقرير الهيكلي cryoEM 3D، ويتم الحصول على إعادة الإعمار 3D منخفضة الدقة أول من NS ثم يستخدم cryoEM لصقل هذه منخفضة الدقة خريطة أولية لمواصلة دراسة جزيء في حالته المائية الأم، لنرى هيكلها الداخلي، وزيادة قرارها. لاالشركة المصرية للاتصالات أنه إذا تم تشويه نموذج NS (على سبيل المثال الأكثر شيوعا هو تسطيح الناجمة عن الجفاف 8)، وكان للجسيمات cryoEM SNR منخفضة، ثم تشويه يمكن أن تحمل في نموذج cryoEM (القطع الأثرية نموذج التحيز، وهو أمر شائع في البلدان المنخفضة SNR مجموعات البيانات 9). أن التشوه الهيكلي تؤدي إلى عدم تطابق بين NS وcryoEM الجسيمات الأولية وبين الجسيمات cryoEM الخام والتوقعات المقابلة من نموذج 3D متعامد على اتجاه التسوية. قد نموذج التحيز حل في حد ذاته كما يخضع نموذج 3D دورات الصقل المتعاقبة. يجب أن لا تحدث، والتي سيتم الكشف عن عدم وجود مراسلات بين الجسيمات cryoEM الخام والتوقعات المناظرة من نموذج 3D، ثم يجب أن تبنى نموذج دي نوفو من البيانات cryoEM. وثمة نهج جيد يمكن أن يكون لاستخدام خوارزمية إعادة الزاوي 10، والتي قد تسفر عن عدة مجلدات 3D ممكن، ومن ثم استخدام نموذج NS 3D لتحديد أفضل نموذج ممكن cryoEMالتي ستكون مزيد من الصقل 11. استراتيجية أفضل هو زيادة SNR من مجموعة البيانات cryoEM (انظر قسم مخصص في مناقشة).
جودة البيوكيميائية للجزيء النقى لها تأثير أقصى في النتيجة النهائية. وجزيء، تنقيته من الأنسجة أو المعبر عنها في أنظمة مغاير، تحتاج إلى وجود درجة عالية من النقاء وأن تكون سليمة من الناحية الهيكلية. لا ينبغي أن تشكيل المجاميع ولا ينبغي أن تفصيل. لتحديد التشكل معين، ينبغي للظروف التحضير تعزيز دولة بتكوين موحدة. لدراسة المجمعات، فمن الأمثل أن لهم ك D هو في حدود نانومتر، وقد استخدمت على خلاف ذلك مثبتات بنجاح لتحقيق الاستقرار في أقل التفاعلات تقارب 12،13.
الصور cryoEM غير المجهزة تعطي معلومات قيمة عن أبعاد، المخطط العام، وحالة التجميع / multimerization، والتجانس، والبنية الداخلية للmacromolecuجنيه. ومع ذلك ومما يعزز من إمكانات تقنية إلى حد كبير مع معالجة الصور. هيكل يكشف 3D الهندسة المعمارية الشاملة للجزيء، وموقع 3D من بروابط ومفارز، والتغيرات متعلق بتكوين، وتمكن لرسو السفن هياكل ذرية تحددها البلورات بالأشعة السينية أو NMR. كمية المعلومات لإعادة الإعمار 3D يزيد تدريجي كما القرار هو زيادة: في العام 15-20 قرار Å يسمح لرسو السفن لا لبس فيه هياكل ذرية، في 9-10 اللوالب Å ألفا هي مرئية كما قضبان، في 5 Å فمن الممكن أن نستشف أوراق بيتا، وعلى قرارات 3.5 Å وأفضل أنه من الممكن بناء النموذج الذري 14.
