This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.
Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules.
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules.
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.
Målet med cryoEM er at opnå elektronmikroskopiske billeder af makromolekyler i deres native hydratiseret tilstand. I kraft af at indlejre makromolekylet i forglasset vand, kan en frossen-hydreret prøve indføres direkte og visualiseres i TEM instrument. Forglasning opnået ved flash frysning (10.000 o C / sek), fryser prøven uden vand krystallisation og sikrer, at molekylære omlejringer under frysning er ubetydelige. Overskuddet af elektron spredning af prøven med hensyn til den omgivende buffer giver en lille, men tilstrækkelig kontrast til se makromolekylet i fravær af enhver plet 1. Computerized billedbehandling kan derefter anvendes til at genskabe makromolekyle 3D struktur. Store makromolekyler i ~ 500 kDa- multi MDa serie er ideelle prøver til cryoEM (tegner sig for over 80% af Electron Microscopy Data Bank (EMDB) poster); disse omfatter proteiner, protein-komplekser, protein-nukleinsyre complexes og membranproteiner indlejret i et dobbeltlag. Disse makromolekyler er mindre tilbøjelige til at blive krystalliseret (med mindre end 2% poster i FBF databasen) alligevel er det ofte sådan, at mindre stykker løses ved røntgenkrystallografi eller NMR kan være forankret i 3D kuvert skabt af cryoEM. På den anden side, nogle af de største strukturer løses ved cryoEM kan identificeres inden for det fulde celle ved tynde sektion TEM 2. Således cryoEM effektivt bro over størrelse og opløsning kløften mellem subcellulære og atomare strukturer.
CryoEM afspejler bedre makromolekylet native struktur end de mere klassiske metode til negativ farvning (NS), hvor makromolekylet er dehydreret og omgivet af et lag af tungmetal plet, hvorved regionen pletten udelukkelse skaber en stærkt kontrast "negativ" image 3. I begge tilfælde elektronstrålen producerer 2D projektion billeder af makromolekyler, kaldet partikler, hvor Shape afhænger af orienteringen af makromolekylet med hensyn til elektronstråle. Mange partikler, i det mindste ~ 1000 og uden nogen øvre grænse, kan analyseres på computeren med "enkelt partikel analyse" (SPA) software for at øge signal-støj-forholdet (SNR) selvom gennemsnit til, og at finde den partikel orientering parametre rumlige nødvendig for at genskabe makromolekylet 3D struktur ved tilbage projektion 4-7. NS, med højere SNR, anvendes til foreløbig prøve karakterisering og til at generere en de novo 3D rekonstruktion; sin beslutning sjældent overstiger 20 A, som pålægger dehydrering og størrelsen af heavy metal korn. Generelt for cryoEM 3D strukturelle beslutsomhed, en lav opløsning 3D rekonstruktion først opnås fra NS og derefter cryoEM bruges til at forfine denne lav opløsning indledende kort til yderligere undersøgelse makromolekylet i dets native hydreret tilstand, for at se dens interne struktur, og øge sin beslutning. Ingente at hvis NS modellen blev fordrejet (det mest almindelige eksempel er udfladning følge af dehydrering 8) og cryoEM partiklerne havde lav SNR, så forvrængning kunne bære i cryoEM (modellen bias artefakt, som er fælles i lav SNR datasæt 9). Strukturel forvrængning ville resultere i misforhold mellem NS og cryoEM rå partikler og mellem de rå cryoEM partikler og tilsvarende fremskrivninger af 3D-modellen vinkelret på udfladning retning. Model skævhed kan løse sig selv som 3D-modellen gennemgår successive raffinement cykler. Skulle det ikke ske, som ville blive opdaget som manglende overensstemmelse mellem rå cryoEM partikler og tilsvarende fremskrivninger fra 3D-modellen, så en de novo-model skal bygges fra cryoEM data. En god metode kunne være at bruge den kantede rekonstituering algoritmen 10, som kan give flere mulige 3D-volumener, og derefter bruge NS 3D-modellen til at vælge den bedst mulige cryoEM modelder vil blive yderligere forbedret 11. En endnu bedre strategi er at øge SNR af cryoEM datasæt (se særligt afsnit i Discussion).
