This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.
Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules.
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules.
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.
Målet med cryoEM er å få elektron mikroskopiske bilder av makromolekyler i sitt opprinnelige hydrert tilstand. I kraft av å bygge den makromolekyl i forglassede vann, kan en frossen hydrert prøven innføres direkte og visualisert i TEM instrument. Vitrifikasjon, oppnås ved flash frysing (10.000 o C / sek), fryser prøven uten vann krystallisering og sikrer at molekylære rearrangements under frysepunktet er ubetydelig. Overskuddet av elektron spredning av prøven i forhold til det omgivende buffer tilveiebringer en liten, men tilstrekkelig kontrast for å vise makromolekylet i fravær av en hvilken som helst flekken 1. Datastyrt bildebehandling kan deretter brukes til å gjenskape makromolekylet 3D-struktur. Store makromolekyler i ~ 500 kDa- multi MDA serien er ideelle prøver for cryoEM (som representerer over 80% av Elektronmikrosdatabanken (EMDB) oppføringer); disse inkluderer proteiner, proteinkomplekser, protein-nukleinsyre complexes og membranproteiner innebygd i en bilaget. Disse makromolekyler er mindre sannsynlig å bli krystallisert (med mindre enn 2% oppføringer i PDB databasen), men det er ofte slik at mindre biter løses ved Røntgenkrystallografi eller NMR kan plasseres inn i 3D konvolutt skapt av cryoEM. På den annen side er noen av de største strukturer løses ved cryoEM er identifiserbare innenfor hele cellen ved tynn-seksjonen TEM 2. Dermed cryoEM broer effektivt størrelsen og oppløsningen gap mellom subcellulære og atomstruktur.
CryoEM reflekterer bedre makromolekylet native struktur enn de mer klassiske metode for negativ farging (NS), hvor makromolekylet er dehydrert, og er omgitt av et lag av tungt metall flekken hvorved området for flekken uttrekk gir en sterk kontrast "negativt" bilde 3. I begge tilfeller frembringer elektronstrålen 2D projeksjonsbilder av makromolekyler, kalt partikler, hvor shape avhenger av orienteringen av makromolekylet i forhold til elektronstrålen. Mange partikler, minst ~ 1000 og med ingen øvre grense, kan analyseres på datamaskinen med "single partikkelanalyse" (SPA) programvare for å øke signal til støyforholdet (SNR) selv om gjennomsnitts, og for å finne den partikkel romlige orientering parametere nødvendig for å gjenskape macromolecule 3D struktur etter tilbake projeksjon 4-7. NS, med høyere SNR, brukes for innledende karakterisering prøve og for å generere en de novo 3D rekonstruksjon; dens oppløsning sjelden overstiger 20 Å, som er pålagt av dehydrering og størrelsen av den tunge metallkorn. Generelt, for cryoEM 3D strukturbestemmelse, en lav oppløsning 3D rekonstruksjon oppnås først fra NS og deretter cryoEM blir brukt til å raffinere denne lavoppløselig innledende kart for ytterligere å studere makromolekylet i det opprinnelige hydratiserte tilstand, for å vise dens indre struktur, og for å øke oppløsningen. Ikkete at dersom NS-modellen ble forvrengt (det mest vanlige eksempel flater som følge av dehydratisering 8) og cryoEM partiklene hadde lav SNR, deretter forvrengningen kunne bære inn i cryoEM modell (modell-skjevhet gjenstand, noe som er vanlig i lav SNR datasett 9). Strukturelle forvrengning ville resultere i mismatch mellom NS og cryoEM rå partikler og mellom rå cryoEM partikler og tilsvarende anslag av 3D-modellen ortogonale til utflating retning. Modell skjevhet kan løse seg selv som 3D-modellen gjennomgår påfølgende raffinement sykluser. Bør det ikke forekomme, noe som ville bli oppdaget som manglende samsvar mellom rå cryoEM partikler og tilsvarende anslag fra 3D-modellen, deretter en de novo modell bør være konstruert fra cryoEM data. En god tilnærming kan være å bruke vinkel rekonstituering algoritmen 10, noe som kan gi flere mulige 3D-volumer, og bruke NS 3D-modell deretter å velge den best mulige cryoEM modellsom vil bli ytterligere raffinert 11. En enda bedre strategi er å øke SNR av cryoEM datasettet (se egen seksjon i diskusjon).