إمكانية الحصول على صور بالمعلومات وإعادة الإعمار 3D باستخدام SPA من كميات صغيرة نسبيا من عينة جعل cryoEM تقنية جذابة، كما 3-5 ميكرولتر من 0.05 على الأقل ملغ / مل تكفي لإعداد شبكة واحدة TEM. متطلبات الحد الأدنى مفيدةلcryoEM هي البرد الغطاس محلية الصنع أو التجارية، ومجهر الكتروني مع فراغ عالية جدا، ووسائل الإعلام تسجيل صورة وعدة جرعة منخفضة، والبرد حامل مع محطة الضخ لديها، وهو جهاز التفريغ توهج، والمبخر. الميزات غير الضرورية ولكن أبعد من المرغوب فيه على TEM هي كاميرا CCD (موجودة في جميع الحقوق الحديثة) أو كاشف الإلكترون المباشر، بندقية الانبعاثات الميدان (FEG)، والترشيح الطاقة، والإنتاجية العالية البرمجيات جمع البيانات. هذا البرنامج من حيث المبدأ تمكن جمع عشرات الآلاف من الجزيئات في جلسة واحدة cryoEM 15، ولكن زيادة احتياجات تخزين البيانات واللاحقة تحت إشراف تحتاج إلى وقت ما بعد المعالجة إلى أن تؤخذ بعين الاعتبار. FEG جنبا إلى جنب مع وظيفة نقل النقيض (CTF) تصحيح يكمن وراء معظم عمليات إعادة البناء 3D التي وصلت إلى قرار كاف لتصور اللوالب ألفا. في تلك المرحلة، ومستوى القرار هو أيضا عينة التي تعتمد على: بلغت 10 قرار Å هو أقل شيوعا للبروتينات الغشاء في حين إذاترتيب عال من التماثل موجود ثم قرار الذري هو أكثر تحقيقه. وقد مكنت التطورات الأخيرة في كشف الإلكترون مباشرة قرار الذري حتى بالنسبة الجزيئات مع انخفاض (4X) أو أي التماثل، حيث جودة cryoEM خرائط كثافة الإلكترونات مباريات هذه مستمدة من بيانات حيود الأشعة السينية 16،17.
وتقدم أمثلة عملية توضح قدرات تقنية هنا لمدة أربع أنواع من الجزيئات الهامة حيث يوجد cryoEM كبير دورا مستمرا في تقرير الهيكلي. (ط) مع التماثل icosahedral في أن يزيد من مجموعة البيانات بنسبة 60 أضعاف وحجم كبير في أن يسمح المؤمنين والمواءمة استنساخه، قد تم حلها هياكل عدة فيروسات icosahedral بقرار شبه الذرية التي كتبها cryoEM تليها SPA 18. وتبين لنا مثالا على فئة من الفيروسات icosahedral، والفيروسات الغدة المرتبطة (AAVs)، والتي هياكل شبه الذرية التي كتبها cryoEM وcryoEM HY / الأشعة السينيةطرق brid توجد 19،20. (ب) تشمل الجزيئات مع بنية حلزونية الأنابيب الدقيقة، خيوط والفيروسات. الوحدات المتكررة على طول محور حلزونية يمكن تحليلها بواسطة إصدار أكثر تعقيدا من SPA تكييفها وفقا لهندسة حلزونية 21. في المثال نظهر فيروس تبرقش التبغ (TMV)، وفيروس RNA التي تم حلها بقرار النووي بحلول cryoEM 22. (ج) وقد درس البروتينات القابلة للذوبان كبيرة بما فيه الكفاية. ومن بين هذه الجزيئات تشكيل اسطوانات multimeric متناظرة تشكل بنية المتكررة في كثير من الأحيان حلها في قرار subnanometer 23،24. هنا نعرض صور KLH، حاملة الأكسجين رخو، حيث تم إنشاء نموذج الجزيئي الهجين من cryoEM / الأشعة السينية طرق البلورات الهجين 25. (د) بروتينات الغشاء هي فئة هامة من البروتينات. أنها تشكل حوالي 1/3 من البروتينات المشفرة بواسطة الجينوم البشري، ولكنها من الصعب تميز هيكليا بسبب التعقيدات المرتبطة TRاستقرار نطاق ansmembrane 26، التي تشكل أقل من 1.5٪ من الهياكل حلها عن طريق أي تقنية الهيكلية مجتمعة. ويتمثل دور cryoEM و 3D إعادة الإعمار في تقرير الهيكلي مع مستقبلات ryanodine (RYR)، وهي كبيرة حقيقية النواة الكالسيوم داخل الخلايا 2+ قناة مهمة في تقلص العضلات وإشارات الدماغ. أعلى الهياكل قرار cryoEM حتى الآن، مع 10 قرار Å، تكشف عن هيكل الثانوي 27.