Den biokemiske kvalitet af det rensede makromolekyle har en yderst indflydelse på det endelige resultat. Det makromolekyle oprenses fra væv eller udtrykkes i heterologe systemer, skal have en høj grad af renhed og at være strukturelt intakt. Den bør hverken danne aggregater bør heller ikke disaggregere. For at definere en bestemt konformation, bør præparatet fremme en ensartet konformationel tilstand. For at undersøge komplekser, er det optimalt, at deres Kd er i nM-området, ellers fikseringsmidler med succes er blevet anvendt til at stabilisere lavere affinitet interaktioner 12,13.
Ubehandlede cryoEM billeder giver værdifulde oplysninger om dimensionerne, generel oversigt, tilstand af sammenlægning / multimerisering, homogenitet, og intern struktur af macromolecule. Ikke desto mindre det potentiale af teknikken er langt forbedret med billedbehandling. En 3D-struktur afslører makromolekylet samlede arkitektur, 3D placeringen af ligander og underenheder, konformationelle ændringer og muliggør sammenkobling af atomare strukturer bestemt ved røntgenkrystallografi eller NMR. Mængden af oplysninger af en 3D-rekonstruktion øger trinvis som opløsningen øges: generelt 15-20 en resolution tillader entydig docking af atomare strukturer på 9-10 Å alfa spiraler er synlige som stænger, ved 5 Å er det muligt at skelne beta ark, og ved beslutninger af 3,5 Å og bedre er det muligt at bygge en atommodel 14.
Muligheden for at opnå informative billeder og en 3D-rekonstruktion ved hjælp SPA fra relativt små mængder af prøven gøre cryoEM en attraktiv teknik, som 3-5 pi på mindst 0,05 mg / ml er tilstrækkelig til at fremstille en TEM nettet. Minimumskravene instrumentale kravfor cryoEM er en hjemmelavet eller kommerciel cryo-stempel, et elektronmikroskop med ultra højt vakuum, image optagemedie og lavdosis kit, et cryo-holder med sin pumpestation, en glimudladningsanordning, og en fordamper. Ikke-essentielle, men yderligere ønskelige funktioner på TEM er CCD-kamera (til stede i alle moderne systemer) eller en direkte elektron detektor, felt emission pistol (FEG), energi filtrering og high throughput dataindsamling software. Denne software i princippet gør det muligt at indsamle titusindvis af partikler i en enkelt cryoEM session 15, men de øgede behov for datalagring og efterfølgende overvåget efterbehandling tid behov for at blive taget i betragtning. FEG kombineret med funktion kontrast overførsel (CTF) korrektion ligger bag de fleste 3D rekonstruktioner, der nåede opløsning er tilstrækkelig til at visualisere alpha helixer. På det tidspunkt, omfanget af opløsning er også prøve-afhængig: når 10 Å opløsning er mindre almindeligt for membranproteiner hvorimod hvishøj orden af symmetri er til stede så atomar opløsning er mere opnåeligt. Den seneste udvikling af direkte elektron detektorer har aktiveret atomar opløsning selv for makromolekyler med lav (4x) eller ingen symmetri, hvor kvaliteten af de cryoEM elektron tæthed maps matcher disse stammer fra X-ray diffraction data 16,17.