Den biokjemiske kvaliteten på den rensede makromolekyl har en ytterst innflytelse i det endelige utfallet. Den makromolekyl, renset fra vev eller uttrykt i heterologe systemer, må ha en høy grad av renhet og å være strukturelt intakt. Det bør heller ikke danner aggregater og bør heller disaggregert. Å definere en spesiell konformasjon, bør prepareringsbetingelsene fremme en ensartet conformational tilstand. Å studere komplekser, er det optimalt at deres k D er i nM rekkevidde, ellers fiksativ har blitt brukt for å stabilisere lavere affinitet interaksjoner 12,13.
Ubearbeidede cryoEM bilder gi verdifull informasjon om dimensjonene, generell oversikt, state of aggregering / multimerization, homogenitet, og interne strukturen i macromolecule. Likevel potensialet av teknikken er vesentlig forbedret med bildebehandling. En 3D-struktur avslører macromolecule samlede arkitektur, 3D plassering av ligander og underenheter, konformasjonsendringer, og gjør det mulig for docking av atomstrukturer bestemmes av x-ray krystallografi eller NMR. Mengden av informasjon av en 3D-rekonstruksjon øker trinnvis som oppløsningen er økt: generelt 15-20 Å oppløsning tillater entydig dokking av atomstrukturer på 9-10 Å alfa-helikser er synlige som stenger, 5 Å er det mulig å skjelne beta ark, og en oppløsning på 3,5 Å og bedre er det mulig å bygge en atommodell 14.
Muligheten for å oppnå informative bilder og en 3D-rekonstruksjon ved bruk av SPA fra relativt små mengder av prøven gjør cryoEM en attraktiv teknikk, som 3-5 ul av minst 0,05 mg / ml er tilstrekkelig for å fremstille en TEM rutenett. Minste instrumentale kravfor cryoEM er en hjemmelaget eller kommersiell cryo-stempelet, et elektronmikroskop med ultra høyt vakuum, bildeopptaksmedier og lavdose kit, en cryo-holder med sin pumpestasjon, en glød utslipp apparat, og en fordamper. Ikke-essensielle, men ytterligere ønskelige funksjoner på TEM er CCD-kamera (til stede i alle moderne TEMs) eller en direkte elektrondetektor, pistol felt utslipp (FEG), energi filtrering, og høy gjennomstrømning datainnsamling programvare. Denne programvaren i prinsippet gjør det mulig å samle titusenvis av partikler i en enkelt sesjon cryoEM 15, men den økte datalagerbehov og påfølgende overvåket etterbehandlingstiden må tas i betraktning. FEG kombinert med kontrast transfer funksjon (CTF) korreksjon ligger til grunn for de fleste 3D rekonstruksjoner som nådde oppløsning tilstrekkelig til å visualisere alfa-helikser. På dette punktet, er nivået for oppløsning også prøve avhengig: når 10 Å oppløsning er mindre vanlig for membran proteiner mens hvishøy rekkefølge av symmetri er til stede da atom oppløsning er mer oppnåelig. Den siste utviklingen av direkte elektron detektorer har aktivert atom oppløsning selv for makromolekyler med lav (4x) eller ingen symmetri, der kvaliteten på cryoEM elektrontetthetskart de matcher disse stammer fra x-ray diffraksjonsdata 16,17.