وقد ساهم TEM تليها SPA العديد من هياكل 3D الجزيئات، تقترب من 2،000 الإدخالات في بنك المعلومات بحلول منتصف عام 2014. وبصفة عامة، لجزيء معين، يتم تحديد هيكل 3D منخفضة الدقة أولا من البيانات NS، الأمر الذي قد يعقبه المرتفع هيكل قرار cryoEM 3D. على النقيض عال من حدود الجزيئية التي تقدمها NS، مما يسهل إعادة الإعمار 3D الأولى، ويتم تكرير في وقت لاحق من قبل cryoEM مع قدرته على رسم خريطة للهيكل الداخلي للجزيء في حالته المائية بالكامل، وإمكانية لتحقيق دقة أعلى من ذلك بكثير. ميزة أخرى لcryoEM هي القضاء على الإجهاد والجفاف التي قد تؤدي إلى انهيار جزيء. وبالإضافة إلى ذلك، هناك إمكانية لحذف الدعم الكربون، الذي يلغي آثار امتصاص السطح ممكن، ويدل على التشكل التي يعتمد جزيء في الحل. تلطيخ البرد سلبي، وهو مزيج من cryoEM وNS، يتيح التباين العالي في HYD بالكاملتصنيف العينة، ويمكن أن يؤدي أيضا إلى إعادة الإعمار 3D باستخدام SPA، ومع ذلك فقد كان أقل استخداما، مع أقل من 10 إدخالات بنك المعلومات، وذلك جزئيا بسبب وصمة عار في حد ذاته قد تتداخل مع سلامة جزيء 31. اثنين من التقنيات TEM أخرى تفضي إلى إعادة الإعمار 3D هي البلورات الإلكترون 2D والتصوير المقطعي الإلكترون. 2D البلورات الإلكترون يتطلب مستو أو أنبوبي وضوح الشمس. يستخدم حيود الإلكترون الكريستال لإعادة الإعمار 3D مما قد يؤدي إلى قرار الذري 32. في التصوير المقطعي الإلكترون العينات الثابتة المزجج أو تقليديا، يتم تدوير عنصر جزيء أو دون الخلوي داخل TEM لاحق إعادة بناء التصوير المقطعي 33، مع ميزة أن الأجسام المفرد يمكن إعادة بنائها. ولكن في الوقت الحاضر هذه التقنية لديها الحد قرار تتراوح 40-20 Å 34،35. بين كل هذه التقنيات الجزيئية TEM، كان SPA من NS وcryoEM البيانات الأكثر على نطاق واسعالمستخدمة. وتكرس بروتوكول يتضح هنا للحصول على صور cryoEM مناسبة لتحليل SPA. مع ذلك معظم بروتوكول ينطبق على cryoEM من 2D البلورات وعينات تصوير الشعاعي الطبقي أيضا.
جلسة cryoEM الناجحة تعتمد على نجاح الجمع بين العديد من الخطوات الحاسمة. جوانب مهمة أن نأخذ في الاعتبار، شرح التحف cryoEM المشترك وكيفية تجنب وصفها لهم في الفقرات التالية. يصف هذا القسم أيضا مبادئ توجيهية جمع البيانات للحصول على جودة عالية 3D اعادة البناء باستخدام طريقة SPA.
تجنب التحول إلى البلورية الجليد. وهناك جانب المركزي هو أن عينة تحتاج إلى البقاء في ولاية زجاجي من لحظة في جميع أنحاء الملاحظة TEM-تغرق البرد. وهكذا بعد تغرق العينة في الإيثان السائل يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في النيتروجين السائل (-196 درجة مئوية) أو الهليوم السائل (-269 درجة مئوية) درجات الحرارة. ارتفاع درجات الحرارة إلى أعلى -135 ° C يحول الماء الزجاجي فيعلى المياه البلورية. ثم إعادة ترتيب الجزيئات قد يستغرق مكان وبلورات الماء تهيمن على صورة (الشكل 3A)؛ يجب التخلص من العينة. عرضي عينة الاحماء يمكن أن يحدث إذا البرد تغرق، ونقل الشبكة المجمدة بين حاويات (حتى لو كان يحميها gridbox)، و / أو البرد حامل الإدراج في TEM بطيئة جدا، أو إذا كانت ملاقط معالجة ما قبل كاف تبريد. هام تدهور فراغ في TEM على البرد نقل (العينة الفخاخ الباردة أكثر دفئا الهواء الداخل) قد يصبح دافئا أيضا العينة. وأخيرا، والإفراط في التشعيع من العينة يمكن أن يؤدي أيضا إلى الانتقال إلى البلورية الجليد.