Praktiske eksempler illustrerer mulighederne i teknikken leveres her i fire vigtige typer af makromolekyler hvor cryoEM har en vedvarende chef rolle i deres strukturelle beslutsomhed. (I) Med deres tyvefladet symmetri, der øger datasæt med 60 gange og deres store størrelse, som tillader trofast og reproducerbar justering, har strukturerne af flere icosahedral vira blevet løst til nær-atomar beslutning cryoEM efterfulgt af SPA 18. Vi viser et eksempel på en klasse af icosahedral vira, de adeno-associerede vira (AAV'er), som nær-atomare strukturer ved cryoEM og ved cryoEM / x-ray hyfindes brid metoder 19,20. (Ii) Macromolecules med spiralformet struktur omfatter mikrotubuli filamenter og vira. Deres gentagne enheder langs den spiralformede akse kan analyseres ved en mere kompleks version af SPA tilpasset den spiralformede geometri 21. I eksemplet viser vi tobakmosaikvirus (TMV), et RNA-virus, der er blevet løst til atomar resolution af cryoEM 22. (Iii) Store opløselige proteiner er blevet udførligt undersøgt. Blandt disse makromolekyler danner symmetriske multimere cylindre udgør et tilbagevendende arkitektur ofte løses ved subnanometer opløsning 23,24. Her viser vi billeder af KLH, en hvirvelløse ilt bærer, hvor en hybrid molekylær model blev skabt af cryoEM / røntgenkrystallografi hybrid metoder 25. (Iv) Membranproteiner er en vigtig klasse af proteiner; de udgør omkring 1/3 af proteinerne kodet af det humane genom, men de er vanskelige at karakterisere strukturelt grund kompleksiteter forbundet med stansmembrane domæne stabilisering 26, der udgør mindre end 1,5% af de strukturer, løses ved en hvilken som helst strukturel teknik kombineret. Rolle cryoEM og 3D rekonstruktion i deres strukturelle bestemmelse er eksemplificeret med ryanodine receptor (RyR), en stor eukaryot intracellulær Ca2 + kanal vigtig i muskelsammentrækning og hjerne signalering. Den højeste opløsning cryoEM strukturer til dato, med 10 en beslutning, afslører sekundær struktur 27.
TEM efterfulgt af SPA har bidraget med mange makromolekylære 3D strukturer, nærmer 2.000 poster i EMDB medio 2014. Generelt for en given makromolekyle, er en lav opløsning 3D-struktur først bestemmes fra NS data, som kan efterfølges af en på højere Opløsning cryoEM 3D struktur. Den høje kontrast for de molekylære grænser fra NS, hvilket letter den første 3D-rekonstruktion, senere raffineres af cryoEM med sin evne til at kortlægge den interne struktur af makromolekylet i sin fuldt hydratiseret tilstand, og muligheden for at opnå meget højere opløsning. En anden fordel ved cryoEM er afskaffelsen af dehydrering stress, der kan resultere i kollaps af makromolekylet. Derudover er der mulighed for at udelade carbonbæreren, hvilket eliminerer mulige overflade absorption og viser konformation, makromolekylet vedtager i opløsning. Cryo-negativ farvning, en kombination af cryoEM og NS, giver høj kontrast i en fuldt hydvurderet prøve og kan også føre til 3D rekonstruktion hjælp SPA, men det er mindre hyppigt anvendt, med mindre end 10 EMDB poster, delvis fordi pletten selv kan forstyrre integriteten af makromolekylet 31. To andre TEM teknikker fremmer 3D rekonstruktion er 2D elektron krystallografi og elektron tomografi. 2D elektron krystallografi kræver en plan eller rørformet krystal; krystallen er elektron diffraktion bruges til 3D rekonstruktion kan føre til atomar opløsning 32. I elektron tomografi af forglasset eller traditionelt faste prøver, er et makromolekyle eller sub-cellulær komponent drejet i TEM til efterfølgende tomografisk rekonstruktion 33, med den fordel, at ental genstande kan rekonstrueres; dog på nuværende denne teknik har en opløsning grænse mellem 40 og 20 A 34,35. Blandt alle disse molekylære TEM teknikker, har SPA NS og cryoEM data været den mest udbredteanvendes. Protokollen illustreret her er dedikeret til at opnå cryoEM billeder er egnet til SPA-analyse; alligevel de fleste af protokollen også gælder for cryoEM af 2D krystaller og tomografiske prøver.
En vellykket cryoEM session afhænger af den kombinerede succes mange kritiske skridt; vigtige aspekter at huske på, forklaring af fælles cryoEM artefakter og hvordan man undgår dem, er beskrevet i de følgende afsnit. Dette afsnit beskriver også retningslinjer for dataindsamling for at opnå høj kvalitet 3D-rekonstruktioner ved hjælp af spa-metoden.