Praktiske eksempler som illustrerer egenskapene til teknikken er gitt her i fire viktige typer makromolekyler der cryoEM fortsatt har en sjefsrolle i deres strukturelle besluttsomhet. , Strukturer av flere icosahedral virus har blitt løst (i) Med sin icosahedral symmetri som øker datasettet med 60-fold og sin store størrelse som tillater trofast og reproduserbar justering til nær-atom oppløsning av cryoEM fulgt av SPA 18. Vi viser et eksempel på en klasse av icosahedral virus, de adeno-assosierte virus (AAVs), hvor det nær-atomstrukturer med cryoEM og etter cryoEM / x-ray hyBrid metoder finnes 19,20. (Ii) Macromolecules med spiralstruktur inkluderer mikrotubuli, filamenter og virus. Deres repeterende enheter langs den skruelinjeformede aksen kan bli analysert av en mer kompleks versjon av SPA tilpasset den skrueformede geometri 21. I eksempelet viser vi tobakk mosaikkvirus (TMV), en RNA-virus som har blitt løst i atom oppløsning av cryoEM 22. (Iii) Store oppløselige proteiner er blitt rikelig studert. Blant disse makromolekyler som danner symmetriske multimeriske sylindere utgjør et tilbakevendende arkitektur ofte løses ved subnanometer oppløsning 23,24. Her viser vi bilder av KLH, en invertebrate oksygenbærer, hvor en hybrid molekylær modell ble opprettet fra cryoEM / Røntgenkrystallografi hybridmetoder 25. (Iv) Membranproteiner er en viktig klasse av proteiner; de utgjør omtrent 1/3 av proteinene kodet av det humane genom, men de er vanskelige å karakterisere strukturelt grunn av kompleksiteten i forbindelse med transmembrane domene stabilisering 26, som utgjør mindre enn 1,5% av strukturene løses ved en hvilken som helst konstruksjonsteknikk kombinert. Rollen til cryoEM og 3D rekonstruksjon i sin strukturbestemmelse er eksemplifisert med ryanodine reseptor (RyR), en stor eukaryot intracellulær Ca2 + kanal viktig muskelkontraksjon og hjerne-signalering. De høyeste oppløsning cryoEM strukturer til dags dato, med 10 A-oppløsning, avslører sekundærstruktur 27.
TEM fulgt av SPA har bidratt mange makromolekylære 3D-strukturer, nærmer seg 2000 oppføringer i EMDB innen midten av 2014. Generelt for en gitt makromolekyl, er en lav-oppløsning 3D-struktur først bestemmes fra NS data, noe som kan bli etterfulgt av en med høyere oppløsning cryoEM 3D-struktur. Den høye kontrasten i de molekylære grensene gitt av NS, hvilket letter den første 3D-rekonstruksjon, er senere raffineres ved cryoEM med sin evne til å kartlegge den indre strukturen av makromolekylet i sin fullt hydrert tilstand, og muligheten til å oppnå mye høyere oppløsning. En annen fordel med cryoEM er eliminering av dehydrering stress som kan føre til kollaps av makromolekyl. I tillegg er det mulighet for å utelate karbonbærer, som eliminerer mulige overflate absorpsjonseffekter og viser konformasjonen at makromolekylet fatter i oppløsning. Cryo-negativ farging, en kombinasjon av cryoEM og NS, gir høy kontrast i en fullt hydvurdert prøven og kan også føre til 3D-rekonstruksjon ved bruk av SPA, men det har blitt mindre hyppig brukt, med mindre enn 10 EMDB oppføringer, delvis fordi den flekker i seg selv kan påvirke integriteten av makromolekylet 31. To andre TEM teknikker som bidrar til 3D rekonstruksjon er 2D elektron krystallografi og elektron tomografi. 2D elektron krystallografi krever en plan eller rørformet krystall; crystal elektrondiffraksjon brukes for 3D rekonstruksjon som potensielt kan føre til atom oppløsning 32. I elektron tomografi av glassert eller tradisjonelt faste prøver, er et makromolekyl eller sub-cellulær komponent roteres inne i TEM for påfølgende tomografisk rekonstruksjon 33, med den fordel at singulære gjenstander kan rekonstrueres; imidlertid i dag har denne teknikken en oppløsning grense mellom 40 og 20 A 34,35. Blant alle disse molekylære TEM teknikker, har SPA av NS og cryoEM data vært den mestanvendes. Protokollen illustrert her er dedikert til å skaffe cryoEM bilder som egner seg for SPA analyse; Likevel er de fleste av protokollen er også anvendelig til cryoEM av 2D krystaller og tomografiske prøver.
En vellykket cryoEM sesjon avhenger av det kombinerte suksess for mange kritiske trinn; viktige aspekter å huske på, forklaring av felles cryoEM artefakter og hvordan du kan unngå dem er beskrevet i følgende avsnitt. Denne delen beskriver også retningslinjer datainnsamling for å oppnå høykvalitets 3D rekonstruksjoner ved hjelp av SPA-metoden.