تقليل التلوث الجليد. ونظرا لحجم العينة صغير (3-5 ميكرولتر) تطبق على الشبكة TEM، قد تبخر التركيز مكونات عازلة (الملح والمنظفات الصناعية)، وبالتالي يؤثر على سلامة الجزيئات بما في ذلك فقدان الدولة multimeric. ارتفاع نسبة الرطوبة النسبية (RH) المكروية أو غرفة تحايلالصورة هذه المشكلة. بدلا من ذلك البرد تغرق يمكن القيام به في غرفة باردة البيئية التهوية بما فيه الكفاية. بعد تغرق البرد RH يجب أن تكون في أدنى مستوى ممكن لمنع التلوث الجليد، أو التكثيف من الرطوبة المحيطة على البرد الشبكة، مثل البرد الشبكة نفسها بمثابة فخ بارد. يتكون الجليد تلوث الجسيمات مع التباين العالي وليس طيدة مع أحجام تتراوح ما بين 5 ~ نانومتر، وعدة ميكرون التي تتداخل مع أو حتى منع تماما الصورة. تجنب مسودات الهواء، والحديث / التنفس نحو الشبكة البرد أثناء نقل الهواء، والحد المحيطة RH. وينبغي أيضا تجاهل مفتوحة حاويات النيتروجين السائل مع الماء المكثف (مرئية كما الجسيمات العالقة البيضاء).
تعظيم التوجهات الجزيئات / وجهات النظر. للحصول على الدعم العينة، وهو خيار أن يكون جعلت هو بين شبكات هولي الحقيقية والكربون رقيقة على شبكات هولي. هذا يعتمد على (ط) كيف تنتشر العينة على فيلم الكربون مقابل الثقوب الكربون، (ب) عينة المتاحة بغية دراسته واقرارهntration، والثقوب العارية قد تتطلب تركيز 100X أعلى من الدعم الكربون لكثافة الجسيمات مماثلة على الصورة (من ~ ،02-2 ميكرومتر)، و (ج) كيف عشوائي هو توزيع التوجهات جزيء. لاحظ أن التفريغ توهج، مما يجعل محبة للماء الكربون، سيكون لها أثر هام في جميع الجوانب الثلاثة وأن هذا سيكون عينة التي تعتمد على. وفيما يتعلق التوجه للجزيء، في حين أن عرض المتكرر أمر مرغوب فيه لتحديد الهيكلي الأولي من إعادة الإعمار المخروطية عشوائي، عشوائية في وجهات النظر الجزيئات أمر مرغوب فيه عند تنقيح إعادة الإعمار 3D إلى دقة أعلى. في مثالنا، يتفاعل RyR1 مع الكربون بهدف المفضل "أربعة أضعاف" (الشكل 2D) ويتطلب شبكات هولي لالعشوائية من التوجهات ودقة أعلى 36.
تعظيم SNR. إن أفضل استراتيجية لزيادة SNR هو الحد من مصادر خلفية من الضوضاء. الجليد المفرطسمك و(إذا كان موجودا) سمك الفيلم الكربون يتجاوز ما هو مطلوب لدعم وترسيخ والبروتين إضافة الضوضاء إضافية. وهكذا ينبغي خفض سماكة الجليد لأدنى حد الضرورة عن طريق التحكم النشاف الوقت، الضغط، RH، ونوعية ورق الترشيح. للحصول على الدعم الكربون، والطبقات رقيقة (~ 5 نانومتر) فيلم الكربون على الفيلم سمكا الكربون هولي: يوفر الكربون هولي سميكة مقاومة ميكانيكية بينما يتم تصوير العينة على حفرة مغطاة الكربون رقيقة. من ناحية أخرى، لاحظ أن الجليد رقيقة للغاية و / أو قد ينتج الكربون في دعم كسر بسهولة يمكن أن تتحول إلى شبكة الإنترنت (الشكل 3D). لتعظيم SNR، وينبغي تجنب أي مكون من مكونات عازلة غير الضرورية. للبروتينات الغشاء، المنظفات يأخذ عدد كبير على النقيض من ذلك (انظر الشكل 2D، اللوحة اليمنى). وبالإضافة إلى ذلك عن طريق تقليل التوتر السطحي المنظفات يغير الطريقة التي تنتشر العينة على الدعم. بعض البروتينات الغشاء تتطلب وجود الدهون بالإضافة إلى ديتergent، مما يقلل كذلك التباين. للتغلب على هذه العينة يمكن أن تضعف في منطقة عازلة مع انخفاض تركيز المنظفات وبدون دهن قبل البرد تغرق 37. تظهر المنظفات البديلة الجديدة 16 واستخدام nanodisks 38 لتحقيق الاستقرار في مكون مجال الغشاء أن يكون النهج الناجحة للبروتينات غشاء التصوير من قبل cryoEM.