Undgå overgang til krystallinsk is. Et centralt aspekt er, at prøven har brug for at bo i glasagtigt tilstand fra det øjeblik af kryo-kaster hele TEM observation. Således efter indstikning prøven i flydende ethan alle efterfølgende trin udføres ved flydende nitrogen (-196 ° C) eller i flydende helium (-269 ° C) temperaturer. Opvarmning til over -135 ° C forvandler glasagtigt vand itil krystallinsk vand; derefter makromolekylære omlejringer kan finde sted og vand krystaller dominerer billedet (figur 3A); prøven skal kasseres. Utilsigtet prøve warm-up kan ske, hvis cryo-fremryk, overførsel af den frosne gitter mellem beholdere (selvom beskyttet af en gridbox), og / eller kryo holder indsættelse i TEM er for langsomme, eller hvis håndtering pincet var tilstrækkeligt præ- afkølet. Betydelig vakuum forværring i TEM ved kryo-overførsel (de kolde prøve fælder varmere indkommende luft) kan også varme op prøven. Endelig kunne over-bestråling af prøven også resultere i overgang til krystallinsk is.
Minimer is forurening. I betragtning af den lille prøvevolumen (3-5 pi) anvendes på TEM nettet, kan fordampning koncentrere bufferkomponenter (salt, rengøringsmidler) og dermed påvirke makromolekylære integritet herunder tab af multimert tilstand. En høj relativ fugtighed (RH) mikromiljø eller kammer omgås dette problem. Alternativt cryo-fremryk kan gøres tilstrækkeligt ventileret miljø kølerum. Efter cryo-kaster RH bør være så lav som muligt for at forhindre is kontaminering eller kondensation af omgivende fugtighed på kryo-nettet, som kryo-grid selv fungerer som en kold fælde. Ice forurening består af partikler med høj kontrast og ingen underkonstruktionen med størrelser på mellem ~ 5 nm og flere mikron, som interfererer med eller helt blokerer billedet. Undgå luft udkast, taler / vejrtrækning mod kryo-grid under luft overførsel, og reducere relativ luftfugtighed. Åbne beholdere med flydende kvælstof med kondensvand (synlige som hvide svævestøv) bør også kasseres.
Maksimer makromolekylære orienteringer / synspunkter. For prøve support, et valg, der skal foretages, er mellem sande vandudtryk net og tynd carbon løbet vandudtryk net. Dette afhænger af (I), hvor prøven breder sig over carbon film versus carbon huller, (ii) tilgængelig prøve koncentration, som bare huller kan kræve en koncentration 100X højere end carbon støtte for en lignende partikel massefylde på billedet (fra ~ 0,02-2 uM), og (iii) hvor tilfældig er fordelingen af makromolekyle orienteringer. Bemærk, at glød udledning, hvilket gør kulstof hydrofile, vil få stor effekt i alle tre aspekter, og at dette vil være prøve-afhængig. Med hensyn til orienteringen af makromolekylet, mens en tilbagevendende visning er ønskeligt for den oprindelige strukturelle bestemmelse ved tilfældig konisk genopbygning, tilfældighed af makromolekylære synspunkter er ønskeligt, når forfine 3D rekonstruktion til højere opløsninger. I vores eksempel, RYR1 interagerer med carbon med en favorit "firdoblet 'visning (figur 2D) og kræver vandudtryk gitre for tilfældighed af orienteringer og højere opløsning 36.
Maksimer SNR. Den bedste strategi for at øge SNR er at reducere baggrunden støjkilder. Overdreven istykkelse og (hvis det findes) kulstof filmtykkelse ud over, hvad der er behov for at støtte og integrere proteinet vil tilføje ekstra støj. Således istykkelsen bør reduceres til det strengt nødvendige ved at styre blotting tid, tryk, RH, og filtrerpapir kvalitet. For carbon support, er en tynd (~ 5 nm) carbon film overtrukket over tykkere holey carbon film: den tykke holey carbon tilvejebringer mekanisk modstand, medens prøven afbildes over tynde carbon-dækket hul. På den anden side, Bemærk, at meget tynde is og / eller carbon kan resultere i en let brudt støtte, der kan blive til en bane (figur 3D). For at maksimere SNR bør unødvendige bufferkomponenter undgås. For membranproteiner, vaskemidlet tager en væsentlig vejafgift på kontrast (se figur 2D, højre panel). Desuden ved at reducere overfladespændingen af detergent ændrer den måde, hvorpå prøven spredes på underlaget. Nogle membranproteiner kræver tilstedeværelse af lipid foruden theergent, hvilket yderligere reducerer kontrasten. For at overvinde dette kan prøven fortyndes i en puffer med lavere detergentkoncentration og uden lipid lige før cryo-kaster 37. Nye alternative rensemidler 16 og anvendelsen af nanodisks 38 at stabilisere det transmembrane domæne komponent synes at være vellykkede metoder til billeddannelse membranproteiner af cryoEM.