Unngå overgang til krystallinsk is. Et sentralt aspekt er at utvalget trenger å bo i glasslegemet tilstand fra det øyeblikk av cryo-stuper hele TEM observasjon. Dermed etter stuper prøven i flytende etan alle etterfølgende trinn utføres ved flytende nitrogen (-196 ° C) eller flytende helium (-269 ° C) temperaturer. Oppvarming til over -135 ° C forvandler glass vann itil krystallinsk vann; deretter makromolekylære omleiringer kan finne sted, og vann krystaller dominerer bildet (figur 3A); prøven skal kastes. Utilsiktet prøven oppvarming kan skje hvis cryo-nedsenking, overføring av den frosne nettet mellom beholderne (selv om det er beskyttet av et gridbox), og / eller cryo holderen innsetting i TEM er for langsom, eller hvis håndterings pinsett var tilstrekkelig pre- avkjølt. Betydelig vakuum forverring i TEM på cryo-overføring (de kalde prøve feller varmere innkommende luft) kan også varme opp prøven. Til slutt, over-bestråling av prøven kan også resultere i overgangen til krystallinsk is.
Minimer is forurensning. Gitt den lille prøvevolum (3-5 mL) brukes på TEM rutenettet, kan fordampning konsentrere bufferkomponenter (salt, vaskemidler) og dermed påvirke makromolekylært integritet inkludert tap av multimert tilstand. En høy relativ luftfuktighet (RH) mikromiljøet eller kammer omgås dette problemet. Alternativt cryo-plunging kan gjøres på en tilstrekkelig ventilert miljø kaldt rom. Etter cryo-stuper RH bør være så lavt som mulig for å hindre at is forurensning, eller kondensering av omgivelsesfuktighet på kryo-gitteret, som kryo-gitteret i seg selv fungerer som en kaldfelle. Ice forurensning består av partikler med høy kontrast og ingen understell med størrelser mellom ~ 5 nm og flere mikrometer som forstyrrer eller helt blokkerer bildet. Unngå luft trekk, snakker / puste mot cryo-grid under luftoverføring, og redusere relativ fuktighet i omgivelsene. Åpne flytende nitrogenbeholdere med kondensvann (synlig som hvite suspenderte partikler) bør også kastes.
Maksimere makromolekyl orienteringer / visninger. For prøven støtte, er et valg som skal gjøres mellom ekte holey nett og tynn karbon i løpet holey nett. Dette avhenger av (i) hvor prøven sprer seg over karbonfilm versus karbon hull, (ii) tilgjengelig prøve concentration, som bare hull kan kreve en konsentrasjon 100 ganger høyere enn karbon støtte for en lignende partikkeltetthet på bildet (fra ~ 0,02 til 2 uM), og (iii) hvor tilfeldig er fordelingen av makromolekylorienteringer. Legg merke til at glødeutladning, som gjør det karbonhydrofile, vil ha en viktig effekt på alle tre sider og at dette vil være prøven avhengig. Når det gjelder retningen på makromolekyl, mens en tilbakevendende syn er ønskelig for den første strukturbestemmelse av tilfeldig konisk gjenoppbygging, er tilfeldigheten av makromolekyl utsikt ønskelig når raffinering 3D rekonstruksjon til høyere oppløsninger. I vårt eksempel, samhandler RyR1 med karbon med en favoritt 'fordoblet' view (figur 2D) og krever holey nett for tilfeldigheten orienteringer og høyere oppløsning 36.
Maksimere SNR. Den beste strategien for å øke SNR er å redusere bakgrunnsstøykilder. Dreven istykkelse og (hvis det finnes) karbon filmtykkelse utover det som er nødvendig for å støtte og legge proteinet vil legge ekstra støy. Således istykkelsen bør reduseres til det nødvendige minimum ved å regulere trekk tid, trykk, RH, og filterpapirkvaliteten. For karbon-støtte, er en tynn (~ 5 nm) karbon film lagvis over tykkere holey karbon film: den tykke holey karbon gir mekanisk motstand mens prøven er avbildet over tynne karbon-dekket hullet. På den annen side, være oppmerksom på at ekstremt tynne is og / eller karbon, kan resultere i en lett ødelagt støtte som kan slå inn i en bane (figur 3D). Å maksimere SNR bør eventuelle unødvendige bufferkomponenter unngås. For membran proteiner, tar vaskemiddel en betydelig toll på kontrast (se figur 2D, høyre panel). I tillegg ved å redusere overflatespenningen endrer vaskemiddel måten prøven sprer seg på bæreren. Noen membranproteiner krever tilstedeværelse av lipid, i tillegg til DETergent, noe som ytterligere reduserer kontrasten. For å overvinne denne prøven kan fortynnes i en buffer med lavere konsentrasjon vaskemiddel og uten lipid like før cryo-stuper 37. Nye alternative vaskemidler 16 og bruken av nanodisks 38 for å stabilisere det transmembrane domene komponent synes å være vellykkede metoder for avbildning membranproteiner fra cryoEM.