السعي لصور ذات جودة عالية والاستعداد لتصحيح CTF. عينات المزجج تتطلب القيم يزيل التباؤر عالية لتوليد صورة كافية (المرحلة) على النقيض حيث CTF، وظيفة التي تتعلق كثافة لتردد، لديها العديد من الصفر التحولات، وعند هذه النقطة لا يوجد المعلومات. في حين تصحيح CTF ليس من الضروري لإعادة الإعمار 3D منخفضة الدقة، عندما تهدف لدقة أعلى، لاسترداد تمثيل دقيق للكائن 3D، الصور مع defoci مختلفة تحتاج إلى جمعها بحيث يمكن أن يتم تصحيح تمويل الإرهاب الحسابية.يتم تضمين تقرير CTF والتصحيح في حزم البرمجيات SPA الرئيسية 4-7. تفاصيل يمكن العثور في أماكن أخرى 39. لتصحيح CTF الأمثل، واستخدام مجموعة من defoci. استراتيجية جيدة لبالتناوب بين 3-4 القيم يزيل التباؤر. قيم تعتمد على حجم جزيء (أحجام أكبر تتطلب كميات أقل من يزيل التباؤر)، وسمك الجليد / الكربون (يتطلب عينة أرق أقل يزيل التباؤر)، والجهد (انخفاض الجهد يتطلب أقل يزيل التباؤر). 200 كيلو فولت، مجموعة بداية جيدة من القيم هو 2.5 و 3 و 3.5 و 4 ميكرون يزيل التباؤر. وCTF يظهر كما بالتناوب حلقات من كثافة عالية ومنخفضة (ثون يرن 40) في تمثيل الفضاء المتبادل، طيف الطاقة. عرض طيف الطاقة سوف تكشف عن إمكانية حلها؛ تردد أوسع حلقة ثون مرئية هو الأقرب تقدير مسبق للقرار يمكن بلوغه. يجب فحص طيف الطاقة بشكل دوري، واللابؤرية (غير التعميم) حلقات ثون (الشكل 3C) ينبغي تصحيحه مع stigmator الهدف. وينبغي أن تكون حلقات ثون مرئية على الأقل حتى القرار المطلوب.
وهناك مجموعة البيانات cryoEM تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول يمكن معالجتها مباشرة من قبل SPA من أجل توليد إعادة الإعمار 3D. حتى مع وجود عينة مثالية، فإن نوعية إعادة الإعمار 3D تعتمد على الأداء ومواصفات المعدات TEM، وعلى معالجة الصور. مع استمرار التحسن في كل من هذه الجبهات، ومع إشارة خاصة إلى كشف الإلكترون مباشرة وضعت مؤخرا، وإمكانية الحصول على اعادة البناء 3D في قرار الذري أكثر اتساقا هو أقرب مما كانت عليه في أي وقت مضى.
The authors have nothing to disclose.
We thank the kind donations of AAV5 sample by Mavis Agbandje-McKenna and Antonette Bennett, and of TMV sample by Ruben Diaz. This work is supported by American Heart Association grant 14GRNT19660003 and VCU startup funds to MS.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ethane | Airgas | 371745 | 99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable |
Liquid nitrogen | Airgas | 27135 | 99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs. |
Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers | Ted Pella | 5326 | |
Mica sheets, 1 x 4 cm | Ted Pella | 54 | |
Graphite rods, presharpened size 1/8” dia x 2 ¼” long tip 0.039” dia neck type | Electron Microscopy Sciences | 70220-45 | |
350 ml cryo-dewars | Pope | 8600 | |
Cu 400 mesh holey grids Quantifoil | Quantifoil | Q10525 | |
Cu 400 mesh holey grids C-Flat | Protochips | CF-1.2/1.3-4C | |
Glow discharge device | Electron Microscopy Sciences | Model E7620 | |
Turbo pumping station | Gatan | Model 655 | |
Carbon evaporator | Denton Vaccum | Model 502B | |
Freeze plunger | FEI | Vitrobot Mark IV | |
Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT | http://grigoriefflab.janelia.org/ctf | ||
Image Processing software EMAN | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | ||
Image Processing software Spider | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
Image Processing software Freealign | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | ||
3D visualization software Chimera | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | ||
Native Keyhole Limpet Hemocyanin | Biosyn |