Stræb efter billeder af høj kvalitet, og forberede sig til CTF korrektion. Forglasset prøver kræver høje ude af fokus værdier for at generere tilstrækkelig billede (fase) kontrast hvor CTF, den funktion, der vedrører intensiteten til frekvensen, har flere nul overgange, hvorefter der ikke er nogen information. Mens CTF korrektion er ikke nødvendig for lav opløsning 3D-rekonstruktion, når der sigtes for højere opløsning, for at inddrive en nøjagtig gengivelse af 3D-objektet, billeder med forskellige defoci skal indsamles så beregningsmæssige CTF korrektion kan gøres.CTF beslutsomhed og korrektion er inkluderet i de store SPA softwarepakker 4-7; oplysninger kan findes andre steder 39. For optimal CTF korrektion, anvender en række defoci. En god strategi er at skifte blandt 3-4 ude af fokus værdier. Værdierne afhænger af størrelsen af makromolekylet (større størrelser kræver mindre defokusering) is / carbon tykkelse (tyndere prøve kræver mindre defokusering), og spændingen (lavere spænding kræver mindre defokusering). For 200 kV, et godt udgangspunkt række værdier er 2,5, 3, 3,5 og 4 um Defocus. Den CTF manifesterer sig som alternerende ringe af høj og lav intensitet (Thon ringe 40) i den gensidige rum repræsentation, magt spektrum. Visning kraftspektret vil afsløre potentialet for beslutning; frekvensen af den bredeste synlige Thon ring er tættest a priori estimat af opnåelige opløsning. Den effekt frekvenser bør kontrolleres regelmæssigt, og astigmatiske (ikke cirkulære) Thon ringe (figur 3C) skal korrigeres med målsætningen stigmatorelementet. Thon ringe skal være synlige mindst op til den ønskede opløsning.
En cryoEM datasæt opnået ved hjælp af denne protokol kan direkte behandles af SPA for at generere en 3D-rekonstruktion. Selv med en ideel prøve, vil kvaliteten af 3D-rekonstruktion afhænger af ydeevne og specifikationer for TEM udstyr og på billedbehandling. Med de fortsatte forbedringer i begge disse fronter, og med særlig omtale til de nyligt udviklede direkte elektron detektorer, muligheden opnå 3D rekonstruktioner på atomar opløsning mere konsekvent er tættere på end den nogensinde har været.
The authors have nothing to disclose.
We thank the kind donations of AAV5 sample by Mavis Agbandje-McKenna and Antonette Bennett, and of TMV sample by Ruben Diaz. This work is supported by American Heart Association grant 14GRNT19660003 and VCU startup funds to MS.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ethane | Airgas | 371745 | 99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable |
Liquid nitrogen | Airgas | 27135 | 99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs. |
Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers | Ted Pella | 5326 | |
Mica sheets, 1 x 4 cm | Ted Pella | 54 | |
Graphite rods, presharpened size 1/8” dia x 2 ¼” long tip 0.039” dia neck type | Electron Microscopy Sciences | 70220-45 | |
350 ml cryo-dewars | Pope | 8600 | |
Cu 400 mesh holey grids Quantifoil | Quantifoil | Q10525 | |
Cu 400 mesh holey grids C-Flat | Protochips | CF-1.2/1.3-4C | |
Glow discharge device | Electron Microscopy Sciences | Model E7620 | |
Turbo pumping station | Gatan | Model 655 | |
Carbon evaporator | Denton Vaccum | Model 502B | |
Freeze plunger | FEI | Vitrobot Mark IV | |
Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT | http://grigoriefflab.janelia.org/ctf | ||
Image Processing software EMAN | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | ||
Image Processing software Spider | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
Image Processing software Freealign | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | ||
3D visualization software Chimera | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | ||
Native Keyhole Limpet Hemocyanin | Biosyn |