Streve for bilder av høy kvalitet og forberede seg CTF korreksjon. Vitrified prøver krever høye defokus verdier for å generere tilstrekkelig bilde (fase) kontrast der CTF, funksjonen som gjelder intensitet til frekvensen, har flere null overganger, og da er det ingen informasjon. Mens CTF korreksjon er ikke nødvendig for lav oppløsning 3D rekonstruksjon, når som mål for høyere oppløsning, for å gjenopprette en nøyaktig gjengivelse av 3D-objektet, bilder med forskjellige defoci må hentes slik at beregnings CTF korreksjon kan gjøres.CTF besluttsomhet og korrigering er inkludert i de store SPA programvarepakker 4-7; detaljer kan finnes andre steder 39. For optimal CTF korreksjon, bruker en rekke defoci. En god strategi er å veksle blant 3-4 Defocus verdier. Verdiene avhenger av størrelsen av makromolekylet (større størrelser krever mindre uskarp), is / karbon tykkelse (tynnere prøven krever mindre uskarp), og den spenning (lavere spenning krever mindre uskarp). For 200 kV, er et godt utgangspunkt rekke verdier 2,5, 3, 3,5 og 4 mikrometer defokus. CTF manifesterer som alternerende ringer av høy og lav intensitet (Thon ringer 40) i den gjensidige plass representasjon, makt spektrum. Vise effektspekteret vil avdekke potensialet for oppløsning; frekvensen til den bredeste synlig Thon ringen er nærmest a priori estimat av den oppnåelige oppløsning. Effektspekteret bør sjekkes med jevne mellomrom, og astigmatic (ikke sirkulært) Thon ringer (figur 3C) bør korrigeres med målet stigmator. Thon ringene skal være synlig i det minste opp til den ønskede oppløsning.
En cryoEM datasett oppnådd ved anvendelse av denne protokollen kan være direkte prosessert av SPA for å generere en 3D-rekonstruksjon. Selv med en ideell prøven, vil kvaliteten på 3D-rekonstruksjon avhenge av ytelse og spesifikasjoner av TEM utstyr, og på bildebehandling. Med kontinuerlige forbedringer i begge disse fronter, og med spesiell omtale til de nyutviklede direkte elektron detektorer, muligheten innhente 3D rekonstruksjoner på atom oppløsning mer konsekvent er nærmere enn det noensinne har vært.
The authors have nothing to disclose.
We thank the kind donations of AAV5 sample by Mavis Agbandje-McKenna and Antonette Bennett, and of TMV sample by Ruben Diaz. This work is supported by American Heart Association grant 14GRNT19660003 and VCU startup funds to MS.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ethane | Airgas | 371745 | 99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable |
Liquid nitrogen | Airgas | 27135 | 99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs. |
Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers | Ted Pella | 5326 | |
Mica sheets, 1 x 4 cm | Ted Pella | 54 | |
Graphite rods, presharpened size 1/8” dia x 2 ¼” long tip 0.039” dia neck type | Electron Microscopy Sciences | 70220-45 | |
350 ml cryo-dewars | Pope | 8600 | |
Cu 400 mesh holey grids Quantifoil | Quantifoil | Q10525 | |
Cu 400 mesh holey grids C-Flat | Protochips | CF-1.2/1.3-4C | |
Glow discharge device | Electron Microscopy Sciences | Model E7620 | |
Turbo pumping station | Gatan | Model 655 | |
Carbon evaporator | Denton Vaccum | Model 502B | |
Freeze plunger | FEI | Vitrobot Mark IV | |
Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT | http://grigoriefflab.janelia.org/ctf | ||
Image Processing software EMAN | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | ||
Image Processing software Spider | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
Image Processing software Freealign | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | ||
3D visualization software Chimera | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | ||
Native Keyhole Limpet Hemocyanin | Biosyn |